一种用于骨关节退行性疾病的组合物及制备方法

本发明涉及药物领域，尤其涉及一种用于骨关节退行性疾病的组合物及制备方法。

背景技术：

1、骨关节退行性疾病，比如骨关节炎(oa)是严重影响人类生活质量的常见疾病，它在全球范围内的患病率极高，特别是在老年人群中，具有发病率高、致残率高、复发率高以及并发症多的特点。据世界卫生组织的数据，oa正越来越严重的影响患者的生活质量和工作能力。目前，治疗骨关节炎的主要手段包括药物治疗、物理治疗、手术治疗以及生活方式的改变，如合理增加运动、控制体重等。然而，骨关节炎的治疗仍面临许多挑战，如药物的副作用、手术的风险以及患者的依从性等，因此，研发更有效、更安全的治疗手段是当前的重要任务。

2、oa状态下的炎症贯穿整个疾病的进程，炎症不仅可以导致关节软骨磨损和骨质增生，也会引起关节疼痛和功能受损。在炎症状态下，巨噬细胞能够响应于炎症信号，从而被募集在滑膜中，同时巨噬细胞也会被激活为促炎表型，进而释放出一系列炎症因子，包括tnf-α、il-1β、il-6等，加剧骨关节炎的发展进程。因此，重塑炎症微环境是治疗骨关节炎的一种重要策略。一些研究已经证实，通过减少关节腔内促炎巨噬细胞的数量或将其重编程为抗炎表型的方式，可以有效地减轻炎症反应，从而改善oa的进展。此外，也有研究表明，调节炎症微环境中的细胞因子和信号通路，如通过抑制nf-κb信号通路或调节jak/stat信号通路，可以有效地降低炎症水平，从而减轻oa的症状。

3、然而，炎症微环境重塑后，已受损的软骨组织的修复是极为困难的。受损的软骨细胞产生的病理相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，pamps)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，damps)刺激周围的组织细胞如滑膜成纤维细胞或软骨细胞持续产生炎症，同时促进软骨基质的降解，因此，修复受损软骨组织是治疗骨关节炎的另一个重要策略。当前，在骨关节炎的炎症条件下实现有效的关节软骨的修复和再生仍然是一个挑战。干细胞是关节内软骨更新的唯一来源，因此，干细胞疗法被认为是治疗oa的重要手段之一。一方面，干细胞能够分化成软骨细胞，更新受损的软骨细胞；另一方面，干细胞软骨化过程中能够促进软骨基质的再生，从而实现软骨组织的修复。然而，在炎性条件下，干细胞的增殖及分化行为会受到一定的抑制；此外，在正常生理条件下干细胞软骨化过程十分缓慢，难以有效补充受损软骨。因此，以改善oa滑膜炎症微环境为基础，联合提高干细胞的软骨分化效率以实现软骨修复和再生的策略，具有有效改善oa疾病进程的潜力。

4、干细胞定向分化剂，比如kartogenin(kgn)是一种小分子化合物，具有很高的促进间充质干细胞成软骨分化的活性(ec50＝100nm)，能显著地促进mscs的软骨化，是一种潜在的促干细胞分化剂候选药物。kartogenin促进干细胞向软骨细胞的分化主要通过与细胞内的核心结合因子β(cbf-β)结合来实现。cbf-β是一个关键的转录共激活因子，对多种基因表达具有调控作用。kgn与cbf-β的结合激活了一系列信号传导途径，从而促进干细胞中与软骨生成相关的基因表达。这些基因表达的变化导致干细胞逐渐向软骨细胞分化，进而促进软骨的形成和再生。此外，kgn还可能影响其他与软骨细胞生成和维持相关的信号通路，但这些机制的细节仍在研究之中。总的来说，kgn通过精确调控细胞内的分子机制，有效地推动干细胞向软骨细胞的转化。尽管kgn在软骨再生方面具有显著优势，但由于其代谢不稳定性导致的短半衰期、强烈的疏水性导致的药物形成不佳以及可能的副作用，如刺激正常组织过度生长的非靶向效应等，使得直接注射kgn的应用受到限制。

