背景技术：
：：技术实现思路1、根据本发明，提供了一种制剂，其包含双歧杆菌(bifidobacterium)的分离菌株ncimb 41676和双歧杆菌的分离菌株ncimb 41003。2、所述双歧杆菌菌株中的至少一种可以为活细胞形式。3、所述双歧杆菌菌株中的至少一种可以为非活细胞形式。4、在一些情况下，双歧杆菌菌株ncimb 41676在该制剂中的存在量大于106cfu。双歧杆菌菌株ncimb 41676在该制剂中的存在量可为约5×108cfu。5、双歧杆菌菌株ncimb 41676在该制剂中的存在量可大于106cfu，通常为107至1010cfu，通常为108至109cfu。在一种情况下，双歧杆菌菌株ncimb 41676在该制剂中的存在量为约1×109cfu。6、在一些情况下，双歧杆菌菌株ncimb 41003在该制剂中的存在量大于106cfu。双歧杆菌菌株ncimb 41003在该制剂中的存在量可为约5×108cfu。7、双歧杆菌菌株ncimb 41003在该制剂中的存在量可大于106cfu，通常为107至1010cfu，通常为108至109cfu。在一种情况下，双歧杆菌菌株ncimb 41003在该制剂中的存在量为约1×109cfu。8、细菌活力反映了样品中可培养细菌的数量，即在最佳条件下生长时保留繁殖能力的细菌(活细胞)数量。换言之，活力反映了保留复制为更大细菌菌落(菌落形成单位(cfu))的能力的个体细菌细胞的数量。9、通常使用平板计数方法测定活力，将细菌样品稀释，然后在含有生长所需营养物的琼脂平板上培养。然后由板上鉴定的细菌菌落数计算活力。此类方法概述于modern foodbiology 2005 7th edition,james monroe jay,martin j.loessner,david a.golden,springer science,new york。10、尽管平板计数给出了活力的良好指示，但其并不包括样品中的所有活细菌细胞。(kell,douglas b.,et al.1998)。11、样品还将含有“存活但不可培养的”(vbnc)细胞，这些细胞保留代谢活性，但在通过平板计数进行分析时已丧失了复制能力，因此尽管是活的，但不会形成cfu。最后，样品还将含有死细胞。这两组可一起归为“非活细胞”。因此，非活细胞与活细胞相反，即，所有那些在测试时已丧失复制能力的细胞。12、所有含有活细胞的样品也将含有非活细胞，因此使用cfu测量明确了活细胞培养的定义。13、所有非活样品将含有至少vbnc细胞以及可能的少量的活细胞。103cfu/g活细胞的工业标准低水平检测极限允许由在非活样品中一定数量的vbnc细胞/活细胞的存在所造成的固有过程可变性(inherent process variability)。14、在一些实施方案中，诸如但不限于特殊的无菌食品或药物，益生菌菌株的非复制形式可能是优选的。例如，至少95％、优选至少97％、更优选至少99％的双歧杆菌菌株在组合物中可以是非复制的。15、该制剂可为细菌肉汤的形式或冻干粉末的形式。在一些情况下，该制剂还包含益生元物质(prebiotic material)。16、在一些情况下，该制剂还包含可摄取的载体。17、该可摄取的载体可为药学上可接受的载体诸如胶囊、片剂或粉剂。18、该可摄取的载体可为食品诸如酸化乳、酸乳酪、冷冻食物诸如冷冻酸乳酪或冰淇淋、口香糖(gum)、糖果、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪(cheese spread)、营养组合物(nutritional composition)、营养补充剂、谷物棒、调味品(dressing)或饮料。19、在一种情况下，该制剂为婴儿食物。20、一些情况下，该制剂为发酵食品或发酵乳产品的形式。21、在一些情况下，载体不是天然存在的。22、该制剂可包含蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素。23、该制剂可包含佐剂。24、该制剂可包含细菌组分。25、该制剂可包含药物实体。26、该制剂可包含生物混合物。27、还提供了包含本发明的制剂的食物。28、还提供了包含本发明的制剂的药物。29、本发明还提供了双歧杆菌分离菌株ncimb 41676与双歧杆菌分离菌株ncimb41003的组合在预防或治疗肠易激综合征(ibs)中的用途。30、该组合可：31、改变与ibs相关的肠病症；32、改善与ibs相关的情绪；33、减轻与ibs相关的应激；34、减轻与ibs相关的焦虑；35、改善与ibs相关的睡眠质量；36、治疗与ibs相关的抑郁；和/或37、使与ibs相关的失调的皮质醇觉醒反应(cortisol awakening response)正常化。38、该用途可包含施用本发明的制剂。39、还提供了一种组合产品，其包含双歧杆菌分离菌株ncimb 41676和双歧杆菌分离菌株ncimb 41003，其用于预防或治疗肠易激综合征(ibs)。本文描述了该组合产品。40、通过改善与ibs相关的胃肠道病症以及使与ibs相关的失调的皮质醇觉醒反应正常化，该组合产品可用于预防或治疗肠易激综合征(ibs)。41、我们出乎意料地发现，含有细菌菌株长双歧杆菌(b.longum)(ncimb41003)和长双歧杆菌1714tm(ncimb 41676)的组合产品甚至在喂食停止后仍可产生令人惊讶的、持续的、积极的效果。42、ibs具有涉及其病理生理学的许多元素。胃肠道病症和抑郁/焦虑病症是合并，并伴有已知会影响这两种病症的潜在轻度炎症(enck et al.2016)。由于尚无现有技术可充分解决这些其它合并病症，所以期望解决所有这些因素将有益地解决ibs的所有方面。43、创造含有35624菌株的组合产品并非易事。35624是一种敏感菌株，且在其他菌株的存在下不容易生长或不能耐受。在包括1714tm菌株和dpc6315的pbmc测定中评估了15种不同的长双歧杆菌的细胞因子谱(实施例6)。选择1714和dpc6315菌株作进一步研究，因为：44、·dpc6315具有最高的il-10/il-12抗炎比值，并且包括抑郁和焦虑在内的情绪变化可与炎症相关联。45、·1714已证明了体外的抗炎细胞因子谱(anti-inflammatory cytokineprofile)和同时在动物和人类试验中的对情绪的积极效果。