一种用于光动力治疗的DNA功能水凝胶及其制备方法和应用

本公开涉及肿瘤光动力治疗材料，尤其涉及一种用于光动力治疗的dna功能水凝胶的制备方法。

背景技术：

1、肿瘤是危害人民生命健康的重大疾病之一，目前主要治疗方法有：手术切除、化学药物治疗、放射治疗等方法。肿瘤的光动力治疗是利用光、光敏剂和氧气，通过光动力反应形成自由基和单线态氧，选择性地杀伤肿瘤细胞，具有微创性、无全身毒性、副作用小、患者生活质量高的优点。目前光动力治疗的多数光敏剂的水溶性不良，妨碍光动力治疗效果。

2、光动力激发光敏剂的光源多采用600nm左右的红光，该光源组织穿透深度有限、难以对深组织处的肿瘤光敏剂进行激发进行光动力肿瘤治疗。

3、光动力肿瘤疗法在直接杀死肿瘤细胞，诱导免疫原性细胞死亡，作为肿瘤疫苗引起一系列免疫级联反应，开启肿瘤免疫治疗。然而肿瘤微环境存在免疫抑制机制，妨碍光动力免疫治疗表现。免疫抑制肿瘤微环境，由免疫抑制的免疫细胞构成，通过分泌免疫抑制因子，例如吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)，来抑制热肿瘤自然杀伤(nk)细胞和t细胞的细胞毒性功能。因此引入ido抑制剂，可以靶调节免疫抑制肿瘤微环境，可以增强光动力联合免疫疗法的抗肿瘤效果。

4、水凝胶材料具有可注射性，易于装载功能单元，在疾病治疗中可适应复杂的局部环境。而由dna形成的功能材料，不仅由于其序列可编程性易于形成功能单元，如发卡结构、适配体、g四链体等；还由于其特定的双螺旋结构，整体带有负电性，从而可以利用静电吸引和配位作用装载功能单元。良好的生物相容性和稳定的结构也促使dna功能材料的进一步应用。因此dna水凝胶的功能可以更加多样、作用更加精准。

技术实现思路

1、本公开提供了一种用于光动力治疗的dna功能水凝胶及其制备方法和应用，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

2、根据本公开的第一方面，提供了一种用于光动力治疗的dna功能水凝胶，所述dna功能水凝胶由第一长单链dna混合物和第二长单链dna混合物以体积比为1：1～1：2混合得到；

3、其中，所述第一长单链dna混合物包括第一长单链dna溶液、kcl溶液和sipccl2溶液，第一长链dna混合物中kcl的浓度为140mmol/l，sipccl2的浓度为0.2mmol/l；

4、第二长单链dna混合物是先由第二长单链dna溶液和储能长余辉颗粒溶液混合后使储能长余辉颗粒浓度为1mg/ml；再加入免疫佐剂1mt得到，第二长单链dna混合物中免疫佐剂1mt的浓度为1.5mg/ml。

5、在一可实施方式中，第一长单链dna溶液的组成至少包括，50nmol/l的第一环状dna模板、1mmol/l的dntps、0.2mg/ml的牛血清白蛋白和200u/ml的phi29聚合酶；

6、第二长单链dna溶液的组成至少包括，50nmol/l的第二环状dna模板、1mmol/l的dntps、0.2mg/ml的牛血清白蛋白和200u/ml的phi29聚合酶。

7、在一可实施方式中，所述储能长余辉颗粒为经过储能和二氧化锰修饰后的长余辉颗粒(plnp)，长余辉颗粒包括：铬掺杂镓酸盐长余辉颗粒(znga2o4:cr)、铬掺杂镓锗酸盐长余辉颗粒(zngageo4:cr)、铬掺杂铝酸盐长余辉颗粒(znal2o4:cr)和铬掺杂铝锗酸盐储能长余辉颗粒(znalgeo4:cr)中的一种。

8、根据本公开的第二方面，提供了一种用于光动力治疗的dna功能水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

9、步骤1)，包括步骤1-1)：在第一长单链dna溶液中加入kcl溶液和sipccl2溶液，混合均匀，得到第一长单链dna混合物；其中kcl的浓度为140mmol/l，sipccl2的浓度为0.2mmol/l；

