一种红细胞膜基-聚多巴胺纳米递送载体及其制备方法

本发明涉及纳米药物制备，更具体的说是涉及一种可介导光热疗、化疗、化学动力学治疗等多手段协同的红细胞膜基-聚多巴胺纳米递送载体及其制备方法。

背景技术：

1、癌症作为一种严重威胁人类健康的世界公共卫生疾病，成因复杂且因癌细胞会不断进化、转移，至今无法得到完全治愈。目前，癌症治疗方法包括手术治疗、化疗、放射治疗、免疫治疗、光热治疗(photothermal therapy，ptt)、光动力治疗(photodynamic therapy，pdt)和化学动力学治疗(chemodynamic therapy，cdt)等。然而，单一疗法尤其是化疗会对机体正常细胞造成不必要损伤，引起不良反应并产生耐药性等问题。因此，引入新型辅助治疗方法、协同治疗可有效改善单一化疗存在的问题，提高疗效。此外，开发绿色安全的新型药物递送载体为有效降低化疗药物不良反应、增强疗效提供了一种可行的方案。使用纳米载体对化疗药物与光敏剂等同时递送可达到协同治疗效果，有效延长各类治疗剂在体内的循环时间，并到达更深层肿瘤组织，避免其被过早清除，经表面修饰后的纳米载体还能有效靶向肿瘤细胞，产生更好的治疗效果。

2、ptt是利用光热转换剂(photothermal conversion agents，ptas)，在光照下，吸收光能产热致使肿瘤细胞坏死。但大部分小分子光敏剂都有溶解度差、急性毒性大、清除速度快等缺陷。而介孔聚多巴胺(mpda)不仅自身具备独特的光热转换性能，其表面还可进行功能化修饰，特殊的介孔空腔结构可对药物进行有效负载，从而实现协同治疗。

3、以纳米材料为基础的核/壳结构型载体在药物递送等生物医学领域已有广泛深入的研究，且该类系统可与其它辅助疗法结合，发挥化疗协同作用。mpda具有较强的光热稳定性和优异的体内外光热转换能力，同时，其载药量高、易于功能化修饰，化疗药物可有效负载于mpda的空腔和表面。以mpda为载体，可将药物准确地递送到肿瘤组织，减少过早泄露，实现精准释放，更好地发挥药效。在808nm波长的近红外(nir)光照下，随着肿瘤部位温度升高，促使药物从载体中释放，提高肿瘤细胞摄取率。因此，利用mpda优异的光热转换与载药性能进行靶向协同治疗具有更好的效果。

4、以红细胞膜(rbcm)作为涂层构建药物载体已被证实是实现协同治疗的一种可靠选择。rbcm上存在丰富的膜蛋白。其中，膜蛋白cd47能够与吞噬细胞表达的信号调节蛋白α(sirpα)相互作用，并发出“不要吃我”的信号，从而抑制巨噬细胞吞噬并延长自身在体内的循环时间，提高载体稳定性，增强其在肿瘤细胞的聚集，无脱靶毒性。同时，作为内源性生物基材料，由rbcm制得的仿生型载体具有良好的生物相容性，开发应用潜力极大。

5、载体构建时，cu2+的引入会增强mpda的光热特性，且使纳米载体具有cdt疗效，在肿瘤微酸环境中，与过量h2o2反应，进行类芬顿反应，生成大量ros以辅助杀死肿瘤细胞，具有优异的协同治疗作用。

6、在抗癌药物中，阿霉素(dox)是临床中最常用的化疗药物之一，对多种实体瘤具有优异的杀灭作用，以mpda载体负载dox，可有效延长体内循环时间，提高肿瘤靶向性，降低对正常组织和细胞的损伤。此外，纳米载体对其包覆率较高。在nir照射下，mpda升温，触发dox在肿瘤靶点定位集中释放。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明制备了一种新型的氧化还原敏感型纳米载体(mpda-p-cu2+)。将rbcm修饰在mpda表面增加其肿瘤靶向性与生物相容性。以dox为模型药物，将其包裹在纳米复合材料中，可促进其在肿瘤部位积聚，有效降低毒副作用。

2、使用ft-ir、uv-vis、tem、粒径、zeta电势和xps等技术确定纳米载体的形态结构，进行详细表征。考察mpda、mpda-p和mpda-p-cu2+的光热转换性能。

3、材料合成后表征的主要目的是考察相关基团是否修饰成功，以及修饰后载体性质的变化，并考察其载药量、包封率、体外释放率等。

4、以人乳腺癌mcf-7细胞为模型，考察原始型mpda、m-p-cu2+@dox、mpda-p@dox和rm-p-cu2+等样品在808nmnir照射下的细胞毒性、细胞摄取等。

5、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

6、一种红细胞膜基-聚多巴胺纳米递送载体的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)使用一锅合成法合成mpda，以自身丰富的官能团连接盐酸多巴胺(pda)并对cu2+进行金属螯合，制备了一种新型的氧化还原敏感型纳米载体(mpda-p-cu2+)；

8、步骤(1)中，合成的mpda粒径约为180nm，mpda通过以下步骤合成：取表面活性剂f-127与1,3,5-三甲苯(tmb)置于无水乙醇和h2o中进行超声，之后加入氨丁三醇(tris)和盐酸多巴胺(pda)搅拌24h，对混合液进行离心处理，使用乙醇和丙酮洗涤纳米颗粒，即得mpda；