46、在生长实验(实施例5)中显示35624均耐受1714和dpc6315。47、当35624和1714的组合被人ibs队列(cohort)食用时，产生了出人意料的效果，该组合不仅解决了ibs胃肠道病症，其还解决了ibs的肠-脑方面病症，而且出乎意料地观察到新的协同作用(实施例1-4)。在喂食期间，ibs病症改善，且失调的皮质醇觉醒反应(car)正常化，但这些效果在喂食后消失。出人意料的是，甚至在喂食停止后也观察到抗焦虑作用的持续和抑郁、睡眠质量的改善，以及促炎细胞因子tnf-α的减少。当单独喂食35624菌株时，未观察到喂食后tnf-α减少(改善的抗炎作用)的持续(图11)。48、我们进一步在体外评估了长双歧杆菌dpc6315和35624的组合(实施例6)。与35624和1714类似，该组合维持其高il-10信号。我们在通常用于筛选抗炎物质的成熟动物模型中研究了dpc6315和35624的组合(实施例7)。该组合未见协同作用，并且非常出人意料的是，6315的存在消除了35624的作用，并且该组合比单独的单一菌株35624更差。因此，即使从已建立的体外免疫谱测试中，也不能很明显地看出长双歧杆菌菌株的每种组合都能工作，因此尚不可能提前预测35624/1714组合试验的结果。49、对睡眠的影响尤为重要。在生命的任何阶段都观察到睡眠障碍。这些障碍的特征通常在于开始和维持睡眠的能力降低，以及在于更深、更恢复性的睡眠比例降低。在患有这些改变的个体中生活质量被显著损害。50、婴儿睡眠通常在生命的最初几个月内发生变化，以遵循昼夜节律(diurnalrhythm)，具有在夜间持续长期不间断的时段的睡眠，并且类似地，睡眠状态从出生时的rem(活跃)和nrem(安静)的平均分布变化为8个月大时的三分之一rem和三分之二nrem。未能成功协调婴儿期的这些变化的任何失败还可能对孩子的睡眠模式产生持久性影响。51、在婴儿和儿童中最常见的睡眠障碍是与觉醒有关的睡眠障碍(即，在就寝时间难以安顿下来或无法整晚无间断地睡眠)。据估计，这些障碍影响小于24个月的婴儿的15至35％。婴儿和儿童的睡眠障碍不可避免地导致父母的睡眠障碍和应激，这可能导致儿童-父母互动的不足，进而反过来加剧了婴儿和儿童的病症，导致恶性循环。52、在生命的另一端，正常的衰老也伴随着睡眠质量、数量和结构的变化。特别是，似乎健康老年人开始和维持睡眠的能力有可测量的下降，伴有更深、更恢复性的nrem睡眠比例的下降。53、睡眠对于老年人尤其重要。随着年龄的增长，身体会发生变化，睡眠模式的变化是正常衰老过程的一部分。随着年龄的增长，人们倾向于比年轻时更难以入睡，且更难维持睡眠。一种普遍的误解是，睡眠需求随着年龄增长而下降。实际上，研究表明，睡眠需求在整个成年期保持不变。随着我们年龄的增长，我们的睡眠模式，“睡眠结构”，发生改变，并且其可能导致睡眠问题。睡眠有多个阶段，包括浅睡眠和深睡眠的无梦时段，以及偶尔的活跃做梦(rem睡眠)时段。睡眠周期在夜间重复若干次，并且尽管总睡眠时间趋于保持恒定，但老年人在较轻的睡眠阶段比在深度睡眠中花费更多的时间。54、许多老年人，尽管当然不是全部，也报告对睡眠的满意度较低，而白天更疲倦。对美国老年人的睡眠习惯的研究表明，随着年龄的增长，入睡时间(睡眠潜伏期)增加，rem睡眠的总体下降，并且睡眠片段化(夜间醒来)增加。睡眠障碍的患病率也倾向于随年龄增加。研究表明，老年人睡眠障碍可以部分归因于身体和精神的疾病以及用于治疗这些疾病的药物。55、除了随着年龄增长而发生的睡眠结构的变化之外，影响睡眠的其它因素是协调身体功能(包括睡眠)时机(timing)的昼夜节律(circadian rhythm)。例如，与年轻的成人相比，年老的人倾向于在傍晚更容易犯困而在早晨醒来更早。这种模式称为睡眠期提前综合征(advanced sleep phase syndrome)。睡眠节律向前偏移，使得尽管依然获得7或8小时的睡眠，但是由于这些人入睡非常早，所以它们将非常早地醒来。这些睡眠和昼夜节律随年龄增长变化的原因尚不清楚。56、环境应激源也是一个问题。遭受应激会对睡眠和睡眠/觉醒周期产生消极影响。例如，经历社会支持低的工作相关应激源或遭受创伤/战斗，都会破坏睡眠和睡眠/觉醒周期。57、睡眠医学的临床试验涵盖了广泛的睡眠-觉醒问题，因此睡眠医学临床试验中结果量度的选择需要针对所检查的特定障碍进行调整。研究者需要考虑选择自我报告问卷或生理测试的相对优点。出人意料的是，与更昂贵的生理测试相比，自我报告测量(self-report measures)通常对治疗效果更为灵敏。58、在一些情况下，组合产品可在适于由伴侣动物(诸如狗或猫)摄取的制剂中使用。一种这样的制剂为干宠物食物，其可包括碳水化合物源、蛋白质源和脂质源中的任何一种或多种。59、附图简述60、参考附图，通过仅作为示例给出的以下描述，将更清楚地理解本发明，其中：-61、图1为开放性组合ibs研究原理的示意图；62、图2为ibs患者在组合治疗之前和之后的ibs病症严重度量表(ibs symptomseverity scale，ibs-sss)的图；63、图3(a)至(e)为ibs患者在组合治疗之前和之后的ibs-sss个体病症(腹痛(a)不适和(b)频次、(c)腹胀、(d)肠满意度和(e)ibs生活质量)的一组图；64、图4(a)至(c)为ibs患者(便秘型(a)、混合型(b)以及腹泻型(c))在组合治疗之前和之后的ibs病症严重度量表(ibs-sss)的一组图；65、图5(a)至(c)为ibs患者((a)中度至重度、(b)中度和(c)重度)在组合治疗之前和之后的ibs病症严重度量表(ibs-sss)的一组图；66、图6(a)和(b)为在组合治疗之前和之后ibs患者的(a)hads抑郁和(b)hads焦虑得分的图；67、图7(a)和(b)为(a)ibs病症严重度量表与hads抑郁之间的相关性的图和(b)ibs病症严重度量表与hads焦虑之间的相关性的图；68、图8(a)和(b)为与组合治疗之前和之后相比，ibs患者在单独使用bif35624之前和之后hads抑郁降低百分比的条形图；69、图9(a)和(b)为与组合治疗之前和之后相比，ibs患者在单独使用bif35624之前和之后hads焦虑和抑郁得分下降百分比的条形图；70、图10(a)和(b)为健康与ibs患者以及ibs患者在组合治疗之前和之后的血浆tnf水平的图