本发明属于中药学以及药物制剂领域，特别涉及一种红豆杉籽中抗肿瘤活性部位的提取分离纯化方法和将抗肿瘤活性部位制备成脂质体雾化器的制备方法。
背景技术：
1、肺癌是全球第二大常被诊断出的癌症，据统计，2020年全球范围内就有220万新的病例，其中非小细胞肺癌占比为85％，并且非小细胞肺癌患者在整个疾病期间会发生脑转移的就占有25-40％。此外，26.8％和15.9％的肺腺癌和鳞状细胞癌患者最初表现为脑转移。目前治疗肺癌的传统手段主要是手术切除、化疗和靶向治疗。在晚期和存在肺癌转移性扩散(iii期和vi期非小细胞肺癌以及在非常早期未发现癌症时的小细胞肺癌)的情况下，肿瘤可切除性通常受到限制。铂类化疗(如顺铂和卡铂)被认为是晚期非小细胞肺癌的标准治疗方法，通常与紫杉烷类药物(如紫杉醇、多西他赛等)和吉西他滨联合使用，而化疗存在一些局限性，如半衰期短、水溶性差、清除快和非特异性分布，以及它们可能会产生的全身毒性和不良反应。靶向治疗是抑制癌症特异性驱动突变的药物，经常使用也会出现耐药性。因此近年来，研究者们都在寻找新的途径去治疗肺癌。
2、红豆杉(t.brevifalia nutt.)是世界公认的天然珍稀抗肿瘤植物之一。多年以来，对红豆杉的枝、树皮、叶、根和茎的研究较多，而国内外对红豆杉籽的研究及应用的较少。红豆杉籽作为可再生资源，具有产量大，易获取，保存时间长等优势，是值得去研究的。对红豆杉籽进行提取纯化得到红豆杉籽提取物，而根据文献报道，中药提取物具有高吸湿性结构、低溶解度、生物利用度差等缺点，因此中药提取物的直接使用受到限制。因此本文将以红豆杉籽作为研究对象，筛选出抗肿瘤活性较好的部位，然后采用纳米制剂手段改善其作为中药提取物的局限性，以提高其溶解度、生物利用度和降低毒性。
3、脂质体作为纳米制剂的一种，具有脂质双分子层结构，能够在其结构中保持亲水性、疏水性和两亲性分子。简而言之，亲水性提取物嵌入水相中，而两亲性和亲脂性成分沉降在脂质体的脂质双层中，以尽量减少中药提取物中活性成分的损失。因此脂质体是最合适用于中药提取物的纳米给药系统。
4、对于肺癌治疗，尽管基于主动和被动靶向的全身给药策略已经得到显著发展，但副作用仍然是不可避免的。作为全身给药的替代方法，肺部吸入给药系统具有许多优点，如增加肺癌病变部位的药物浓度和减少全身副作用。此外，由于肺部给药的无创性，患者可以避免静脉注射或腹腔注射。但是吸入化疗药物会增加其在肺部的局部浓度，从而增加肺毒性的风险。此外，一旦治疗剂沉积在肺中，立即开始消除治疗剂。这种快速衰减通常需要每天多次吸入，这不可避免地会影响患者的依从性。可吸入纳米制剂能改善可吸入肺癌治疗的缺点，因为它们能够与药物高度结合并维持其释放，以及它们能高效靶向肺部癌症组织。它们还具有有效地转移到气溶胶中的能力，并能高度承受雾化力。此外，纳米制剂可以避免粘液纤毛清除和肺吞噬机制，从而延长治疗剂在肺部的停留时间。
5、本发明就是针对现有对红豆杉籽抗肿瘤活性研究不足以及现有肺癌治疗技术的局限性，而提供的一种红豆杉籽和脂质体雾化器在肺癌领域的临床研究和应用的方案。该方案主要是红豆杉籽中提取分离纯化得到抗肿瘤效果较好的部位，并对活性部位的主要成分进行分析；将活性部位制备成脂质体雾化器，并进行了一系列体内外的研究。
技术实现思路
1、本发明就是针对现有对红豆杉籽抗肿瘤活性研究不足以及现有肺癌治疗技术的局限性，提供一种红豆杉籽和脂质体雾化器在肺癌领域的临床研究和应用的方案。该方案主要是红豆杉籽中提取分离纯化得到抗肿瘤效果较好的部位，并对活性部位的主要成分进行分析；将活性部位制备成脂质体雾化器，并进行了一系列体内外的研究。本发明目的是提高红豆杉籽在抗肿瘤领域的研究与应用，针对现有肺癌治疗手段的半衰期短、水溶性差、清除快、非特异性分布和耐药性等问题，提供一种红豆杉籽中抗肿瘤活性部位的脂质体雾化器的制备方法，为肺癌的治疗拓宽思路。
2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种红豆杉籽抗肿瘤活性部位，采用以下步骤制备而成：
3、(1)将豆杉籽粉碎后过筛，用石油醚浸泡脱脂后，抽滤、干燥、过筛，加入乙醇溶液进行提取，对提取物进行离心，滤液浓缩至干，得红豆杉籽提取物；
4、(2)将红豆杉籽提取物用活化后的ab-8大孔树脂层析柱进行吸附分离，采用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液并浓缩至干；
5、(3)将步骤(2)得到的浓缩物采用硅胶柱层析纯化，采用二氯甲烷与甲醇体系进行洗脱，收集洗脱物浓缩至干即得红豆杉籽抗肿瘤活性部位。
6、进一步的，步骤(1)中的乙醇溶液的体积浓度为60％，提取条件为在60℃温度下提取40min。
7、进一步的，步骤(1)中的对提取物进行离心，滤液浓缩至干，具体采用以下步骤：离心采用4000r/min，10min，对上清液进行过滤，得滤液；提取后的红豆杉籽残渣重复上述操作再提取一次，合并滤液，滤液50℃减压浓缩至干.
