一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法与流程

本发明涉及间充质干细胞制剂，具体涉及一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法。

背景技术：

1、间充质干细胞为一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。

2、间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有以下特性：具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制t细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性；表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。

3、由于间充质干细胞所具备的上述特性，间充质干细胞在临床治疗中得到广泛应用，例如将间充质干细胞分化为骨、软骨、肌肉或肌腱，为临床治疗各种创伤提供细胞来源；将间充质干细胞分化为心肌组织，治疗心脏类疾病；将间充质干细胞分化为真皮组织，用于促进皮肤伤口愈合。

4、此外，间充质干细胞的外泌体在促进皮肤修复中还具有多重好处。第一，间充质干细胞分泌的外泌体能够刺激细胞再生；第二，间充质干细胞的外泌体能够降低受损皮肤的炎症反应，减轻受损皮肤周围组织的炎症程度，从而减少局部皮肤的肿胀和疼痛；第三，间充质干细胞的外泌体还具有免疫调节作用，有助于平衡免疫系统的功能，防止免疫过度活跃导致的瘢痕形成。因此，将间充质干细胞的外泌体制成间充质干细胞修复制剂，是皮肤修复制剂领域的重点研发方向。

5、但是目前在制备间充质干细胞修复制剂的过程中存在以下问题：间充质干细胞分泌的外泌体中的成分释放速度慢，从而导致使用初期对皮肤修复的提高效果不明显；间充质干细胞的外泌体的耐储存能力差，在长期储存中易失效；间充质干细胞的外泌体在使用时，易受微生物影响，导致间充质干细胞的外泌体的功能受到抑制。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法，制备的间充质干细胞修复制剂能够提高皮肤修复速度，在长期储存中不易失效，在使用时受微生物影响小。

2、为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：

3、一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，由以下步骤组成：制备多功能载体，制备交联微球，制备外泌体，组合；

4、所述制备多功能载体，由以下步骤组成：制备纤维蛋白原溶液，制备聚赖氨酸溶液，制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，负载；

5、所述制备纤维蛋白原溶液，将纤维蛋白原加入去离子水中，搅拌均匀，得到纤维蛋白原溶液；

6、所述制备纤维蛋白原溶液中，纤维蛋白原与去离子水的质量体积比为3-4g:85-90ml；

7、所述制备聚赖氨酸溶液，将ε-聚赖氨酸加入去离子水中，搅拌均匀，得到聚赖氨酸溶液；

8、所述制备聚赖氨酸溶液中，ε-聚赖氨酸与去离子水的质量体积比为0.4-0.5g:8-9ml；

9、所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，将三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水中，搅拌均匀，加入氢氧化钠水溶液调节ph为4.5-5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；

10、所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液中，三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水的质量体积比为5-5.5g:90-100ml；

11、所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为10-11%；

12、所述负载，将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，搅拌均匀，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌，加入二氧化钛纳米管、海藻酸钠，继续搅拌，滴加氯化钙水溶液，滴加结束后继续搅拌，过滤，将滤渣冷冻干燥，得到多功能载体；

13、所述负载中，所述聚赖氨酸溶液中的ε-聚赖氨酸、所述纤维蛋白原溶液中的纤维蛋白原、所述三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液中的三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐、二氧化钛纳米管、海藻酸钠、氯化钙水溶液的质量体积比为0.4-0.5g:3-4g:5-5.5g:9-10g:5-6g:30-35ml；

14、所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；

15、所述氯化钙水溶液的质量浓度为5-6%，滴加速度为4-5g/min；

16、所述制备交联微球，由以下步骤组成：制备白蛋白-壳聚糖微球，表面交联；

17、所述制备白蛋白-壳聚糖微球，由以下步骤组成：制备白蛋白分散液，制备羟丙基壳聚糖溶液，混合交联；

18、所述制备白蛋白分散液，将牛血清白蛋白粉末加入去离子水中，搅拌，加入无水乙醇，继续搅拌，得到白蛋白分散液；

19、所述制备白蛋白分散液中，牛血清白蛋白粉末、去离子水、无水乙醇的质量体积比为0.25-0.3g:200-250ml:820-850ml；

20、所述制备羟丙基壳聚糖溶液，将羟丙基壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，得到羟丙基壳聚糖溶液；

21、所述制备羟丙基壳聚糖溶液中，羟丙基壳聚糖加入去离子水的质量体积比为2.3-2.5g:1000-1100ml；

22、所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；

23、所述混合交联，将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，搅拌，离心，冷冻干燥，得到白蛋白-壳聚糖微球；

24、所述混合交联中，所述白蛋白分散液中的牛血清白蛋白粉末与所述羟丙基壳聚糖溶液中的羟丙基壳聚糖的质量比为0.25-0.3:2.3-2.5；

25、所述表面交联，将大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸加入去离子水中，搅拌，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌，加入白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌，离心，冷冻干燥，得到交联微球；

26、所述表面交联中，大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸、去离子水、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、白蛋白-壳聚糖微球的质量体积比为0.35-0.4g:0.5-0.55g:0.65-0.7g:60-65ml:0.38-0.4g:0.2-0.22g:2.8-3g；

27、所述大分子透明质酸的分子量为180-200万道尔顿；

28、所述中分子透明质酸的分子量为100-120万道尔顿；

29、所述小分子透明质酸的分子量为2000-5000道尔顿；

30、所述制备外泌体，从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红dmem培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到75-80%时，使用pbs缓冲液清洗细胞2-3次，然后加入无酚红dmem培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到90-95%时，对上清液进行离心，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体；

31、所述组合，将外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶混合后，搅拌，得到间充质干细胞修复制剂；

32、所述组合中，外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶的质量体积比为100-110ml:1-1.2g:2-2.5g:1.5-2g:0.5-0.6g:1-1.5g:0.1-0.2g。

33、一种间充质干细胞修复制剂，由前述的制备方法制得。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

35、（1）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够提高皮肤修复速度，在用于大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够所有大鼠完全愈合，且无瘢痕；

36、（2）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够保证在长期储存中不易失效，在2℃下储存180d后再用于大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够保证80%以上的大鼠完全愈合，且无瘢痕；

37、（3）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够保证在长期储存中不易失效，在用于受到金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够保证80%以上的大鼠完全愈合，且无瘢痕。