；71、图11为ibs患者在bif35624治疗之前和之后的血浆tnf水平的图；72、图12为ibs患者(a)和ibs患者(psqi大于5)(b)在组合治疗之前和之后的psqi总分的图；73、图13为ibs患者(a)和ibs患者(psqi大于5)(b)在组合治疗之前和之后的主观睡眠潜伏期的图；74、图14为ibs患者在组合治疗之前和之后的主观睡眠质量的图(a)和表(b)；75、图15为ibs患者(psqi大于5)在组合治疗之前和之后的主观睡眠质量的图(a)和表(b)；76、图16为健康对照与ibs患者的唾液皮质醇(auci)的条形图；77、图17为ibs患者(中度至重度)在组合治疗之前和之后唾液皮质醇(auci)的图；78、图18(a)和(b)为35624单独或35624与1714或dpc6315组合的过夜培养的图表；79、图19为体外用bif35624、ah1714和dpc6315刺激的pbmc的il-10/il-12比值的图；80、图20为体外用bif35624或dpc6315或两者的组合刺激的pbmc的il-10水平的条形图；81、图21(a)和(b)为喂食bif35624、dpc6315或两者的组合后临床关节炎得分-所有爪(得分0-5)的图；以及82、图22为在喂食bif35624、dpc6315或两者的组合后随时间变化的发生率百分比图。83、发明详述84、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)菌株ucc35624于1999年1月13日保藏于national collections of industrial and marine bacteria limited(ncimb)fergusonbuilding,craibstone estate,bucksburn,aberdeen,ab21 9ya,scotland,uk，且保藏号为ncimb 41003。85、长双歧杆菌菌株ucc35624从切除并洗涤的人胃肠道中分离得到。该菌株描述于wo00/42168a中，其全部内容通过引用并入本文。86、已对长双歧杆菌菌株进行了广泛研究，并证明在两项对照良好的临床研究的ibs受试者中其可调节炎症反应(groeger et al.,2013，konieczna et al.,2012)，并减少腹痛、腹胀、胀气和不可预测的肠排便习惯(o’mahony et al.,2005，whorwell et al.,2006)。87、长双歧杆菌菌株ah1714于2009年11月5日保藏于national collections ofindustrial and marine bacteria limited(ncimb)ferguson building,craibstoneestate,bucksburn,aberdeen,ab21 9ya,scotland,uk，且保藏号为ncimb 41676。88、长双歧杆菌菌株ah1714从健康人受试者的结肠活检组织中分离得到。该菌株描述于wo2011/058535a中，其全部内容通过引用并入本文。89、在临床前和临床研究中已表明，长双歧杆菌1714tm菌株可减弱焦虑和应激并改善认知(allen et al.,2016，savignac et al.,2014，savignac et al.,2015)。90、实施例91、以下实施例进一步描述和说明本发明范围内的实施方案。给出这些实例仅仅是为了说明而不应被解释为对本发明的限制，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行许多变化。92、制剂93、菌株可以单一制剂的形式施用，这对于确保患者依从性是优选的。然而，在一些情况下，菌株可在相同或不同的时间施用并使用相同或不同的施用途径。94、菌株可以任何合适的量施用以实现期望的结果。在一些情况下，施用相同量的菌株。95、优选地，菌株各自以至少106cfu每天每菌株的剂量施用，优选以5×108cfu至1×109cfu每天每菌株的目标剂量施用。96、菌株为冻干粉末形式，其与食品级赋形剂混合，并填充成诸如小袋或胶囊形式。97、制备了一种冻干粉末，其包含5×108cfu长双歧杆菌35624和1×109cfu长双歧杆菌1714。菌株在de man,rogosa and sharpe培养基中发酵(根据基本原则(from firstprinciples))。将各菌株离心后收集的颗粒洗涤并随后冷冻干燥。98、实施例1—开放性(open label)肠易激综合征(ibs)研究：长双歧杆菌组合产品显示了成人ibs病症的减轻(combo)99、进行如下人体试验，以研究长双歧杆菌35624和长双歧杆菌1714的组合对成人肠易激综合征(ibs)的肠病症的效果。这项工作由开放性研究组成。肠病症使用自我报告法来测量，诸如包含疼痛、腹胀、肠功能障碍和生活质量(总体健康)的ibs病症严重度量表(ibs-sss)。ibs-sss被认为能够可靠地对先前分类为轻度、中度或重度的患者进行评分。最大可得分为500分。用分别为75至175分、175至300分和超过300分指示患者(轻度、中度和重度病例)更同质组的招募。得分低于75的对照和得分在该范围内的患者也可以缓解。已将≥50的ibs-sss定义为病症严重度的临床显著变化(francis et al.,1997)。在帮助满足ibs提出的许多挑战方面，该量表提供了有价值的工具。100、本试验的临床方案如下：101、招募40名年龄为18-55岁的女性受试者，其患有根据rome iii标准诊断的ibs和根据医院焦虑和抑郁量表(hospital anxiety and depression scale，hads)确定的轻度至中度焦虑和/或抑郁。排除了在过去6个月内具有除焦虑或抑郁以外的精神病诊断、主要炎症性疾病或正在服用抗抑郁药、抗焦虑药或抗精神病药的受试者。102、对通过ibs-sss量表测量的ibs病症的组合试验的结果103、ibs病症通过ibs病症严重度量表(ibs-sss)进行评估。这是一项开放性研究，使用了5×108cfu长双歧杆菌35624和1×09cfu长双歧杆菌1714(combo)的冻干粉，持续8周，然后进行8周洗脱(图1)。在第0、4、8、12和16周测量ibs-sss。104、从基线到干预结束(8周)，组合组ibs-sss得分显著提高，平均值±sd为100±112.5。