猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用

本发明属于生物技术及兽用疫苗领域，具体涉及猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用。

背景技术：

1、由胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae,app)引起的猪传染性胸膜肺炎(pocontagious pleuropneumonia,pcp)是一种严重的猪传染性疾病，常呈急性爆发，死亡率高，给全世界的养猪业带来了极大的危害(nahar et al.,2021)。该病具有高度传染性，临床上以失血性、纤维性和坏死性肺炎为特征。app为革兰氏阴性短杆菌，呈显著的多形性和两极着色性。菌体有荚膜，无芽孢，不运动，为兼性厌氧菌。该菌依据生长过程中是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷可将app分为两个生物型：生物ⅰ型和生物ⅱ型。依据app荚膜抗原和脂多糖的差异，又可将生物ⅰ型分为17个血清型，生物ⅱ型含有两个血清型。我国已分离到的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10型，血清型较多，其中血清1型、2型、3型和7型为主要的流行血清型(朱秀高and李艳青,2017)。由于该病的病程急，病原菌耐药问题严重，抗生素治疗效果不佳，同时，随着我国减抗禁抗政策的出台，因此疫苗接种是防控该病的重要手段之一。

2、由于app血清型众多，各型之间无很好的交叉反应(姚建聪et al.,2003)，同时随着时间的推移，各个地区之间流行的优势血清型也会发生变化，也会增大疫苗研发的难度。全菌灭活疫苗是预防此病最有效的第一代疫苗，但是这种疫苗仅能对同种血清型产生保护，并不能提供交叉保护效果(kim et al.,2011)。自家苗因法规和生物安全问题，仅限于感染此病的农场使用，对疾病的防控具有局限性。减毒活疫苗可对免疫后动物产生免疫保护，但是其可能会恢复毒力还原为强毒，存在一定风险，目前仍未广泛被应用(zhou etal.,2016)。

3、针对猪传染性胸膜肺炎，国内现有疫苗几乎均为灭活疫苗，但灭活苗中app分泌的外毒素成分含量少也是免疫效果不好的原因，因此有关外毒素的研究已成为该病的研究重点，灭活疫苗如科前生物的科肺宁，其抗原包括1、2、7型app，菌体抗原浓度高，副反应大；也存在一些亚单位疫苗，如默沙东的亚单位疫苗爱普克，但其疫苗价格昂贵，提高养殖成本，同时纯亚单位疫苗由于缺少lps等细胞壁成分而缺乏一般的保护能力。

4、溶血外毒素(apx)是app的主要毒力因子之一，apx毒素分别为apxi、apxii、apxiii及apxiv(frey et al.,1991；hathroubi et al.,2018)。除了apxⅳ毒素在所有血清型中都存在外，其他3种只被某些血清型合成并分泌，血清型1、5、9、11分泌apxⅰ、apxⅱ，血清型2、3、6、8分泌apxⅱ、apxⅲ，10型分泌apxⅰ，7、12型分泌apxⅱ，apx毒素不仅是该菌致病的主要毒力因子，同时也可作为app的主要保护性抗原(ito and sueyoshi,2015)。

5、在近30年间，国内外学者都致力于探究apx毒素对免疫及对app保护的影响，最早在1998年就有文献指出含有apx毒素的亚单位疫苗可以抵抗app9型的感染(chiers etal.,1998)；2006年我国科学家利用原核外源表达了rapxⅰ以及rapxⅱ，并证明了其在小鼠与兔子的免疫中具有良好的免疫保护效果(王春来et al.,2006；严克霞et al.,2006)；近15年来，大量国内高校的研究生在研究apx毒素方面取得了显著的进展，并且他们的研究结果表明，apx毒素具有良好的免疫效果，但无一例外，他们的研究中apx毒素无论是截短还是进行全长表达，表达出的apx毒素均在包涵体中，需要对其变性后进行包涵体纯化(胡辉灿,2019；李鹏,2017；龙剑,2020；宋丹et al.,2019；田瑾,2019；吴东,2014；余光勇,2008；周家强,2013)，或者是通过体外大量培养app，回收其培养上清再将其纯化回收(华方根,2012；马艳芳,2009)，这两种方法都具有很明显的弊端，其产量较低，不适合进行大规模生产。同时经过包涵体纯化后的蛋白其空间构象有可能会发生改变，导致其抗原决定簇发生改变，降低部分免疫原性。还有学者将截短apx毒素作为表面展示抗原，表达在酿酒酵母表面，经口服给药方式，以达到猪对app攻毒的免疫(shin et al.,2013)。这些大量工作的目的都是为了通过获得apx毒素，通过免疫的方式，使猪群获得较好保护效果。

