肝癌靶标、肝癌抑制试剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域；具体来说，本发明涉及肝癌靶标、肝癌抑制试剂及其应用。

背景技术：

1、肝癌是一种复杂性疾病，与多种危险因素密切相关。如黄曲霉毒素、饮酒和吸烟、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等危险因素都可能助长了肝癌的发生发展。由于肝癌恶性程度高，发展速度快，转移能力强，治疗后易复发。临床上，单纯的手术治疗、肝动脉结扎插管治疗、介入治疗、局部治疗、放射治疗等治疗手段均难以取得满意的效果。治疗药物方面，索拉非尼是抑制被批准治疗肝癌的药物。而一些研究表明，索拉菲尼辅助治疗并不能提高无复发生存率和总生存率；其它的多种治疗方案对于肝癌的疗效也并非理想或尚不完善。

2、作为肝癌的危险因素之一，乙型肝炎病毒(hbv)属于肝病毒科，是一种dna病毒，其基因组呈环状，长度在3200bp(pmid:32102898)。近些年，小核酸药物研发进展很快，为hbv相关疾病的治疗提供了新的方向，但是没有被批准临床用药的药物。目前的慢病hbv感染的主要研发策略是针对hbv病毒本身来制定，尚缺少用于阻断hbv病毒和人相互作用的关键靶点。此外，本领域尚没有找到与hbv基因组密切关联且对于肝癌的治疗具有作用的靶点。

3、因此，寻找治疗肝癌及阻断肝癌进程的新靶点及其靶向抑制剂迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供新型的肝癌靶标(治疗靶标或检测靶标)、肝癌抑制试剂及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸在制备(i)抑制肝癌及其进程的靶向试剂的用途；其中，所述的多核苷酸包括：(a)具有seq id no:1，seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸或与其同源的多核苷酸；或(b)(a)的多核苷酸的片段或变体。

3、在一种或多种实施方式中，所述变体或同源的多核苷酸为与所述seq id no:1，seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸相比，具有80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、95％以上、96％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.8％以上序列同一性的多核苷酸。

4、在一种或多种实施方式中，所述分离的多核苷酸不包括全长的病毒基因组序列。

5、在一种或多种实施方式中，所述分离的多核苷酸的序列长度为20～500，20～400，20～300，20～200，20～180或21～30bp(如21、23、25、26bp)。

6、在一种或多种实施方式中，所述seq id no:1，seq id no:2，seq id no:3，seq idno:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸被分别应用。

7、在一种或多种实施方式中，所述seq id no:1，seq id no:2，seq id no:3，seq idno:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸中的两条或多条被组合(如进行融合、串联或混合等)应用。

8、在一种或多种实施方式中，所述分离的多核苷酸包括seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸。

9、在一种或多种实施方式中，所述的抑制肝癌包括针对肝癌各个时期(包括早期、中期或晚期的肿瘤)的抑制，或其癌前病变。

10、在一种或多种实施方式中，所述的肝癌包括原位癌和转移癌。

11、在一种或多种实施方式中，(b)中，所述多核苷酸的片段为包括核心序列的片段；所述的核心序列包括：seq id no:7，seq id no:8，seq id no:9，seq id no:10和/或seqid no:11所示的核苷酸序列。

12、在一种或多种实施方式中，所述的靶向试剂为靶向抑制试剂，以所述多核苷酸为靶标，干扰或抑制该多核苷酸(如dna水平)、其转录本(如rna水平)或其翻译产物(如蛋白水平)的功能；较佳地，所述靶向抑制试剂包括(但不限于)：反义核苷酸(aso)、干扰分子(如sirna，mirna，shrna，dsrna等)、基因编辑试剂(如sgrna等)，或能表达或形成所述反义核苷酸、干扰分子、基因编辑试剂的构建物；较佳地，所述的靶向试剂为反义核苷酸，靶向于所述核心序列；更佳地，所述的反义核苷酸的序列如seq id no:13，seq id no:14，seq id no:15，seq id no:16，seq id no:17。