然而，一旦喂食停止，ibs-sss再次停止改善，直到第16周(喂食后8周)，与基线相比仅有35±97的改善。临床上重要的差异被描述为ibs-sss的变化≥50(图2)。当我们分析了构成ibs-sss得分的所有个体病症时，组合治疗改善了所有病症，包括腹痛不适、腹痛频率、腹胀、肠满意度和ibs生活质量，对于所有益生菌而言，结果并不相同(图3(a)-(e))。该组合产品有益于ibs患者的所有亚型，包括便秘型、腹泻型和混合型患者(图4(a)-(c))。该组合产品在喂食时甚至会影响最严重的患者，但是一旦不再食用该组合，病症就会开始复现(图5(a)-(c))。105、正常随机双盲安慰剂对照研究是临床医学中的最新技术，但是使用开放性研究，我们能够提供关于估计延滞效应(carryover effect)有价值的信息，确定洗脱期，提供关于受试者特征和所测参数的变化的可靠数据，以及显示该组合产品的治疗潜力。106、对通过had量表测量的ibs病症的组合试验的结果107、在组合试验中，我们使用经过验证的问卷，被称为医院焦虑和抑郁量表(hads)在0、4、8、12和16周时测量焦虑和抑郁。我们发现长双歧杆菌35624与长双歧杆菌1714组合在ibs中对减轻ibs受试者的抑郁和焦虑病症非常有效。从基线到干预结束(8周)，组合组的hads抑郁得分显著改善，平均值±sd为-1.6±3.122。出人意料的是，一旦喂食停止，hads抑郁得分在第12周进一步改善(-2.0±2.63；平均值±sd)，且在16周保持这种改善效果(-1.75±3.386；平均值±sd)(喂食后8周)(图6(a))。从基线到干预结束(8周)，组合组的hads焦虑得分显著改善，平均值±sd为-1.375±3.012。出人意料的是，一旦喂食停止，hads焦虑得分在第12周也进一步改善(-2.275±3.637；平均值±sd)，且在16周保持这种改善效果(-2.3±2.98；平均值±sd)，其为参与者停止服用该组合产品8周后(图6(b))。已将临床上重要的差异描述为hads改善≥2。108、在组合研究中，ibs患者的hads得分与病症严重度得分之间在基线处无相关性ibs是一种肠-脑障碍。众所众知，焦虑、抑郁是ibs患者常见的合并症。然而，对这些合并症的确切性质及其在ibs中的关联性知之甚少。目的是在伴有焦虑和抑郁情绪增加的ibs组中表征ibs与这些精神病合并症之间的关系，以观察这些是依赖的还是独立的辅助因子。利用组合研究的基线结果对其进行评估，如实施例1中所述。109、ibs-sss得分中位数为250(iqr：190-315)，而hads焦虑得分和hads抑郁得分分别为10.43±2.3和5.48±3.69。在40名受试者中，分别有95％和45％具有>8的hads焦虑或hads抑郁得分，而38％同时具有>8的hads焦虑和hads抑郁得分。ibs-sss与hads抑郁和hads焦虑得分的相关性分析显示与hads抑郁得分有弱相关性(r2＝0.3246；p＝0.001)，而与hads焦虑得分无相关性(r2＝0.3647；p＝0.2378)(图7(a)-(b))。对于轻度至中度水平的焦虑和抑郁的ibs受试者组，观察到ibs的严重度与焦虑和抑郁水平之间弱相关性或无相关性。这些结果表明，ibs和合并焦虑/抑郁是独立的因素，并且可能需要单独的管理方法，如在组合35624/1714产品中所用。为了进一步验证该假设，通过参照仅使用35624菌株收集的数据来评估组合试验的结果。110、组合或35624单用对ibs患者hads得分的影响的对比111、该组合产品在改善情绪(减少焦虑和抑郁)方面具有临床上显著的效果，并且出人意料的是，在参与者不服用该组合产品的8周期间，对焦虑和抑郁的效果得以持续。因此，将该结果与先前对仅接受长双歧杆菌35624治疗的ibs患者进行的研究(whorwell et al2006)来进行对比是很有意义的。这项研究是随机双盲安慰剂对照多中心试验，其中所有类型的ibs患者，无论是否患有合并焦虑/抑郁，均被纳入该试验中。单一菌株长双歧杆菌35624对hads得分的效果并没有超过安慰剂效果。受试者的hads得分严重度短暂下降，一旦停止喂食就消失(图8(a)和9(b))。这与组合产品不同，后者在喂食后观察到对had评分的显著效果，并且在喂食停止后8周保持了这种效果(图8(b)和图9(b)。112、实施例2—单独喂食菌株或菌株与1714tm菌株组合喂食对ibs患者血浆tnf-α水平的影响113、在给ibs患者喂食组合产品后，我们发现ibs患者的焦虑和抑郁减轻，并且这些效果在停止喂食后持续。为了确定研究参与者的炎性状态是否也发生变化，测量了血浆生物标志物肿瘤坏死因子(tnf)-α。在最近的研究中，tnf-α血清水平与ibs患者的不适和病症严重度相关(choghakhori et al 2017)。几项其他研究已经证实，ibs患者与健康对照组相比，血清中的tnf-α水平更高(rana et al 2012；seyedmirzaee et al 2016；schmulson etal 2012)。此外，在一项病例对照试验中，作者证实包括肿瘤坏死因子α在内的细胞因子的异常水平与ibs的病症以及与抑郁和焦虑情绪病症的严重度显著相关(zhen et al 2018)。114、我们研究了长双歧杆菌35624和长双歧杆菌1714的组合在0、4、8、12和16周时对ibs成年患者炎性标志物tnf-α的影响。115、将该结果与另一项临床试验进行对比，这项临床试验研究了单独使用长双歧杆菌35624对ibs患者的效果，这些ibs患者同时患有焦虑和抑郁并且同样已服用了8周的该产品。对于这项研究，有4周的洗脱期。试验组为：安慰剂(n＝31)和长双歧杆菌35624(1x1010cfu)(n＝39)。116、从外周血收集血浆样品并储存在-80℃直至分析。使用来自meso scalediscovery的96孔测定试剂盒(gaithersburg,md；货号k15008b-1)测定血浆中的tnf-α，并进行定量，并报告为相对于基线的以皮克每毫升为单位的变化。每个样品一式两份测定。117、与先前的报告一致，我们还发现与健康对照相比，ibs患者的血浆tnf-α显著增加(图10(a))。在ibs队列中，组合产品随时间显著降低血浆tnf-α。