5、纳米技术在药物递送领域的应用为关节治疗提供了新的思路和方法。与传统治疗方法相比，纳米系统具有特殊的物理和化学特性，可以应对关节治疗给药的特殊性需求。在之前的研究中，骨关节炎(oa)患者和碘乙酸诱导的骨关节炎模型小鼠的关节组织滑膜巨噬细胞中碳酸酐酶ix(ca9)蛋白表达显著增加，通过沉默m1型巨噬细胞中ca9基因表达，炎症微环境得到重塑，显著改善了oa进展。这表明，ca9基因的沉默对于有效改善oa炎症状态十分有利。目前尚缺乏将纳米技术与关节治疗相结合的更为有效的药物应用。

6、当前骨关节退行性疾病治疗缺乏具有显著治疗作用的方式，细胞疗法是oa治疗中一类重要手段，应用最为广泛的是间充质干细胞(mscs)。然而，mscs等的临床应用面临着许多挑战。首先，由于患者之间的个体差异，mscs等的临床效果不稳定；其次，干细胞在应用时必须考虑具体的分化方向即干细胞特异性分化，促干细胞分化剂能够有效促进干细胞软骨化进程，实现oa病症的缓解。同时，在联合抗炎策略时，对整体微环境的考虑也非常重要。当前亟需解决骨关节退行性疾病治疗中，干细胞疗法及干细胞定向分化剂在oa等领域应用，如何减少副作用、同时增强治疗有效性的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物及制备方法，以期实现滑膜炎症微环境重塑，并结合外源性骨髓来源间充质干细胞软骨细胞分化的双重功效，探索有效改善oa进展的新型药物治疗策略。

2、本发明提供了一种用于骨关节退行性疾病的组合物，该组合物包含能够促进干细胞定向分化为软骨组织的干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质，通过抗炎效应调控骨关节微环境，从而改善干细胞定向分化形成软骨组织效应，用于骨关节退行性疾病的治疗；其中，干细胞定向分化剂为分子量小于1000da的小分子化合物，包括具有联苯胺结构的分子，优选为kartogenin(kgn)、葡萄糖胺和/或其变体结构；具有抗炎功能的活性物质，通过调节炎症微环境，辅助干细胞的定向分化，包括核酸结构和/或其他具备相应功能的活性分子化合物和/或化合物片段；骨关节退行性疾病，优选为骨关节炎。

3、骨关节退行性疾病，比如oa的炎症微环境与关节滑膜巨噬细胞失衡密切相关。发明人发现，骨关节退行性疾病患者及碘乙酸诱导的骨关节炎模型小鼠关节组织滑膜巨噬细胞中碳酸酐酶ix(ca9)等蛋白表达显著增加。通过将干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质进行组合，尤其是与核酸结构的组合，能够沉默相关基因，比如ca9基因的sirna(ca9sirna)可以下调巨噬细胞ca9基因的表达，可以促进滑膜m1型巨噬细胞向m2表型转化，从而有利于炎症微环境重塑，显著改善oa进展。由此，发明人通过促进巨噬细胞m1向m2表型复极化，和介导骨关节退行性疾病的炎症微环境的重塑等起效路径，增强了干细胞的软骨修复作用，极大地改善了骨关节炎的治疗效果，用于骨关节退行性疾病的治疗。

4、优选地，干细胞包括间充质干细胞，和/或诱导多能干细胞，和/或胚胎干细胞中的一种或多种，优选为间充质干细胞；间充质干细胞从一种或多种组织中提取，该组织包括骨髓、脂肪组织、脐带血和/或牙髓。

5、优选地，干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质分别发挥炎症调控和促干细胞分化效力，在组合物中质量配比范围为1∶50至50∶1范围；干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质的组合形式包括微球、纳米粒子、凝胶包载物和/或骨架填充物中的一种或多种形式；其中该组合物优选为纳米制剂。

6、优选地，干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合形式为纳米粒子，该纳米粒子包括外壳载体材料和金属离子配合物内核；其中，外壳载体材料，包括磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物中的一种或多种、透明质酸和/或其衍生物，与干细胞定向分化剂的偶联和/或交联化物；偶联和/或交联，包括形成稳固作用力的键合作用，键合作用力大于25℃下水分子的相互作用力；

7、金属离子配合物内核，包括核酸结构与金属离子的螯合化物；其中，核酸结构包括小分子核酸、大分子核酸和/或其变体结构，和/或结构片段中的一种或多种；金属离子包括ca2+、mn2+、fe2+、fe3+、cu2+、la3+、al3+、zn2+、mg2+中的一种或多种；纳米粒子的组装形式还包括配位作用。