13、在一种或多种实施方式中，所述的靶向试剂抑制肝癌细胞的增殖，或抑制肝癌细胞的迁移/转移。

14、在本发明的另一方面，提供一种制备抑制肝癌及其进程的靶向试剂的方法，包括：

15、(1)提供分离的多核苷酸，包括：(a)具有seq id no:1，seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸或与其同源的多核苷酸；或(b)(a)的多核苷酸的片段或变体；较佳地，(b)中，所述多核苷酸的片段为包括核心序列的片段；所述的核心序列包括：seq id no:7，seq id no:8，seq id no:9，seq id no:10和/或seq id no:11所示的核苷酸序列；

16、(2)以(1)的多核苷酸作为靶标，设计特异性靶向该靶标的靶向试剂；所述的靶向试剂为靶向抑制试剂，以所述多核苷酸为靶标，干扰或抑制该多核苷酸、其转录本或其翻译产物的功能；较佳地，所述靶向抑制试剂包括(但不限于)：反义核苷酸(aso)、干扰分子(如sirna，mirna，shrna，dsrna等)、基因编辑试剂(如sgrna等)，或能表达或形成所述反义核苷酸、干扰分子、基因编辑试剂的构建物；较佳地，所述的靶向试剂为反义核苷酸，靶向于所述核心序列；更佳地，所述的反义核苷酸的序列如seq id no:13，seq id no:14，seq id no:15，seq id no:16，seq id no:17。

17、在一种或多种实施方式中，对于所述靶标，可以制备一组(针对其中一条多核苷酸)或多组(针对多条多核苷酸)靶向试剂。

18、在一种或多种实施方式中，所述的靶向试剂包括经修饰或未经修饰的核酸试剂。所述的修饰例如基于核酸链骨架修饰技术等手段进行，所述的修饰基本不改变寡核苷酸分子结合特性；优选那些能够提高核酸分子稳定性的修饰。例如，所述的修饰为du修饰，硫代修饰，或在核糖的2’位置进行烷基修饰。

19、在一种或多种实施方式中，所述肝癌是以hbv感染为诱发因素的肝癌。

20、在一种或多种实施方式中，所述肝癌是hbv病毒与感染者相互作用(如长期或持续的相互作用)导致的肝癌。

21、在本发明的另一方面，提供抑制肝癌及其进程的靶向试剂，其为靶向于分离的多核苷酸的靶向抑制试剂；其中，所述多核苷酸包括：(a)具有seq id no:1，seq id no:2，seqid no:3，seq id no:4和/或seq id no:5所示核苷酸序列的多核苷酸或与其同源的多核苷酸；(b)(a)的多核苷酸的片段或变体；较佳地，(b)中，所述多核苷酸的片段为包括核心序列的片段；所述的核心序列包括：seq id no:7，seq id no:8，seq id no:9，seq id no:10和/或seq id no:11所示的核苷酸序列；其中，所述靶向试剂为靶向抑制试剂，以所述多核苷酸为靶标，干扰或抑制该多核苷酸、其转录本或其翻译产物的功能；较佳地，所述靶向抑制试剂包括(但不限于)：反义核苷酸(aso)、干扰分子(如sirna，mirna，shrna，dsrna等)、基因编辑试剂(如sgrna等)，或能表达或形成所述反义核苷酸、干扰分子、基因编辑试剂的构建物。

22、在本发明的另一方面，提供所述的靶向试剂在制备抑制肝癌及其进程的药物组合物中的应用。

23、在本发明的另一方面，提供一种抑制肝癌的药物组合物或药盒，所述药物组合物中包括所述的靶向试剂；或，所述药盒中包括所述的药物组合物。

24、在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理表达或含有多核苷酸的体系；和(2)检测所述体系中所述多核苷酸的转录、表达或活性；其中，若所述候选物质可降低所述多核苷酸的转录、表达或活性(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是缓解或治疗肝癌的潜在物质。