同样，与我们用hads评分所看到的类似，在喂食后存在延长的(8周)改善，即，甚至在喂食停止后tnf-α仍降低(图10(b))。在先前的一项研究中，ibs患者被单独喂食长双歧杆菌35624，与安慰剂相比，在8周的喂食期间，血浆tnf-α显著降低，但是在喂食结束后4周，血浆tnf-α水平升高并回到基线水平(图11)。这再次突出了长双歧杆菌35624和长双歧杆菌1714的组合的协同作用：喂食停止后我们获得了延长的改善。通过对比，一旦停止喂食，长双歧杆菌35624失去其抗炎效果。118、实施例3—对通过匹兹堡睡眠质量指数测量的睡眠质量的试验结果119、采用匹兹堡睡眠质量指数(pittsburgh sleep quality index，psqi)评估ibs患者的睡眠质量。这是用“combo”(5x108cfu/天的长双歧杆菌35624+1x109cfu/天的长双歧杆菌1714)进行的开放性研究，具有麦芽糖糊精和流动性试剂(诸如二氧化硅)的小袋形式(sachet format)，服用8周，然后进行8周洗脱(图1)。在0、4、8、12和16周测量psqi。通过改进的psqi评估睡眠质量，该改进的psqi旨在测量临床人群中过去一个月的睡眠质量和障碍，因为其具有可接受的可靠性和有效性(buysse et al.,1989)。psqi是一项19个项目的自我报告法，从七个领域评估睡眠质量：(1)睡眠时间(sleep duration)，(2)睡眠障碍(sleep disturbance)，(3)睡眠潜伏期(sleep latency)，(4)因睡意引起的日间功能障碍(daytime dysfunction due to sleepiness)，(5)睡眠效率(sleep efficiency)，(6)总体睡眠质量(overall sleep quality)，和(7)睡眠药物的使用(sleep medication use)。每个睡眠组成部分产生范围从0到3的得分，其中3表示功能障碍最大。将睡眠组成部分得分求和，以产生范围从0到21的总得分，总得分(称为总分(global score))越高，表明睡眠质量越差。在区分睡眠好的人和睡眠差的人时，psqi总分>5得到89.6％的灵敏度和86.5％的特异性(buysse et al.,1991；herman et al.,2002；fillingim et al.；2011，porto etal.,2011)。我们使用这个>5的总体psqi截止值研究睡眠质量差的ibs患者的一个亚群。主观睡眠质量评分如下：“非常好(very good)”(0)，“很好(fairly good)”(1)，“很差(fairlybad)”(2)，“非常差(very bad)”(3)。120、组合产品的每日摄入在第4周和第8周显著降低psqi总分(图12(a))。psqi总分的降低表明睡眠质量得到改善。当查看睡眠质量差(psqi总分>5)的ibs患者的亚组时，组合在所有时间点甚至在喂食后显著降低psqi总分(图12(b))。psqi总分是七个组成部分得分(睡眠障碍、总体睡眠质量、睡眠潜伏期(入睡时间)、睡眠时间、因睡意引起的日间功能障碍、睡眠效率、对睡眠药物的需求)的总和。其中，在第4周、第8周和喂食后8周，组合显著降低了psqi-睡眠潜伏期得分(图13(a))。同样，当我们查看“睡眠不足”的亚群时，我们发现在喂食后8周时psqi-睡眠潜伏期减少了(图13(b)。另一个值得注意的结果是，当受试者被问及“过去一个月内，您对睡眠质量的总体评价如何？”这个问题时，结果显示，施用组合产品显著改善了睡眠质量，符合psqi总分。在组合组中，从基线到干预结束(8周)，主观睡眠质量得分得到改善，并在喂食停止(16周)后保持其效果(图14(a)。当查看不同类别睡眠者的百分比时，组合治疗增加了将其睡眠描述为“好(good)”的患者的数量，并减少了睡眠“很差(fairlybad)”的受试者的数量，并且即使在喂食停止后这种情况也能得到保持(图14(b))。我们还分析了ibs患者的亚组，这些ibs患者报告说他们在基线时睡眠“差(bad)”，并且这反映在psqi总分大于5。在该组中，从基线到干预结束(8周)，主观睡眠质量得分得到改善(psqi总分超过5)，并且在喂食停止(16周)后保持其效果(图15(a)。当查看不同类别睡眠者的百分比时，组合治疗增加了将其睡眠描述为“很好(fairly good)”的患者的数量，并减少了睡眠“很差(fairly bad)”的受试者的数量，并且即使在喂食停止后这种情况也能得到保持(图15(b))。组合产品对睡眠质量的有益效果表明该菌株组合对健康促进的潜在益处。121、在这项ibs研究中，40名患者中的33名的psqi总分为5或5以上，并且已经表征为睡眠不好的人，这与文献表明ibs患者睡眠质量差相一致。组合施用后，在这些ibs患者中通过psqi测量的不良睡眠质量显著降低，并且该效果在组合施用后保持8周。这些结果与我们在hads得分中看到的结果一致：由于ibs病症和不良睡眠质量之间存在相互作用，这种效果在停止喂食后维持8周。122、实施例4—喂食35624菌株与1714菌株组合对ibs患者的唾液皮质醇的影响123、作为开放性试验的一部分(如实施例1所述)，我们研究了长双歧杆菌35624和1714菌株的组合在0、4、8、12和16周对患有ibs的成年人的应激激素皮质醇的影响。唾液皮质醇和皮质醇觉醒反应是非侵入性的，易于执行，并且是评估hpa轴功能的有效方法。由于唾液皮质醇是昼夜节律的(circadian)，我们在4个不同时间点(15分钟、30分钟、45分钟、60分钟)测量了觉醒皮质醇。早晨皮质醇的动态升高通常发生在醒来后30-45分钟内，然后在一天中其余时间内逐渐下降。这被称为皮质醇觉醒反应(car)。正常car反应的特征在于在30分钟时出现短期峰。在ibs患者中，这种动态反应减弱，觉醒时皮质醇水平很少或没有变化。有假说认为这是由于与ibs症状相关的长期应激源在car反应中诱导“耗竭(exhaustion)”或负反馈回路。car反应的正常化可以表明ibs对受试者的脑-肠轴的正常工作的影响的有益降低。124、对于唾液样品的卫生采集，使用salivette拭子，然后将样品在-80℃下保持冷冻直至测定。salivette采样装置由棉拭子组成，患者咀嚼棉拭子2分钟，然后将棉拭子转移到装置的塑料管中。指示患者在采样前15分钟不要进食、吸烟、饮茶或咖啡、或刷牙，并且在采样前24小时内不允许进行牙科检查。