6、在亚单位疫苗中，通常情况下，完整的蛋白会具有更好的免疫效果。这是因为完整的蛋白包含了所有的抗原决定簇，可以激发更广泛的免疫反应。相比之下，截短的蛋白只包含部分抗原决定簇，可能无法激发同样广泛的免疫反应。在上述研究中，虽然其证明了apx毒素具有良好的免疫效果，却无法通过更好的手段将其完整表达并进行纯化回收。

7、针对上述问题，本发明成功对apxi及apxⅱ进行了全长的外源表达，该蛋白可溶性高，并且表达在上清，与筛选出的app1型强毒力菌株进行混合，制备了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，该疫苗可以提供更多更丰富的细胞壁抗原，还可以通过apxⅰ与apxⅱ诱导强大的细胞介导的免疫反应，达到针对app多种血清型的保护能力，为猪传染性胸膜肺炎的免疫防控提供全面的解决方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，该疫苗包括两个重组融合蛋白和灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌app2022116，分别为rapxⅰ(氨基酸序列为seq id no.1)、rapxⅱ(氨基酸序列为seq id no.2)和保藏编号为cctcc no：m20231360猪胸膜肺炎放线杆菌。

2、本发明的另一个目的在于提供了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗中的应用。

3、为了实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、申请人通过毒力测定，从100多株菌株中筛选出一株血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌，其毒力较强，免疫原性佳，同时具有针对国内流行血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌的交叉保护效果，针对app1型和app7型菌株的攻毒保护率分别为80％和100％。

5、申请人于2023年7月21日将该菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：actinobacillus pleuropneumoniae app2022116，保藏编号：cctcc no：m20231360，地址：中国武汉武汉大学。

6、该菌株的培养和形态特征如下：

7、菌株app2022116的细胞形态为球杆状，有时呈线装或多形性，无鞭毛，不具有运动性，直径约为0.5nm～2.0nm，长度约为60nm～450nm。培养时营养要求较高，需在含有10％新生牛血清、0.01％nad的tsa平板，37℃的培养箱中生长，会形成圆形，边缘完整光滑，具有淡蓝色荧光的菌落。

8、本发明的保护范围包括：

9、猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，所述的疫苗包括：seq id no.1所示的rapxⅰ蛋白、seq id no.2所示的rapxⅱ蛋白和灭活的1型猪胸膜肺炎放线杆菌，所述的1型猪胸膜肺炎放线杆菌的保藏编号为cctcc no：m20231360。

10、以上所述的疫苗优选的：所述的rapxⅰ蛋白或rapxⅱ蛋白的制备方法包括：

11、将编码seq id no.1或seq id no.2所示蛋白的多核苷酸连接至载体pcold-tf获得重组载体，然后导入e.coli bl21(de3)中进行诱导发酵，发酵上清中即获得对应蛋白；

12、以上所述的制备方法，优选的，编码seq id no.1蛋白的多核苷酸为seq id no.3所示；编码seq id no.2蛋白的多核苷酸为seq id no.4所示。

13、以上所述的制备方法，优选的，发酵诱导表达条件为16℃，加入终浓度为1mm的iptg，170rpm诱导表达24h。

14、以上所述的制备方法，优选的，获得发酵上清后，按照下述方法分离纯化蛋白：

15、调整上样缓冲液的ph值为11，利用含有大孔径阴离子交换填料rigose-deae的预装柱，通过akta pure25蛋白质层析纯化系统进行上样，上样流速为1ml/min，在上样过程中上清中的杂蛋白与阴离子交换填料结合，目的蛋白在上样流穿中留存，收集流穿后使用10000mwco超滤管，通过超滤浓缩的方式获得apxia或apxiia蛋白。

16、本发明的保护范围还包括：胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗中的应用，所述的应用包括以胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗为唯一有效成分或有效成分之一，制备成猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗。

17、胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备治疗或预防猪胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的应用。

18、以上所述的应用，优选的，所述的猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型和/或7型。

19、以上所述的应用，优选的，所述的疫苗剂型为现有技术中的任何剂型。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果：

21、(1)本发明使用e.coli原核表达猪胸膜肺炎放线杆菌的全长外毒素apxⅰa与apxⅱa，本发明这中的两种蛋白经过优化均成功实现可溶性表达，同时申请人建立了该蛋白的分离纯化方法，易于大量生产，降低生产成本。

22、(2)本发明中从100多株菌株中筛选出一株血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌，其毒力较强，免疫原性佳，同时具有针对国内流行血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌的交叉保护效果，针对app1型和app7型菌株的攻毒保护率分别为80％和100％。

23、(3)本发明将可溶性表达的apxⅰa与apxⅱa与猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型灭活全菌进行组合，能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。较之于单独使用app2022116进行免疫，本发明的组合型疫苗提高了对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型毒株的抵抗力，针对app1型和app7型菌株的攻毒保护率均为100％。

24、(4)本发明为高效、低廉、广谱的猪传染性胸膜肺炎疫苗的研制奠定了基础，为猪传染性胸膜肺炎的防治提供了有效的技术手段。