25、在一种或多种实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达或含有所述多核苷酸的体系中。

26、在一种或多种实施方式中，步骤(2)包括：检测测试组的体系中所述多核苷酸的转录、表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有所述多核苷酸的体系。

27、在一种或多种实施方式中，如果测试组中所述多核苷酸的转录、表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是缓解或治疗肝癌的潜在物质。

28、在一种或多种实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(如表达所述多核苷酸的细胞，更特别如肝细胞或肝癌细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物(模型)体系。

29、在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述多核苷酸设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。

30、在一种或多种实施方式中，所述的体系为细胞体系、如肝癌细胞体系，所述方法还包括：进一步分析所述体系中肝癌细胞的增殖能力；若其增殖能力下降，则该候选物质是缓解或治疗肝癌的潜在物质。

31、在一种或多种实施方式中，所述的体系为细胞体系、如肝癌细胞体系，所述方法还包括：进一步分析所述体系中肝癌细胞的转移/迁移能力；若其转移/迁移能力下降，则该候选物质是缓解或治疗肝癌的潜在物质。

32、在一种或多种实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于缓解或治疗肝癌有用的物质。

33、在本发明的另一方面，提供一种抑制肝癌细胞(包括体内或体外(如分离的肝癌细胞(培养物)水平))的方法，包括：给予需要抑制的对象(包括动物或人的个体中的肝癌细胞，或分离的肝癌细胞(培养物))有效量的所述的靶向试剂或药物组合物。

34、在一种或多种实施方式中，所述抑制肝癌的方法包括非治疗性的方法。

35、在一种或多种实施方式中，所述的靶向试剂通过抑制肝癌细胞的增殖发挥作用。

36、在一种或多种实施方式中，所述的靶向试剂通过抑制肝癌细胞的迁移/转移发挥作用。

37、在本发明的另一方面，提供多核苷酸在制备进行肝癌检测的检测试剂或试剂盒中的用途。

38、在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增多核苷酸的检测试剂的用途，用于制备进行肝癌检测的试剂盒；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：特异性扩增所述多核苷酸的引物、特异性识别所述多核苷酸的探针或特异性识别所述多核苷酸的芯片。

39、在本发明的另一方面，提供一种制备进行肝癌检测的检测试剂的方法，包括：以多核苷酸为对象，制备特异性识别或扩增所述多核苷酸的试剂；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：特异性扩增所述多核苷酸的引物、特异性识别所述多核苷酸的探针或特异性识别所述多核苷酸的芯片。

40、在一种或多种实施方式中，所述的检测包括：将肝癌与其它肝脏疾病进行区分。

41、在一种或多种实施方式中，所述其它肝脏疾病包括：肝炎，肝硬化，肝纤维化。

42、在本发明的另一方面，提供一种诊断肝癌的方法，包括：应用特异性识别或扩增多核苷酸的检测试剂或试剂盒检测受试者离体样本(如疾病原位组织或体液组织(血液或血清等))中多核苷酸的存在量。

43、在一种或多种优选实施方式中，所述引物是如seq id no:19和seq id no:20所示序列的引物

44、在一种或多种实施方式中，所述方法包括：提取样本的总rna，逆转为cdna，crna合成和标记、杂交、洗涤、扫描、信号分析。

45、在一种或多种实施方式中，所述方法包括：提取样本的总rna，逆转为cdna，进行荧光pcr扩增，对扩增产物进行定性或定量。

46、在一种或多种实施方式中，判断时，与所述其它肝脏疾病相比，若待测样本中所述多核苷酸的表达显著更高(如与肝炎样本或肝硬化样本相比，存在如下的显著性差异：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)，则提示受试者罹患肝癌或存在肝癌患病风险/高危。

47、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。