本发明涉及适用于将一种或多种生物活性剂递送到细胞(例如，免疫细胞)的脂质组合物及制剂，以及使用该组合物和制剂的方法与试剂盒。
背景技术：
1、脂质复合物(诸如脂质纳米颗粒、脂质体)已被发现可在实验室研究和临床环境中用作递送载体，将大分子(诸如核酸、蛋白质)以及化学小分子或药物活性分子引入到细胞和组织中。
2、目前仍需要用于将生物活性有效载荷递送到免疫系统细胞(包括原代免疫细胞)中的改进的组合物和方法。本文提供了解决该需求及本领域其它需求的组合物和方法。
技术实现思路
1、在一个方面，本文提供了一种用于将有效载荷引入到免疫细胞中的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效载荷和包含至少一种可离子化脂质化合物的脂复合体(lipoplex)接触，从而将所述有效载荷引入到所述免疫细胞中；
2、具有结构i的所述至少一种可离子化脂质化合物，或其药学上可接受的盐，
3、
4、其中：
5、x1和x2中的每一者为独立地选自由o、s、n-w和c-w组成的组的部分，其中w选自由氢和c1-c20烃链组成的组；
6、y和z中的每一者为独立地选自由ch-oh、c＝o、c＝s、s＝o和so2组成的组的部分；
7、r1选自具有介于3个与约20个之间的碳原子和介于0个与约4个之间的双键的取代或未取代、支链或非支链烷基基团或烯基基团；
8、r2选自h或具有介于3个与约20个之间的碳原子和介于0个与约4个之间的双键的取代或未取代、支链或非支链的烷基基团或烯基基团；
9、a和b中的每一者选自由以下项组成的组：(cr4r5)n、(cr6r7)m、具有介于3个与约20个之间的碳原子的支链或非支链烷基基团，以及
10、具有介于3个与约20个之间的碳原子且具有介于1个与约4个之间的双键的支链或非支链烯基基团；
11、r4、r5、r6和r7中的每一者为独立地选自由以下项组成的组的部分：氢，环状或非环状、取代或未取代、支链或非支链的脂肪族基团；
12、x为整数，其独立地具有介于1与10之间(含端值)的值；
13、n为整数，其独立地具有介于1与3之间(含端值)的值；
14、m为整数，其独立地具有介于0与20之间(含端值)的值；
15、p为整数，其独立地具有0或1的值；并且
16、r3选自
17、
18、其中“hcc”代表直链或支链烷基、烯基或炔基烃链，其具有至多约20个碳原子；并且每个n*表示上述通式结构i中明确存在的氮原子n，其上连接有-a-y-x1-r1和-b-(z-x2)p-r2；并且其中每个g、e和f独立地为介于1与6之间的整数。
19、在另一方面，本文提供了用于将有效载荷递送到免疫细胞中的脂复合体组合物，其中所述脂复合体包含具有结构i的至少一种可离子化脂质化合物。
20、在一些实施方案中，所述至少一种可离子化脂质化合物具有结构ii，或其药学上可接受的盐，
21、
22、其中：
23、每个x1独立地选自o或nh；
24、n为0、1、2或3；
25、m为1、2或3；
26、p为0或1，并且当n＝p＝0时，r2为h。
27、在一些实施方案中，结构i的e为4，结构i的f和g为1，并且/或者结构i的n和m为2。在一些实施方案中，在结构i中，e为4，f和g为1，并且n和m为1、2或3。在一些实施方案中，至少一种可离子化脂质选自由化合物1至43组成的组。
28、在一些实施方案中，免疫细胞为t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞为辅助t细胞或细胞毒性t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞为原代细胞。在一些实施方案中，免疫细胞为人细胞。
29、在一些实施方案中，有效载荷包括至少一种核酸。在某些实施方案中，有效载荷包括rna分子。在一些实施方案中，rna分子包括mrna、sirna、shrna、mirna、自我复制rna(srrna)、自我扩增rna、strna、sgrna或其组合。在一些实施方案中，rna分子包括多于一个mrna分子。
30、在一些实施方案中，核酸或rna编码嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，rna编码基因编辑蛋白。在一些实施方案中，rna编码选自cas蛋白、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指核酸酶和重组酶的基因编辑蛋白。在一些实施方案中，核酸有效载荷包括sgrna和编码基因编辑蛋白的rna。
31、在一些实施方案中，有效载荷包括基因编辑蛋白。在一些实施方案中，有效载荷基因编辑蛋白选自cas蛋白、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指核酸酶和重组酶。在一些实施方案中，有效载荷包括核糖核蛋白。在一些实施方案中，有效载荷核糖核蛋白包含cas蛋白和sgrna。