10、步骤1-2)：在第二长单链dna溶液中加入储能长余辉颗粒溶液使储能长余辉颗粒的浓度为1mg/ml；然后再加入免疫佐剂1mt，使免疫佐剂1mt的浓度为1.5mg/ml，得到第二长单链dna混合物；

11、步骤2)：分别将第一长单链dna混合物和第二长单链dna混合物在75℃下孵育10～15min灭活后，立即将二者按照1：1～1：2体积混合、震荡，得到所述dna功能水凝胶。

12、在一可实施方式中，步骤1-1)中，第一长单链dna溶液、kcl溶液和sipccl2溶液是在37℃、450rpm的恒温混均仪中孵育30min，得到所述第一长单链dna混合物。

13、在一可实施方式中，所述步骤1-1)中，所述第一长单链dna溶液由第一环状dna模板、dntps、牛血清白蛋白和phi29聚合酶混合均匀后，于37℃、450rpm下孵育4h得到；

14、其中，第一长单链dna溶液中，第一环状dna模板的浓度为50nmol/l，dntps的浓度为1mmol/l，牛血清白蛋白的浓度为0.2mg/ml，phi29聚合酶的浓度为200u/ml。

15、在一可实施方式中，所述第一环状dna模板是利用第一dna线性模板和第一引物通过环化pcr得到，其中第一dna线性模板序列为：template-1:/phosphate/ctacaacgaagtctcgtgatgtccagcttgcagtac acttccaccaccaccacaaccaccaccaccagtgttatcgtcgaaccgtg

16、第一引物序列为：primer-1:acgagacttcgttgtagcacggttcgac。

17、在一可实施方式中，所述第一环状dna模板的制备包括如下步骤：首先，用移液枪分别吸取超纯水、nacl溶液、第一dna线性模板、第一引物于pcr管中，而后用移液枪吹吸混合均匀，得到第一反应体系，其中第一反应体系中，nacl的浓度为800mm，第一dna线性模板浓度为100μm，第一引物浓度为100μm；

18、其次，将承装有第一反应体系的pcr管放入pcr仪中反应2h；

19、再次，反应结束后，向第一反应体系中加入t4 dna连接酶、以及对应体积的t4 dna连接酶缓冲液和超纯水，混匀后，在16℃下孵育16～20h；

20、最后，在65℃金属浴孵育10-15min灭活t4dna连接酶，最终得到所述第一环状dna模板。

21、在一可实施方式中，所述步骤1-2)中，所述第二长单链dna溶液由第二环状dna模板、dntps、牛血清白蛋白和phi29聚合酶混合均匀后，于37℃、450rpm下孵育4h得到；

22、其中，所述第二长单链dna溶液中，第二环状dna模板的浓度为50nmol/l，dntps的浓度为1mmol/l，牛血清白蛋白的浓度为0.2mg/l，phi29聚合酶的浓度为200u/ml。

23、在一可实施方式中，所述第二环状dna模板是利用第二dna线性模板和第二引物通过环化pcr得到，其中,第二dna线性模板序列为:

24、template-2:/phosphate/tcacgagacttcgttgtagcactggtggcaccgtct cacaggtgtagtgggagcaccgtactctggatagtactgcaagctggac a；

25、第二引物序列为：primer-2:acaacgaagtctcgtga tgtccagcttg。

26、在一可实施方式中，所述第二环状dna模板的制备包括如下步骤：首先，用移液枪分别吸取超纯水、nacl溶液、第二dna线性模版、第二引物于pcr管中，而后移液枪吹吸混合均匀，得到第二反应体系，其中第二反应体系中，nacl的浓度为800mmol/l，第二dna线性模板浓度为100μm，第二引物浓度为100μm；

27、其次，将承装有第二反应体系的pcr管放入pcr仪中反应2h；

28、再次，反应结束后，向第二反应体系中加入t4 dna连接酶、以及对应体积的t4 dna连接酶缓冲液和超纯水，混匀后，在16℃下孵育16～20h；

29、最后，在65℃金属浴孵育10-15min灭活t4dna连接酶，最终得到所述第二环状dna模板。

30、在一可实施方式中，所述步骤1-2)中储能长余辉颗粒溶液为长余辉颗粒经过储能和二氧化锰修饰得到的储能长余辉颗粒s-plnp@mno2水溶液；具体通过如下方法制备：