唾液样品可以在室温下保存或在参与者的家用冰箱或冷冻机中保存，直到其被送到实验室。使用皮质醇酶免疫测定试剂盒(cortisol enzymeimmunoassay kit)根据制造商的说明书(enzo life sciences,uk)测定皮质醇浓度。测定的检出限为0.16nmol/l。测定间和测定内变异系数(cv)分别为11.24％和8.2％。125、根据文献，患有ibs的受试者在觉醒时表现出高皮质醇水平和减弱的car，即在觉醒后30分钟皮质醇增加极小或没有增加，因此在60分钟时没有随后的降低。为了最好地显示干预对car的影响，绘制并计算了“曲线下面积”的增加(auci)。auci是从时间0到时间60分钟的该反应曲线下可以测量的面积。其参考第一个值进行计算，从而强调随时间的变化。126、ibs患者在早晨醒来后皮质醇生成增加减弱，这导致与健康对照相比，ibs受试者的基础早晨唾液皮质醇水平(basal morning salivary cortisol levels)的auci更低(图16)。该图是根据出版物suarez-hitz et al.2012提供的数据重制的。127、长双歧杆菌35624和长双歧杆菌1714的组合(combo)的使用对觉醒皮质醇的产生具有正常化作用，导致具有中度和重度ibs病症的成人在觉醒后30分钟暂时增加。当在第0周、第4周、第8周、第12周和第16周测量auci(n＝33)时，auci升高，表明在喂食期间ibs受试者中car反应减弱的逆转。这种效果在停止喂食后的8周(第9-16周)内消失(图17)。因此，组合的喂食使失调的皮质醇觉醒反应正常化。这种效果不同于对睡眠质量、焦虑和抑郁的影响，其在喂食后未得以持续。据我们所知，尚未发现益生菌或益生菌组合以这种有益的方式改变ibs受试者的car。128、实施例5—菌株体外相容性的证明：35624单独或与1714tm菌株或dpc6315菌株组合的过夜培养129、在进行人体试验之前，进行两项共培养实验，以研究长双歧杆菌35624与另一长双歧杆菌dpc6315或1714菌株的组合在生长实验中的作用。所有过去培养35624菌株的经验表明，其为一种敏感菌株，需要仔细管理。在体外实验中选择长双歧杆菌dpc6315因其具有抗炎作用(anti-inflammatory tone)(实施例6)。130、将ah1714/35624和dpc6315/35624以100ml规模共培养，使用完全相同的细胞数接种所有的100ml培养物。将od-标准化的接种物加入100ml无过敏原的含4.5％蔗糖、0.05％半胱氨酸的培养基中，其用于所有菌株。将单独菌株与组合的菌株在37℃孵育24小时。本实验的结果为我们提供了这些菌株共培养能力的更好指示。35624的利福平抗性变体用于在收获时检测菌株。这种变异由利福平抗生素抗性基因中的点突变组成。培养35624并在含有利福平的琼脂培养基上进行活菌计数，以在培养实验中获得35624的准确细胞计数。131、
<![cdata[<u>单菌株</u>]]>
<![cdata[<u>单菌株</u>]]>
<![cdata[<u>组合</u>]]>
对照(2％35624-rif)
对照(2％a h1714)
ah1714/35624-rif(各2％)
对照(2％35624-rif)
对照(2％dpc6315)
dpc6315/35624-rif(各2％)
132、ah1714/35624共培养实验：每种菌株都没有显著的抑制，并且每种菌株的cfu/ml或生长均与两种菌株一起共培养中的生长相似(7.9e8 cfu/ml 35624rif和7.2e8 cfu/mlah1714)(图12(a))。133、dpc6315/35624共培养实验：每种菌株都没有显著抑制，并且每种菌株的cfu/ml与两种菌株一起共培养时相似(9.4e8 cfu/ml 35624rif和8.5e8 cfu/ml ah1714)(图12(b))。134、该结果表明35624和1714之间无有害的相互作用。135、实施例6—35624、ah1714和dpc6315的抗炎(il-10/il-12比值)pbmc谱136、我们以前已经证明长双歧杆菌35624在体外具有抗炎特性(anti-inflammatoryprofile)，而这种类型的抗炎特性可能与ibs有关。因此，本研究的目的是确定我们是否可以找到相似的抗炎长双歧杆菌菌株，该菌株可以与长双歧杆菌35624合作以形成增强的抗炎组合。我们筛选了15种不同的长双歧杆菌的抗炎菌株特性，包括长双歧杆菌dpc6315和长双歧杆菌1714。为了确定这一点，我们测量了用这些细菌菌株体外刺激的pbmc的il-10和il-12。137、白介素-10(il-10)是一种由许多细胞类型产生的抗炎细胞因子，该细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞和淋巴细胞(t调节细胞)。il-10下调促炎th1细胞因子、mhc ii类抗原和共刺激分子在抗原递呈细胞上的表达。其还增强b细胞存活、增殖和抗体产生。该细胞因子可以阻断nf-κb活性，并参与jak-stat信号通路的调节。小鼠敲除研究已证明，由于il-10ko小鼠发展为严重结肠炎，因此il-10在免疫调节中起着至关重要的作用。此外，已经显示作为il-10的强效诱导剂的细菌在体内促进t调节细胞分化，从而促进免疫自稳(o’mahony et al.,ajp 2006；o’mahony et al.,2008)。138、白介素-12(il-12)是与th1效应物t细胞反应极化相关的促炎细胞因子，并刺激从t细胞和自然杀伤(nk)细胞产生其它促炎th1细胞因子，诸如干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。高水平的il-12表达与自身免疫有关。给患有自身免疫性疾病的人施用il-12显示出恶化疾病病症。相反，il-12敲除小鼠或用il-12中和抗体治疗的小鼠改善了该疾病。139、细胞因子级联和网络控制炎症反应，而不是细胞因子对细胞类型的作用。两种细胞因子(诸如il-10和il-12)的相对表达水平或平衡比单一细胞因子的表达更有意义。在这些研究中，我们用一系列不同的菌株刺激人pbmc。所有菌株均诱导il-10，且所有菌株均诱导il-12。