8、上述外壳载体材料与金属离子配合物内核的结合，具有高度生物相容性和生物降解性，通常不会引起显著的免疫反应或毒性反应。核酸结构与金属离子的螯合后，包裹在外壳载体材料中，能够有效保护和递送具有抗炎功能的上述核酸结构，并具有ph响应敏感解散释药的功能特征。另外，相较于脂质膜涂覆层而言，使用透明质酸和/或其衍生物连接能够更好的实现核酸结构及疏水性药物的共递送。巨噬细胞及干细胞过表达cd44受体，含有高分子量透明质酸的纳米载体能够通过受体配体相互作用增强肿瘤细胞的靶向性，有利于增强细胞摄取，提高胞内药物摄取能力。

9、发明人经过多次试验研究表明，干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合的上述纳米粒子形态，纳米粒在ph 3.0～9.0范围内，随着介质环境ph的提升，粒径逐渐增大，形貌由均匀分散的颗粒状重新分布为不规则的聚集体；处于细胞介质环境中，所述核壳型纳米粒在100h左右逐渐释放所述促干细胞分化剂；在含血清的介质中，所述核壳型纳米粒中的核酸结构能够完整稳定存在超过36h；经过opti介质稀释200倍，所述核壳型纳米粒的粒径变化范围不超过50nm。

10、同时，发明人通过多层次的细胞学研究和动物实验设计，研究结果表明，干细胞定向分化剂和具有抗炎功能的活性物质组合的上述纳米粒子形态，不仅重塑了oa的炎症微环境，促进m1型巨噬细胞向m2表型巨噬细胞复极化，同时也实现软骨保护和修复功能，并改善体内干细胞治疗oa的效应，为高效安全治疗oa提供了新的治疗策略。

11、优选地，磷酸化物为单磷酸类化合物、双磷酸类化合物和/或包含磷酸结构的其他小分子；单磷酸类化合物包括磷酸锰、磷酸钙、磷酸镧、磷酸钠中的一种或多种；双磷酸化物包括阿仑膦酸、利塞膦酸、氯膦酸、唑来膦酸、特立帕肽中的一种或多种；碳酸化物和/或硫酸化物包括碳酸钙和/或硫酸钙；羧酸化物包括羧酸钙和/或羧酸锰；氢氧化物包括氢氧化铁、偏铝酸、氢氧化镁中的一种或多种；单氧化物包括氧化铁、氧化锌和/或其修饰物中的一种或多种；

12、透明质酸和/或其衍生物为天然和/或合成的高分子聚合物材料，分子量范围在1～1000kda之间；优选地，透明质酸和/或其衍生物，包括透明质酸、水解透明质酸、乙酰化透明质酸、透明质酸钠交联聚合物、硅烷化透明质酸、羟丙基三甲基氯化铵透明质酸中的一种或多种；

13、小分子核酸包括sirna、microrna(mirna)、piwi-interacting rna(pirna)、长链非编码rna(lncrna)、small nucleolar rna(snorna)，和/或转运rna(trna)中的一种或多种；大分子核酸包括mrna、dna和/或其变体结构中的一种或多种。

14、磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物、氢氧化物和/或单氧化物与金属离子的结合，比如磷酸钙，就是一种天然骨组织成分，具有高度生物相容性和生物降解性，不会引起显著的免疫反应或毒性反应，同时金属离子配合物内核的纳米核心载体能够有效保护和递送核酸结构，并具有ph响应敏感解散释药的功能特征。凝胶电泳实验表明纳米粒子在血清中具有保护核酸结构免受核酶降解的能力达36h及以上。sem及dls测定法表明，纳米粒子可响应酸性环境释放相应的核酸结构。液相色谱-质谱(lc-ms)法表明上述纳米粒子具备胞内缓慢释放干细胞定向分化剂的潜力。

15、优选地，该纳米粒子通过dls检测，水合粒径在20nm～2000nm间，电位大于-50mv；其中，水合粒径优选在100nm～1000nm之间；电位优选在-30mv～+20mv。

16、优选地，该纳米粒子具有改善骨关节炎(oa)的炎症微环境、促进骨关节炎(oa)状态下体内外干细胞治疗效应、改善骨关节炎(oa)条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善骨关节炎(oa)进程中一种或多种的用途。

