本发明属于医用材料，尤其涉及一种非冷冻干燥的雾化喷涂交联干态羊膜及其制备方法。
背景技术：
1、羊膜是胚胎发育过程中形成的一种具有多重特性的薄膜，它为胚胎提供了一个保护和适宜的生长环境。羊膜由上皮层、基底层和基质层组成，其上皮细胞具有抗炎和抗菌的特性，同时低免疫原性使其在移植时不易引起排斥反应。此外，羊膜能够促进上皮细胞的增殖和迁移，抑制纤维化，减少瘢痕形成，并且能够分泌多种生物活性物质，如生长因子和细胞因子。这些独特的特征使得羊膜在医学治疗中，尤其是在眼科、骨科、皮肤科领域以及抗癌领域，都有着广泛的应用前景。
2、现有羊膜产品保存方法主要为超低温（-75℃至-85℃）或冷冻干燥保存，超低温保存羊膜需要冷链运输及配备超低温冰箱，导致其推广应用受限。
3、冷冻干燥保存技术公开技术资料如下：
4、如申请号为cn201710090417.5的发明专利《交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用》公开了一种交联脱细胞羊膜、复合型皮肤替代物及其制备方法和应用。所述交联脱细胞羊膜的制备方法包括如下步骤：将脱细胞羊膜浸泡于25~35ml mes缓冲液中55~65min；向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入水溶性碳二亚胺，并使碳二亚胺的浓度为0.01~0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速28~32rpm，交联反应1~10min；最后用蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即可获得交联完成后的羊膜。
5、然而，冷冻干燥羊膜脆性大，不利于其临床的推广应用，因此，亟需开发新型非冷冻干燥干态羊膜制备技术。
6、非冷冻干燥干态羊膜制备技术相关公开的技术资料如下：
7、专利申请号为cn202310187395.x的发明专利《一种干态羊膜的制备方法及应用》公开的一种干态羊膜的制备方法，其具体步骤如下：（1）增韧处理：将新鲜羊膜与含有a-b结构单元的化合物进行第一步反应，然后将含有碳碳双键结构单元的羊膜与含碳碳双键结构单元的小分子及生物大分子的混合物c在引发剂的参与下进行第二步反应；（2）增厚及亲水处理：将羊膜浸泡于亲水大分子物质溶液中增厚；（3）促进组织再生处理：将羊膜浸泡于促进组织再生物质溶液中进行处理；（4）干燥处理：在醇溶液中梯度脱水后进行干燥处理；（5）辐照灭菌：将(4)步骤处理后的干态羊膜，采用电离辐射灭菌处理，即得到干态羊膜产品。
8、申请号为cn201610303279.x的发明专利《一种易保存生物羊膜的制备方法》公开的一种易保存生物羊膜的制备方法，该专利中制备易保存羊膜的具体工艺为：（1）取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4~6％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23~25khz下振荡50~70min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液ph为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3~5％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30~35℃下酶解5~7h；（2）待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于丙三醇中，于4~6℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5~7次，得粗生物羊膜，备用；（3）按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入ph为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30~40％，搅拌均匀并静置10~15min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50~60％茶多酚、壳聚糖质量1~3％酪蛋白及酪蛋白质量10~15％的过硫酸铵；（4）在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50~60℃，以150r/min搅拌4~7h后，向其中加入上述壳聚糖质量2~4％甲壳素，搅拌均匀，将步骤（3）所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10~12h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5~7次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