9、f-127：tmb：tris：pda的质量比为36：36：9：6；

10、将mpda与pda反应制备mpda-p，随后加入二水合氯化铜(cucl2·2h2o)和pda进行负载，8h后离心洗涤，得mpda-p-cu2+；

11、mpda：pda的质量比为5-15：1，mpda-p：cucl2·2h2o的质量比为3-10：1；

12、(2)以mpda-p-cu2+负载药物，使用红细胞膜(rbcm)包覆mpda-p-cu2+以获得对肿瘤细胞的靶向性，延长药物在体内的循环时间，制成rm-p-cu2+@dox复合纳米载药系统；

13、mpda-p-cu2+：rbcm的质量比为8-15：1，rm-p-cu2+：药物的质量比为2-3：1。

14、进一步的，，步骤(1)所述mpda的制备方法包括以下步骤：

15、采用一锅法合成mpda纳米颗粒；首先将0.36g f127和0.36g tmb溶解于h2o(65ml)和乙醇(60ml)的混合液中；搅拌30min后，向混合物中加入溶于10ml h2o的90mg tris溶液，再添加60mg盐酸多巴胺；反应所得混合物在室温下搅拌24h，离心以分离产物；用乙醇和丙酮清洗离心后的颗粒；通过提取去除模板，将样品在乙醇和丙酮(v/v＝2：1)的混合溶液中通过超声处理三次，每次30分钟；最终产品分散保存在乙醇中，以备后续使用。

16、进一步的，，步骤(1)所述rbcm的制备方法包括以下步骤：

17、首先通过小鼠眼窦获得全血，将新鲜血液收集在肝素涂层的血液收集管中，在4℃下以1500rpm离心10min以分离血浆；将所得rbc用pbs/生理盐水洗涤多次，再将rbc收在4℃的超纯水中悬浮4h，每间隔1h手动震摇离心管加速rbc涨破；随后以15000rpm离心5min后去除血红蛋白，用超纯水洗涤rbcm数次，并使用0.45μm和0.2μm过滤器依次滤过，直至上清液无色，沉淀为淡粉色后，使用超声波细胞破碎仪在12％功率下对收集的红细胞鬼影进行5min的超声波处理，开5s，关5s；

18、将所得rbcm储存在含有蛋白酶抑制剂(2mm)的pbs(ph＝7.4)中，温度为-80℃。

19、进一步的，，步骤(1)所述mpda-p的制备方法包括以下步骤：

20、将10mg由(1)合成的mpda溶于1ml纯水中，取5mg pda加入圆底烧瓶中，37℃反应6h，再将混合液离心，洗涤至上清无色，放入冰箱备用。

21、进一步的，，步骤(1)所述mpda-p-cu2+的制备方法包括以下步骤：

22、向圆底烧瓶中加入10mg mpda-p，超纯水分散后缓慢滴入由tris-hcl(ph 5.8，10mm)配置的1mg/ml pda和1.74mg/ml cucl2·2h2o后，在1200rpm转速下45℃反应12h；反应结束后，将混合溶液离心洗涤，并冷冻干燥。

23、进一步的，，步骤(1)所述rm-p-cu2+的制备方法包括以下步骤：

24、通过超声细胞破碎仪将制备好的rbcm包裹mpda-p-cu2+，以供进一步使用，再将其与rbcm通过avanti微型挤出机(avanti polarlipids)以200nm、100nm的聚碳酸酯膜挤压10次，获得最终纳米颗粒。

25、进一步的，，步骤(2)中，红细胞膜提取全程保持洁净，通过细胞破碎提取得到；所述负载药物可为疏水性化合物或多肽、蛋白质、大分子多醣、维生素、谷胱甘肽任意一种。

26、进一步的，所述负载药物为阿霉素(dox)。

27、进一步的，mpda：pda的质量比为10：1，mpda-p：cucl2·2h2o的质量比为5：1，mpda-p-cu2+：rbcm的质量比为10：1，rm-p-cu2+：药物的质量比为2：1。

28、一种功能化修饰的氧化还原敏感型红细胞膜基-聚多巴胺纳米递送载体，其粒径范围在250-280nm。

29、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

30、①mpda具有粘附性、较好的生物相容性、可降解性、光热转换能力等，且其结构简单、细胞毒性低，具有丰富的表面积，其介孔空腔和疏水性苯环结构可以实现对dox等药物的有效包封和缓释，结构中存在丰富的官能团，易于功能化修饰，从而增强对肿瘤细胞的靶向性。

31、②rbcm的修饰使mpda具有良好的生物相容性，并有效延长在体内的循环时间。通过高渗透长滞留(epr)效应更好地聚集到肿瘤部位，有效增强药物靶向性，降低潜在毒性并实现特异性蓄积。

32、③cu2+在肿瘤微酸环境中可激活类芬顿反应(fenton-like reactions)，催化过量h2o2生成活性氧(ros)，发挥cdt疗效，并增强ptt的协同作用。

33、④rm-p-cu2+具有良好的氧化还原响应性，pda层具有良好的堵孔作用，降低药物在非靶点的释放，且在肿瘤微酸环境中发生连接键断裂，实现肿瘤响应性释放dox，使递药系统更好地实现协同治疗。