17、经发明人多次试验，比如rt-pcr和流式细胞术表明，上述纳米粒子能够有效将促炎性m1巨噬细胞复极化为抗炎性m2巨噬细胞。阿利新蓝染色实验证明，上述纳米粒子能够有效促进干细胞分化并能够显著改善炎症微环境对干细胞软骨化的抑制行为。免疫荧光染色实验以及western blot实验表明纳米粒子介导的炎症微环境改善，显著提升干细胞软骨化相关基因的表达。通过观察小鼠治疗期间的体重变化来评估制剂的整体安全性。小鼠血常规、血生化及主要脏器的h&e染色实验表明纳米粒在体内具有良好的安全性。进一步通过mia诱导的小鼠oa模型考察了制剂对外部注射间充质干细胞治疗oa的效应改善情况。对所得到的膝关节样本进行了h&e染色和番红o-固绿染色。根据染色结果，采用国际骨关节炎研究协会(oarsi)组织病理学评分标准，本发明提供的纳米粒子制剂具有相较于以往的制剂类型，具有更好的软骨下骨保护作用。这些结果表明，上述纳米粒子能够很好地改善干细胞疗法的疗效。由此，具有改善oa炎症微环境、促进oa状态下体内外干细胞治疗效应、改善oa条件下体内外干细胞定向软骨分化、和/或显著改善oa进程中一种或多种的用途。

18、优选地，该组合物还包括磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液中的一种或多种。磷酸盐缓冲体系和/或金属盐溶液为组合物，尤其是纳米粒子提供了相应的环境稳定剂。

19、优选地，该组合物与干细胞联合用药，包括关节腔注射给药、肌肉注射、透皮吸收中的一种或多种；通过关节腔注射给药的干细胞单次用量不超过1000w/kg，干细胞定向分化剂和所述核酸结构的单次用药剂量分别不超过50μm及5μm。

20、本发明还提供了一种上述组合物的制备方法，其中，将外壳载体材料、核酸结构的水溶液、缓冲体系和金属离子溶液分步混合，均质化后得到所述纳米粒子；均质化过程包括超声波混合、涡旋振荡混合、移液枪吹打混合和/或其他包含剪切力、惯性力、吸附力、空化作用的混合方式；优选地，缓冲体系包括hepes，nacl和na2hpo4，浓度范围分别为5～500mm，200～600mm和0.1～2mm；缓冲体系的ph范围在3.0～10.0之间，优选在6.0～9.0之间。

21、本发明中具体地，将磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种，和透明质酸和/或其衍生物通过酰胺化反应，形成所述磷酸化物、碳酸化物、羧酸化物、硫酸化物和/或氢氧化物中的一种或多种，接枝修饰的透明质酸和/或其衍生物(i)；将促干细胞分化剂与i偶联或交联，处理得到外壳载体材料；将外壳载体材料包裹核酸结构与金属离子螯合作用形成的内核，构建了纳米粒。上述构建方式形成纳米粒稳定、路线简便易行，可以实现工业化应用，具有市场价值。

22、本发明的目的是构建一种包含干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物，其中，该组合物通过抗炎效应调控骨关节微环境，从而改善干细胞定向分化形成软骨组织效应，用于骨关节退行性疾病的治疗。该组合物利用相关基因的沉默效应，协同小分子干细胞定向分化剂的促干细胞分化能力，在改善炎症微环境的同时促进炎症部位干细胞的定向分化。

23、因此，在本发明中，我们设计以干细胞定向分化剂和含氧化物、透明质酸聚合物为骨架，形成外壳载体材料，又通过具有抗炎功能活性物质、金属离子的络合作用，形成金属离子配合物内核。保证纳米粒子在介质中粒径的稳定性，实现具有抗炎功能活性物质，比如核酸结构和干细胞定向分化剂的共递送的目的。通过纳米沉淀法所制备的粒子的水合粒径，可以在200nm左右，电位接近-15mv。所制备的纳米粒子能够有效递送相关核酸结构，并有效沉默相关基因的表达。此外，所制备的纳米粒子能够在体外模拟条件下缓慢释放干细胞定向分化剂，并对间充质干细胞具有显著的促软骨分化作用。在体内应用方面，同时含有干细胞定向分化剂和具有抗炎功能活性物质的组合物，对oa的改善是最为显著的，因此具有广阔的应用前景。