32、在一些实施方案中，脂复合体的至少一种可离子化脂质包含可生物降解的键(biodegradable linkage)。在一些实施方案中，脂复合体中的至少一种可离子化脂质具有pka在约4至约8范围内的可质子化基团。在一些实施方案中，脂复合体中的至少一种可离子化脂质具有pka在约5至约7.5范围内的可质子化基团。在一些实施方案中，脂复合体中的至少一种可离子化脂质在低于生理ph的ph下带正电荷。
33、在一些实施方案中，脂复合体包含至少一种辅助脂质。在一些实施方案中，脂复合体包含辅助脂质，该辅助脂质选自由以下项组成的组：胆固醇、甾醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(dphpe)、溶血磷脂酰乙醇胺(lyso-pe)(1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、溶血磷脂酰胆碱(lyso-pc)(1-酰基-3-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式dope)或其组合。
34、在一些实施方案中，脂复合体包含至少两种不同的辅助脂质。在一些实施方案中，脂复合体的两种辅助脂质中的至少一种为甾醇。在一些实施方案中，脂复合体的两种辅助脂质中的至少一种为磷脂。
35、在一些实施方案中，脂复合体包含第二可离子化脂质。在一些实施方案中，脂复合体包含至少一种稳定剂。在一些实施方案中，脂复合体的至少一种稳定剂选自表面活性剂、聚合物缀合脂质和聚乙二醇。在一些实施方案中，脂复合体的至少一种稳定剂为聚乙二醇化磷脂。在一些实施方案中，脂复合体包含具有结构i的至少一种可离子化脂质化合物、至少一种辅助脂质和至少一种稳定剂。
36、在一些实施方案中，脂复合体包含融合剂。在一些实施方案中，脂复合体包含融合剂，该融合剂包含聚阳离子核酸结合部分。在一些实施方案中，脂复合体包含融合剂，该融合剂为肽。在一些实施方案中，脂复合体包含核内体释放剂。
37、在一些实施方案中，脂复合体包含核定位肽。在一些实施方案中，脂复合体包含核定位肽，该核定位肽包含聚阳离子核酸结合部分。在一些实施方案中，脂复合体包含细胞靶向剂。在一些实施方案中，脂复合体包含细胞靶向剂，该细胞靶向剂包含聚阳离子核酸结合部分。在一些实施方案中，脂复合体包含细胞靶向剂，该细胞靶向剂为细胞表面配体。在一些实施方案中，脂复合体包含外泌体，或源自或分离自外泌体的生物材料。
38、在一些实施方案中，有效载荷为核酸分子，可离子化脂质包含电荷n且核酸分子包含电荷p，并且接触细胞的可离子化脂质与核酸的组合包含约5至60的n/p比。在一些实施方案中，接触细胞的可离子化脂质与核酸有效载荷包含约1至20的n/p比。
39、在一些实施方案中，至少一种可离子化脂质以约0.10至约0.70的组成摩尔比存在于脂复合体中。在一些实施方案中，至少一种辅助脂质以约0.10至约0.90的组成摩尔比存在于脂复合体中。在一些实施方案中，至少一种稳定剂以约0.005至约0.10的组成摩尔比存在于脂复合体中。
40、在所提供的方法的一些实施方案中，免疫细胞与有效载荷和脂复合体的接触离体或在体外发生。在一些实施方案中，免疫细胞与有效载荷和脂复合体的接触在体内发生。
41、在所提供的方法的一些实施方案中，在接触期间，免疫细胞处于免疫细胞群中，并且在接触后，将免疫细胞群培养一时间段，其中免疫细胞群的存活率在该时间段内保持超过60％。在一些实施方案中，免疫细胞群的存活率在该时间段内保持超过70％。在一些实施方案中，免疫细胞群的存活率在该时间段内保持超过80％。在一些实施方案中，在接触之后，将免疫细胞群培养约1天至约14天。
42、本发明的其它方面在下文公开。
43、附图简要说明
44、图1a至1b为描绘转染包含编码荧光素酶的mrna的脂复合体组合物后，活化t细胞中的发光强度(以相对光单位(rlu)表示)(图1a)和相对细胞存活率(图1b)的图。t细胞转染100ng或300ng rna。所描绘的细胞存活率是相对于设定为100％的hela细胞对照的细胞存活率而言的。
45、图2a至2c为描绘转染包含编码gfp的mrna的脂复合体组合物后的转染效率(图2a)、细胞存活率(图2b)和gfp荧光强度(以平均荧光强度(mfi)表示，图2c)的图。
46、图3a至3b为描绘在存在或不存在apoe4的情况下转染lp1后的转染效率(图3a)和细胞存活率(图3b)的图。
47、图4a至4b为描绘转染携带编码sgrna和cas9的mrna的脂复合体组合物的活化t细胞中的tcr基因敲除的密度图。细胞分别转染了100、300、400或500ng rna，并在转染后2天(图4a)或转染后5天(图4b)测定了细胞上的tcr表达。对照密度图来自未转染的t细胞。
48、图5a至5b为描绘与未转染对照细胞比较，转染包含编码gfp的mrna的lp1或messengermax组合物后，成熟树突状细胞的转染效率(图5a)和细胞存活率(图5b)的图。每一者的x轴下标示了转染反应中所用的mrna的量(50或100ng)和脂质类试剂的量。
49、图6a至6b为描绘转染包含编码gfp的mrna(100ng、150ng或200ng)的脂复合体组合物lp1后nk细胞的转染效率(图6a)和细胞存活率(图6b)的图。