一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法

本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法。

背景技术：

1、骨组织不仅提供了身体的结构和支持，还在多种生理过程中发挥关键作用，包括运动及保护内脏器官等。然而，外伤、骨折、感染、肿瘤切除等多种病因均可导致骨缺损，继而导致功能障碍、疼痛、畸形等问题，严重影响患者的生存质量和社会适应能力。因此，促进缺损区域骨再生的临床需求巨大。

2、目前，自体骨移植因无排异反应等优势仍是骨缺损修复的“金标准”。临床上常用的骨移植包括髂骨、肋骨和腓骨等，特别是带血管蒂的骨段移植与缺损区周围血管吻合，为骨段的生长和愈合提供充足的营养。但是自体骨治疗来源及骨塑形受限，难以应用于大范围组织缺损的修复，第二术区的开创易引起感染等并发症限制了其临床应用。新兴的生物活性材料因具有可控的机械强度可以发挥支架作用，可与生长因子或治疗性药物结合应用，能够促进细胞粘附与增殖，诱导细胞外基质分泌，促进新骨形成等优势，已被认为是骨缺损再生很有前景的治疗方式。

3、临床上人工合成植骨材料种类繁多，包括磷酸钙陶瓷、生物玻璃、金属、聚合物等。但上述人工合成植骨材料仍存在生物活性较差、血管化程度低、与机体整合速度慢、成骨性能不足等问题，难以获得满意的临床疗效。归根究底是因为这些材料的仿生度较差，只仿生了骨组织形成过程中的终末产物—成熟骨组织的成分，无法引导缺损部位重构骨组织的微观和宏观结构。

4、解决该瓶颈背后的核心科学问题是如何通过植骨材料以“自下而上”的方式引导骨组织微观和宏观结构的再生。早期阶段的骨形成并非通过磷酸钙晶体的经典成核方式，而是依赖于矿化前体无定形磷酸钙(acp)的参与。acp首先沉积在骨胶原基质的特定区域，随后发生结晶转化，形成矿化的胶原纤维，这一过程是骨组织结构的架构基础，也是“自下而上”骨形成的关键“源头”。但是，acp的非晶态特性导致其储存和应用中易转变为结晶态。骨基质中约有10-15％的非胶原蛋白，这些非胶原蛋白富含谷氨酸和天冬氨酸，后者含有大量羧基，可以通过螯合钙离子以浓度依赖的方式稳定acp。唐睿康(osteoporotic bonerecovery by a highly bone-inductive calcium phosphate polymer-induced liquid-precursor.adv.sci.2019,6(19):1900683；intraosseous injection of calciumphosphate polymer-induced liquid precursor increases bone density andimproves early implant osseointegration in ovariectomizedrats.int.j.nanomedicine.2021,16:6217-6229.)等研究者使用带负电荷的聚阴离子水凝胶，如聚丙烯酸(paa)和聚天冬氨酸(pasp)，负载acp纳米团簇，用于治疗骨缺损或骨质疏松等疾病。动物实验表明，与临床上所用的胶原蛋白仿生骨基质及聚阴离子水凝胶负载ha相比，聚阴离子水凝胶负载acp后显示出更优异的成骨性能。但是，该类水凝胶机械性能较差，植入体内后容易发生形变，无法提供骨缺损修复所需的早期机械支撑。此外，其他研究者(bioinspired silk fibroin mineralization for advanced in vitro boneremodeling models.adv.funct.mater.2022,32,2206992.)还尝试了另一种应用方式，即采用丝纤维蛋白作为支架，额外添加聚阴离子(pasp)稳定无定形磷酸钙，但是高浓度的聚阴离子会对骨组织细胞产生潜在的生物毒性。目前尚缺乏生物安全性好，具有稳定递送acp的支架材料。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料及其制备方法，通过制备具有不同数量和羧基结构的氨基酸水凝胶单体，向氨基酸水凝胶单体中添加无定形磷酸钙后进行自由基聚合，制备出负载无定形磷酸钙的氨基酸水凝胶；具有优异的机械性能和良好的稳定无定形磷酸钙的能力，有利于氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料在骨缺损的修复和再生领域的应用。

2、为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤1：将丙烯酰氨基酸单体粉末溶于双蒸水中，得到1-3mol/l的丙烯酰氨基酸单体溶液；

5、步骤2：将步骤1得到的丙烯酰氨基酸单体溶液与可溶性钙盐溶液进行混合搅拌2-30min，然后逐滴加入磷酸盐溶液持续搅拌2-30min，得到混合溶液a；

6、步骤3：将步骤2得到的混合溶液a与交联剂进行混合搅拌，得到混合溶液b；

7、步骤4：将步骤3得到的混合溶液b与光引发剂进行混合搅拌2-30min，然后在蓝光或紫外光照射下，引发聚合反应，得到氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料。