9、另外，羊膜厚度仅有0.02~0.5mm，力学强度较差，在临床应用中很容易发生撕裂、破损，导致其目前仅适用于小面积的组织修复手术，如何提高其力学强度成为一个亟需解决的问题。
10、为了提高羊膜材料的力学强度，通常可以采用交联试剂对其进行交联处理。现有羊膜交联技术相关文献资料如下：
11、申请号为tw95149902的专利《交联化羊膜做为生医材料之方法》，该专利交联化处理之步骤包括：制备edc(氮(3二甲基氮基)1乙基氮甲基盐酸)(2%)溶液：先配制100ml醋酸水溶液，再将edc(氮(3二甲基氮基)1乙基氮甲基盐酸)(2wt%)粉末加入醋酸水溶液中混合；羊膜进行交联：将制备edc(氮(3二甲基氮基)1乙基 氮甲基盐酸)(2%)立刻放入羊膜进行交联，并将交联后之溶液以0.5m醋酸再调整ph值到4.7，进行搅拌，将交联中的羊膜置于37℃的培养箱中，以低速搅拌16小时；清洗去未反应的edc(氮(3二甲基氮基)1乙基氮甲基盐酸)：交联进行完毕后，以100ml 30%酒精清洗30min，再以大量1 x pbs清洗3次，前两次4小时，最后一次于4℃清洗过夜，以清洗去未反应的edc(氮(3二甲基氮基)1乙基氮甲基盐酸)；保存羊膜：清洗过后，将羊膜置入30%酒精中，于4℃保存。
12、申请号为cn202311211513.2的专利《一种交联羊膜材料及其制备方法与应用》，该专利公开的交联步骤为：采用机械法将胎膜绒毛膜层剥离，保留海绵层和羊膜层，记为羊膜/海绵层，并对羊膜/海绵层进行清洗；采用羊膜/海绵层置于15~40℃条件下进行烘干，使烘干后的羊膜/海绵层的含水量为10~20％；将烘干后的羊膜/海绵层置于低浓度交联剂溶液中进行交联，即得。所述低浓度交联剂溶液中含有交联剂，且交联剂的质量浓度不高于0.5％。
13、申请号为cn201910802717.0的发明专利公开的羊膜复合材料及其制备方法和应用，该专利交联羊膜的工艺为：将羊膜材料置于多巴胺碱性溶液中进行浸泡处理，得到多巴胺修饰羊膜材料；将所述多巴胺修饰羊膜材料置于水、引发剂、交联剂和水凝胶单体有机物的混合液中进行聚合反应，得到所述羊膜复合材料。
14、申请号为cn201510727418.7的发明专利公开的一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法，该专利交联羊膜的工艺为：a、制备脱细胞生物羊膜；b、取步骤 a 制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％~1％的京尼平溶液中，35~40℃恒温下作用0.5~72h，纯化水或去离子水清洗；c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥。
15、申请号为cn202110320814 .3的发明专利公开的一种细胞结构完整降解可控的生物羊膜及其制备方法中使用交联剂对羊膜进行交联处理的步骤具体为：羊膜置于浓度为0.1~0 .5％的戊二醛、甲醛和/或京尼平溶液中，置于摇床，摇床转速为 50~200r/min，时间为30~120min。
16、由此可见，现有公开技术资料（如申请号为：cn201710090417.5、tw95149902a、cn202311211513.2、cn201910802717.0、cn201510727418.7、cn202110320814.3的专利）中的羊膜交联技术都是让羊膜浸泡在配备好的交联剂溶液中，这就必然导致浸泡交联过程中羊膜自身的有益成分包括水溶性生长因子和细胞因子的流失，降低其生物活性。
17、综上所述，亟需开发非冷冻干燥、非浸泡交联处理的干态羊膜制备技术，从而实现以下两方面的有益效果：1）提高羊膜的力学强度；2）减少生长因子和细胞因子有益成分的流失。
技术实现思路
1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种非冷冻干燥的雾化喷涂交联干态羊膜及其制备方法。
2、本发明的技术解决方案如下：
3、本发明的第一方面提供一种非冷冻干燥的雾化喷涂交联干态羊膜的制备方法，包括以下步骤：
4、s1、取新鲜羊膜洗净和固定；
5、s2、用亲水氢键补充试剂对所述羊膜进行雾化喷涂处理；
6、s3、使用交联剂对所述羊膜进行雾化喷涂交联；
7、s4、再次用亲水氢键补充试剂对交联完成后的所述羊膜进行雾化喷涂处理，即得雾化喷涂交联干态羊膜。
8、优选地，所述s1的步骤中，使用纯水清洗羊膜表面残留的杂质，洗净后的羊膜用8cm×10cm的矩形绷板夹住绷紧，再使用黄色橡皮筋捆绑固定。