31、首先，用aptes或pei对长余辉纳米颗粒plnp进行修饰，得到氨基修饰的长余辉纳米颗粒plnp-nh2，而后分散于超纯水中，得到氨基修饰的长余辉纳米颗粒plnp-nh2溶液并将其于254nm紫外光下照射20-30min进行能量储存；

32、然后，在超声波下逐滴滴加高锰酸钾kmno4溶液，继续超声10-15min，长余辉纳米颗粒表面发生氧化还原反应形成二氧化锰壳层，即获得s-plnp@mno2；

33、最后，于8000-12000rpm离心3-5min、洗涤多次，分别得到储能长余辉颗粒s-plnp@mno2沉淀，而后将沉淀分别分散于超纯水中，得到储能长余辉颗粒s-plnp@mno2水溶液。

34、在一可实施方式中，氨基修饰的长余辉纳米颗粒plnp-nh2通过如下方法制备：首先，将长余辉纳米颗粒plnp和dmf混合，超声，使plnp粉末在dmf中溶解分散均匀后，在超声的同时加入氨水，超声10min；其中plnp粉末与dmf的质量体积比为200mg:100ml；

35、其次，在25℃、搅拌过程中加入aptes或pei，持续搅拌12～16h，搅拌速度为800rpm；

36、最后，反应结束后，在8000～12000rpm离心5-10min后收集沉淀，用dmf清洗多次、无水乙醇清洗多次、真空干燥得到氨基修饰的长余辉纳米颗粒plnp-nh2粉末。

37、在一可实施方式中，所述长余辉纳米颗粒plnp由如下方法制备：首先，以体积比计，一边搅拌一边加入25％～30％超纯水、20％～25％氨水、4％～5％cr(no3)3水溶液、8～12％geo2-稀氨水混合液、30％～40％ga(no3)3水溶液，混合均匀得到第三反应体系；

38、其次，将第三反应体系用氨水调节ph值至8.0，25℃持续搅拌至少4h；

39、再次，将第三反应体系于高压反应釜中，170～200℃下反应24～30h；

40、最后，反应完成后将产物自然冷却，于8000～12000rpm离心5～8min，收集沉淀，然后用无水乙醇重悬，清洗沉淀，再次于8000～12000rpm离心5～8min，收集沉淀，重复操作多次，然后将沉淀真空干燥，得到长余辉纳米颗粒plnp粉末。

41、在一可实施方式中，氨水中的有效成分浓度为0.5mol/l，cr(no3)3水溶液中cr(no3)3的浓度为0.02mol/l，geo2-稀氨水混合液是由geo2溶解于稀氨水中得到，geo2-稀氨水混合液中的geo2浓度为0.1mol/l，ga(no3)3水溶液中ga(no3)3的浓度为0.5mol/l。

42、根据本公开的第三方面，提供了一种用于光动力治疗的dna功能水凝胶在制备光动力治疗肿瘤药物中的应用。

43、与现有技术相比，本技术的优点在于：1)本发明借助设计合成的dna水凝胶将纳米长余辉材料(plnp)、光敏剂二氯硅酞菁(sipccl2)和免疫佐剂1mt共同负载到一个材料体系中。

44、本技术的dna功能水凝胶除了具有传统水凝胶的可注射性，可适应复杂的局部环境外，功能更加多样、作用更加精准、良好的生物安全性和生物相容性。与单一的光动力治疗或者免疫治疗相比，本技术中的dna功能水凝胶作用于肿瘤部位后，肿瘤微环境过量的过氧化氢和储能长余辉表面的二氧化锰反应，生产氧气改善乏氧的同时释放所储的光能激发光敏剂，生成单线态氧开启光动力治疗直接杀死癌细胞，造成免疫原性死亡。

45、2)免疫佐剂1mt抑制内源性免疫抑制剂的表达，增强免疫治疗。实现无激发光的光动力治疗和免疫治疗的联合治疗，增强治疗效果。

46、3)本发明的方法构建的dna功能水凝胶具有非常好的生物相容性，具有良好的空隙空间结构，具有优异的载药性能，可在肿瘤原位起到很好的光动力和免疫联合治疗。

47、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。