8、所述步骤1中的丙烯酰氨基酸单体粉末的制备过程如下：

9、步骤1.1：将氨基酸与丙烯酰氯混合进行反应，反应过程中反应溶液的ph值调至7.5-8.5；待反应结束后，将反应溶液的ph值调至10.5-11.5，得到碱性溶液；所述氨基酸与丙烯酰氯的物质的量比为1:(1.0-1.5)；所述氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸；

10、步骤1.2：采用乙酸乙酯对步骤1.1得到的碱性溶液进行洗涤，得到洗涤后的碱性溶液；将洗涤后的碱性溶液的ph值调至1.5-2.5，得到酸性溶液；所述乙酸乙酯和碱性溶液的体积比为1：(2-4)；

11、步骤1.3：采用乙酸乙酯对步骤1.2得到的酸性溶液进行萃取，旋蒸，得到浓缩液；所述乙酸乙酯和酸性溶液的体积比为1：(2-4)；

12、步骤1.4：采用正己烷对步骤1.3得到的浓缩液进行沉降，离心，干燥，得到丙烯酰氨基酸单体粉末；所述正己烷与浓缩液的体积比为1：(5-8)；所述丙烯酰氨基酸单体包括丙烯酰甘氨酸、丙烯酰天冬氨酸或丙烯酰谷氨酸。

13、所述步骤1.1中的氨基酸还可以为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

14、所述步骤1.1中的室温反应时间为3-4h；所述步骤1.3中的旋蒸温度为20℃-30℃；所述步骤1.4中的离心转速为3000-10000rpm，离心时间为2-5min，干燥时间为3-8h，压力为0～-0.1mpa。

15、所述步骤2中丙烯酰氨基酸单体溶液，可溶性钙盐溶液以及磷酸盐溶液的体积比为(20-50)：(5-15)：(2-9)；所述可溶性钙盐溶液的浓度为10-30mmol/l，磷酸盐溶液的浓度为4-18mmol/l。

16、所述步骤2中可溶性钙盐溶液为cacl2，cacl2·2h2o，ca(no3)2或ca(no3)2·4h2o；磷酸盐溶液为na2hpo4，k2hpo4或(nh4)2hpo4。

17、所述步骤3中的混合溶液a与交联剂的体积比为(100-400)：1；所述搅拌时间为2-30min；所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)，所述pegda的平均分子量为250-10000，所述交联剂质量浓度为0.05％-0.2％。

18、所述步骤4中的混合溶液b与光引发剂的体积比为(15-40)：1；光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2959)，2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(1173)或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(lap)，光引发剂的质量浓度为2％-6％，所述交联反应时间为5-30s。

19、本发明还公开了一种氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料，采用一种用于骨缺损再生的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的制备方法制备得到。

20、所述氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料为丙烯酰甘氨酸/无定形磷酸钙复合材料，丙烯酰天冬氨酸/无定形磷酸钙复合材料或丙烯酰谷氨酸/无定形磷酸钙复合材料。

21、相比现有技术，本发明具有以下优点：

22、1.本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的储能模量均大于耗损模量，表明该复合材料的体相更偏向于弹性固体，频率震荡测试并未破坏体相结构，同时在85％的应变下，氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料的压缩强度至少有400kpa，具有优异的力学性能；且氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料内磷酸钙的结晶度低于80％，表明该复合材料作为骨修复材料能够向骨缺损区域稳定递送无定形磷酸钙，实现骨组织再生。

23、2.与现有技术中的高浓度的聚阴离子相比，本发明制备的氨基酸水凝胶单体细胞毒性小，具有优异的生物相容性，利于体内骨形成。

24、3.与现有文献中制备的bnp@cs-gel(其中，cs-gel为甲基丙烯酸化硫酸软骨素和明胶，bnp为黄芩苷)的成骨速率相比，经本发明制备的氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料处理后的新骨形成速度每天可达3-4μm，成骨速率显著提高了。

25、4.本发明通过采用具有不同数量和羧基结构的氨基酸水凝胶单体与无定形磷酸钙进行自由基聚合，制备出负载无定形磷酸钙的氨基酸水凝胶，制备方法简单，原料易得，成本低廉，适合工业化扩大生产。

26、综上所述，本发明制备的实现了氨基酸水凝胶/无定形磷酸钙复合材料具有优异的力学性能和稳定递送无定形磷酸钙的能力，既能够在骨缺损区域中作为支架材料，又能够通过合成的无定形磷酸钙(acp)促进体内骨形成；且具有优异的生物相容性，满足临床上对用于骨缺损再生修复材料的性能要求，在修复不规则骨缺损、促进骨缺损再生中具有很好的应用前景。