然而，对il-10和il-12诱导之间的比值的检查表明，与其它菌株相比，一些菌株诱导了更高的比值(即，更多的il-10和更少的il-12)。这是一个有意义的观察结果，因为正是这些相反信号之间的平衡最终决定了免疫学结果。据预测：高il-10：il-12比值将促进与适当免疫调节活性相关的抗炎反应，而低il-10：il-12比值将有助于免疫反应的th1极化。因此，pbmc il-10：il-12比值是鉴定具有免疫调节特性的细菌菌株的重要选择标准。140、如下所述进行测定：141、根据制造商的说明，使用bd vacutainer cpt管(bd货号362761)从新鲜的健康人外周血中分离外周血单个核细胞(pbmc)。将pbmc洗涤并重悬于dulbecco'smodified eaglemedium-glutamax tm(glutamax(谷氨酰胺替代物)+丙酮酸+4.5g/l葡萄糖(gibco货号10569-010)10％胎牛血清(sigma货号f4135)和1％青霉素/链霉素(sigma货号p0781)中。将200μl浓度为1x 106个细胞/ml(即，2x 105个细胞)的pbmc加入平底96孔板中，并将20μl细菌(浓度为1x 107cfu/ml)加入所需的孔中，即20μl刺激物/200ml细胞。根据需要在保温箱中在37℃/5％co2下孵育该96孔板。142、细菌如下产生：对于新鲜肉汤，细菌在difco mrs培养基中生长，并在进入稳定期后立即收获。所有细胞均在厌氧条件下于37℃生长。对于冻干产物，细菌在difco mrs培养基中生长，并在进入稳定期后立即收获。细胞在厌氧条件下于37℃生长。然后对于这些细菌中的每一种产生冻干粉，并被我们在-80℃储存在预先等分的100mg小瓶中直至使用前。一旦将它们从冷冻机中取出，将单个小瓶解冻至室温，并在10ml ringers中洗涤3次，然后离心。每次使用新的小瓶。如下所述形成总细菌计数。等分至无菌试管中的冻干的细菌应在10ml培养基(rpmi或dmem)中稀释。从该试管中取出1ml，并加入4.5ml培养基(rpmi或dmem)中，这将是浓度为1.0e+09的最高剂量，然后将其稀释1：1(中等剂量)或1：9(较低剂量)。将20μl细菌溶液加入200μl pbmc悬浮液(2×105个细胞)或将50μl细菌溶液加入500μl pbmc悬浮液(5×105个细胞)或100μl。选择的通常稀释度为1.0e+08，对应100：1(细菌：pbmc)。阴性对照仅为冷冻保护剂，应将其加到未刺激的细胞中，但应以与细菌等分试样相同的方式稀释。所有测定均为一式三份。在37℃温育1天后，将该板以300x g旋转，并将上清液取出并在-80℃冷冻储存直至分析。使用meso scale discovery的96孔测定试剂盒(gaithersburg，md；货号k15008b-1)测定培养上清液中的细胞因子、白细胞介素10(il-10)和白细胞介素12p70(il12p70)，并进行定量，并以皮克/毫升报告。每个样品一式两份测定。图中示出了代表性实验的结果。143、在所测试的15个菌株中，测定了三个长双歧杆菌菌株，长双歧杆菌35624和长双歧杆菌1714诱导了非常相似且理想的il-10/il-12比值。长双歧杆菌dpc6315给出了比35624或1714更高的比值，这同样是所希望的特性(图19)。144、此外，为了试图确定组合菌株是否存在负面影响，我们评估了用35624和dpc6315以及这两种菌株的组合刺激的pbmc的il-10产生。在体外使用组合的两种菌株未观察到负面作用，并且获得了与单独使用的菌株类似的il-10产生(图20)。当35624与1714组合使用时，获得了类似的结果。因此，根据文献中所有可获得的信息和这些结果，我们的假设是长双歧杆菌dpc6315与长双歧杆菌35624的组合也应该是很好的组合抗炎产品。145、实施例7—在抗炎胶原诱导的关节炎(cia)模型中的菌株对比146、为了进一步测试35624/dpc6315组合，将菌株在炎症小鼠模型中组合。我们以前已证明，食用特定益生菌菌株可以调节粘膜炎性疾病。本研究的目的是在单独使用或与成熟的抗炎菌株筛选模型组合的鼠关节炎模型中确定口服施用益生菌长双歧杆菌菌株的效果。ibs与更高水平的炎症有关。评估抗炎作用的ibs小鼠模型尚未很好地建立，因此使用经过充分验证的抗炎模型。这些新的双歧杆菌菌株被鉴定为在体外具有抗炎特性。147、从我们的pbmc筛选(实施例5)，我们选择长双歧杆菌dpc6315，以确定与抗炎长双歧杆菌dpc6315一起使用时，已知的益生菌长双歧杆菌35624的治疗效果是否能够增强。在共培养实验中，这些菌株不抑制彼此的生长。148、给小鼠口服长双歧杆菌35624、长双歧杆菌dpc6315或两者的组合。cia关节炎模型中的关节炎发作和疾病严重度是使用诸如疾病的临床体征和足肿胀的端点(endpoints)所测量的主要参数。149、类风湿性关节炎(ra)是一种慢性自身免疫性疾病，其影响了1-2％白种人群体(caucasian population)。ra的特征在于关节滑膜发炎、软骨降解和骨侵蚀。关节损伤发生在ra早期，并且一旦出现，很大程度上是不可逆的。已经报道了促炎细胞因子tnf、il-6和ifn-γ以及抗炎细胞因子il-10的失调表达(fieldman et al.,1996,annu rev immunol14；397-440)，以及高水平的il-15(mcinnes ib et al.,1996)和il-17(mcinnes ib etal.,2000)。中和tnf-α或il-1β的治疗策略在临床上的成功已突出了tnf-α和il-1β与疾病发病机理的相关性(elliott mj et al.,1994,.moreland lw et al.,1997,.feldmann m:2002)。胶原诱导的关节炎是众所周知的人ra的鼠类模型，并且同时具有许多类似ra中发现的体液和细胞免疫机制的特征(durie fh et al.,1994)。当病变处于急性到亚急性期时，具有ii型胶原关节炎的小鼠和大鼠中的炎性浸润由嗜中性粒细胞和巨噬细胞组成，伴有较少数量的淋巴细胞。在急性到亚急性期，关节间隙内的组织水肿和嗜中性粒细胞渗出物很常见。随着炎症向慢性发展，在滑膜和关节周围组织中出现单个核炎性细胞(单核细胞、淋巴细胞)占主导地位以及成纤维细胞增殖，通常伴有异染性基质(metachromatic matrix)的沉积。