8、进一步的，步骤(2)中的洗脱剂为体积浓度为40％～80％的乙醇溶液，料液质量比为1:40～60，提取时间为30～50min，提取温度为40～70℃。
9、进一步的，步骤(3)中的硅胶柱采用的硅胶粉为300～400目。
10、进一步的，步骤(3)中的二氯甲烷与甲醇的体积比为40：1。
11、一种抗肿瘤活性部位脂质体，包括上述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位、蛋黄卵磷脂和胆固醇。
12、进一步的，蛋黄卵磷脂与红豆杉籽抗肿瘤活性部位的质量比为(0.5～3)：1；蛋黄卵磷脂-胆固醇质量比为(1～8)：1。
13、一种上述抗肿瘤活性部位脂质体的制备方法，称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、红豆杉籽抗肿瘤活性部位，加入无水乙醇超声使其溶解并混合均匀，用注射器吸取上述溶液后，缓慢连续的注入到不断搅拌的超纯水中，磁力搅拌1h，减压旋蒸除去无水乙醇，并将脂质体溶液浓缩，即得抗肿瘤活性部位脂质体混悬液。
14、一种抗肿瘤活性部位脂质体雾化器，所述雾化器通过将上述的抗肿瘤活性部位脂质体的混悬液装入网式雾化器中而制成。
15、本发明的有益效应
16、1、本发明红豆杉籽活性部位提取方法简单，易操作，分离纯化方法分离效果较好，在控制好乙醇、甲醇、石油醚回收后可以降低生产成本，基本无环境污染。
17、2、本发明脂质体的制备方法简单、易操作，成本低，同时避免了有毒溶剂的使用；制备的脂质体粒径115nm左右。脂质体在不同溶出介质的累积溶出度在15min时均已达到80％以上，且在1h时其累积释放度已经达到平台期，药物基本释放完全。显著地提高了红豆杉籽抗肿瘤活性部位的溶解性、体外释放度。
1.一种红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于采用以下步骤制备而成：
2.根据权利要求1所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于：所述步骤(1)中的乙醇溶液的体积浓度为60％，提取条件为在60℃温度下提取40min。
3.根据权利要求1所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于：所述步骤(1)中的对提取物进行离心，滤液浓缩至干，具体采用以下步骤：离心采用4000r/min，10min，对上清液进行过滤，得滤液；提取后的红豆杉籽残渣重复上述操作再提取一次，合并滤液，滤液50℃减压浓缩至干。
4.根据权利要求1所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于：所述步骤(2)中的洗脱剂为体积浓度为40％～80％的乙醇溶液，料液质量比为1:40～60，提取时间为30～50min，提取温度为40～70℃。
5.根据权利要求1所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于：所述步骤(3)中的硅胶柱采用的硅胶粉为300～400目。
6.根据权利要求1所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位，其特征在于：所述步骤(3)中的二氯甲烷与甲醇的体积比为40：1。
7.一种抗肿瘤活性部位脂质体，其特征在于包括：权利要求1至6任一所述的红豆杉籽抗肿瘤活性部位、蛋黄卵磷脂和胆固醇。
8.根据权利要求7所述的抗肿瘤活性部位脂质体，其特征在于：所述蛋黄卵磷脂与红豆杉籽抗肿瘤活性部位的质量比为(0.5～3)：1；蛋黄卵磷脂-胆固醇质量比为(1～8)：1。
9.一种根据权利要求7或8所述抗肿瘤活性部位脂质体的制备方法，其特征在于：称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、红豆杉籽抗肿瘤活性部位，加入无水乙醇超声使其溶解并混合均匀，用注射器吸取上述溶液后，缓慢连续的注入到不断搅拌的超纯水中，磁力搅拌1h，减压旋蒸除去无水乙醇，并将脂质体溶液浓缩，即得抗肿瘤活性部位脂质体混悬液。
10.一种抗肿瘤活性部位脂质体雾化器，其特征在于：所述雾化器通过将权利要求7或8所述的抗肿瘤活性部位脂质体的混悬液装入网式雾化器中而制成。