在关节间隙中渗出物较少见。150、除非在注释区域指明，否则炎症类型为急性至亚急性。151、如下所述进行测定。152、实验设计153、用异氟醚麻醉动物(15只dba/1只小鼠/关节炎组)，在尾巴基部刮毛，并在第0天和第21天在尾巴基部皮内注射150μl含有牛ii型胶原的弗氏完全佐剂(difco)(bolderbiopath,批号#5)(1mg/ml)。在研究第14天，根据体重将小鼠随机分为治疗组。登记后开始治疗并每日持续(qd，间隔24h)直至研究第34天(在第18天开始用阳性对照地塞米松治疗)。在研究第24-35天，发生关节炎发作。在研究第35天处死小鼠。在第18-35天，对每只爪(右前、左前、右后、左后)进行临床评分。154、观察、测量和标本155、一旦诱发疾病，就观察小鼠的疾病的临床体征。在研究的第18-35天，使用以下标准对每只爪(右前、左前、右后、左后)进行每日临床评分：156、0＝正常。157、1＝一个后爪或前爪关节受影响或极少的弥漫性红斑和肿胀。158、2＝两个后爪或前爪关节受影响或轻度弥漫性红斑和肿胀。159、3＝三个后爪或前爪关节受影响或中度弥漫性红斑和肿胀。160、4＝四个后爪或前爪关节受影响或明显的弥漫性红斑和肿胀。161、5＝整只爪受影响，严重弥漫性红斑和严重肿胀，不能弯曲。162、炎症评分163、0＝正常。164、0.5＝非常少，仅影响1个关节或极少的多灶性关节周围炎性细胞浸润。165、1＝受影响的关节的滑膜和关节周围组织中极小的炎性细胞的浸润166、2＝轻度炎性细胞浸润。如果是指爪子，通常仅限于受影响的关节(1-3个受影响的关节)。167、3＝中度浸润伴中度水肿。如果是指爪子，则仅限于受影响的关节，通常是3-4个关节以及腕或踝。168、4＝明显浸润，影响大部分区域，伴有明显水肿，可能存在1或2个未受影响的关节。169、5＝严重弥漫性浸润，伴有严重水肿，影响所有关节(在一定程度上)和关节周围组织。170、通过测定第18-35天的剂量曲线下面积(auc)来分析爪子得分的临床数据(动物的平均值)。为了计算auc，将每只小鼠的每日平均得分输入microsoft excel，并计算治疗日和最后日之间的面积。测定每组的平均值，并通过对比治疗动物和正常动物的值来计算相对于关节炎对照的抑制百分比。使用单因素方差分析(单因素anova)或kruskal-wallis检验(非参数)以及适当的多重比较后检验对数据进行分析。通过使用学生双尾t-检验将正常对照和疾病对照进行对比来验证该模型。统计检验对数据的正态性和方差齐性做了一定的假设，如果检验结果违反了这些假设，则可能需要进一步的分析。所有检验的显著性设定为p<0.05。171、与疾病对照组(*p<0.05)(图21(a))或dpc6315和35624组合喂食组(图21(b))相比，长双歧杆菌35624喂食导致炎症和疾病临床体征减轻。与此一致，长双歧杆菌35624服用延迟了疾病发作和严重度，如通过发病率百分比所测量的，而两种长双歧杆菌的组合或单独的dpc6315则不会延迟，尽管dpc6315显示出与35624相似的趋势(图22)。总之，在胶原诱导的关节炎模型中，通过关节评分和发病率，口服施用益生菌长双歧杆菌35624在减轻炎症方面明显优于组合产品，并导致关节炎的视觉评估的显著改善。这是出人意料的结果，因为它们是来自体外pbmc测试的最好的两种候选菌株，并且在共培养实验中没有生长抑制作用。当组合使用时，长双歧杆菌dpc6315在关节炎(cia)小鼠模型中抑制了35624的抗炎效果，并且该组合比单独的任一种菌株都差。本研究证明了长双歧杆菌菌株的组合的效果在体内可能是不可预测的。172、本发明的菌株可以常规制剂(诸如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、含片、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂)的口服可吸收的形式施用于动物(包括人类)。合适的制剂可通过通常采用的方法使用常规的有机和无机添加剂来制备。药物组合物中活性成分的量可处于将发挥所需治疗效果的水平。173、该制剂还可包括细菌组分、药物实体或生物化合物。此外，包含本发明菌株的疫苗可使用任何合适的已知方法制备，并且可包括药学上可接受的载体或佐剂。174、益生菌生物的引入是通过摄入合适载体中的该微生物来完成的。提供一种促进这些益生菌菌株在大肠中生长的培养基将是有利的。添加一种或多种寡糖、多糖或其他益生元(prebiotics)可增强乳酸菌在胃肠道中的生长。益生元是指在结肠中由被认为具有积极价值的固有细菌(例如双歧杆菌、乳杆菌)特别发酵的任何非活食物组分。益生元的类型可包括含有果糖、木糖、大豆(soya)、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的那些。益生菌菌株与一种或多种益生元化合物的组合施用可增强所施用的益生菌在体内的生长，导致更显著的健康益处，并被称为合生元(synbiotic)。175、应当理解，益生菌菌株单独地或与如上所述的其它益生菌和/或益生元物质一起，可以预防性地施用或者作为治疗方法施用。此外，该细菌可用作使用其它活性物质的预防或治疗方案的一部分，该其它活性物质诸如用于治疗炎症或其它障碍的尤其是涉及免疫学的活性物质。这种组合可在单一制剂中施用或作为分开的制剂在相同或不同的时间并且使用相同或不同的施用途径施用。176、可配制本发明的菌株以促进控制释放诸如该菌株的延迟释放。例如，该制剂可适于在胃肠道中的特定位置诸如小肠或结肠中释放该菌株。为了实现这种控制释放，可将菌株配制成具有适于在特定位置释放菌株的包衣的胶囊。有多种包衣可用于促进这种控制释放。一类这样的包衣是以商标eudragit可获得的那些。177、本发明不限于上文描述的实施方案，其细节可有所不同。178、参考文献179、allen,a.p.,hutch,w.,borre,y.e.,kennedy,p.j.,temko,a.,boylan,g.,murphy,e.,cryan,j.f.,dinan,t.g.&clarke,g.2016.bifidobacterium 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