9、优选地，所述s2的步骤中，亲水氢键补充试剂指的是那些能够帮助增强或模拟生物分子之间氢键作用的化学物质，主要有以下几类：1）含氧基团的化合物：例如醇、羧甲基壳聚糖及透明质酸等糖类、酪氨酸等氨基酸、酚、醚、聚乙二醇（peg）、聚乙烯醇（pva）等，这些化合物中的羟基(-oh)或醚基(-o-)可以作为氢键供体或受体，有助于与其他分子形成氢键；2）含氮基团的化合物：如胺、酰胺等，这些化合物中的氨基(-nh2)或酰胺基(-conh2)同样可以作为氢键的供体或受体； 3）表面活性剂：某些表面活性剂具有亲水头部和疏水尾部的结构特点，其中亲水头部常含有多个极性基团（如羟基、羧基、磺酸基等），能够与水形成氢键，从而改善系统的亲水性能。
10、优选地，本发明中亲水氢键补充试剂包括丙三醇、乙醇、酪氨酸、羧甲基壳聚糖、透明质酸。
11、更优选地，本发明中亲水氢键补充试剂为丙三醇和乙醇混合溶液。丙三醇（c3h8o3）：每个分子含有3个羟基，能够与水形成多个氢键，具有很强的亲水性。乙醇（c2h5oh）：每个分子含有1个羟基，也能与水形成氢键，但亲水性较丙三醇弱。由于丙三醇的黏度较高，所以需要与乙醇按照一定的配比制备成黏度低至能对羊膜进行雾化喷涂的混合溶液。在满足能对羊膜进行雾化喷涂的前提下，也可通过调整比例来控制配备的溶液，进而进一步优化其亲水性和其他理化性质。本发明中优选的丙三醇和乙醇混合溶液的配比为2:8。
12、酪氨酸（tyrosine, tyr）是一种重要的氨基酸，其侧链含有一个酚羟基（-oh）和一个苯环。由于酚羟基的存在，酪氨酸具有一定的亲水性，能够与水分子形成氢键，因此可以作为一种亲水性氢键补充试剂。本发明中优选的酪氨酸溶液浓度为0.5%~2%（w/v）。
13、羧甲基壳聚糖（cmcs）是一种经过化学改性的壳聚糖，具有良好的亲水性和生物相容性。由于其分子链上含有大量的羧基（-cooh），cmcs能够与水分子形成氢键，从而增强其亲水性。本发明中优选的羧甲基壳聚糖浓度为0.5%~5%（w/v）。
14、透明质酸（hyaluronic acid, ha）是一种高分子多糖，广泛存在于人体的结缔组织、皮肤和眼球中。由于其分子链上含有大量的羟基和羧基，透明质酸具有优异的亲水性和保湿性能，能够与水分子形成氢键，从而增强其亲水性。本发明中优选的透明质酸溶液浓度为0.5%~2%（w/v）。
15、优选地，步骤s2、s3和s4中的雾化喷涂的具体方法包括：
16、将亲水氢键补充试剂或交联剂装入喷壶内，通过喷壶将亲水氢键补充试剂或交联剂喷涂在羊膜的正面和背面，等待亲水氢键补充试剂或交联剂与羊膜反应完成。
17、具体地，所述s2的步骤中，将亲水氢键补充试剂装入塑料喷壶中，保持喷壶的喷头和绷板固定的羊膜之间的距离为20~30 cm，对羊膜正反两面分别持续喷涂2~5次，每次反应时间维持在45min ~1h，放置6h-12h。即得到亲水氢键补充试剂雾化喷涂后的羊膜。
18、所述s3的步骤中，交联剂溶液中采用的交联剂为环氧化物交联剂（环氧氯丙烷、乙二醇二缩水丙三醇醚、聚丙三醇聚缩水丙三醇醚、1,4-丁二醇二缩水丙三醇醚）、双醛交联剂（戊二醛、双醛淀粉、双醛透明质酸、双醛葡聚糖、双醛羧甲基纤维素）、胺类(（1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）、n-羟基丁二酰亚胺 (nhs)、n-环己基-n′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐、n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐、二乙烯三胺、马来酰亚胺）或京尼平。本发明采用的edc和nhs混合溶液交联羊膜的原理图如下：
19、
20、注：edc---1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；nhs---n-hydroxy succinimide, n-羟基丁二酰亚胺
21、所述s3的步骤中，配制的交联剂浓度范围为30~300mm的edc和6~60mm 的nhs混合溶液。
22、所述s3的步骤中，用塑料喷壶充当简易的雾化喷涂装置，将配置好的交联剂装入喷壶，控制喷壶喷头和羊膜样品的距离为20~30cm，对羊膜样品的正反两面分别连续喷三次，每次均将喷好的羊膜放在直径为10cm三角铁架台上反应30min~45min。上述步骤持续3~4次，即得雾化喷涂交联完成后的羊膜样品。
23、所述s4的步骤同所述s2步骤。
24、本发明至少具有以下有益效果之一：
25、（1）相比于现有公开的羊膜交联技术（申请号为：cn201710090417.5、tw95149902a、cn202311211513.2、cn201910802717.0、cn201510727418.7、cn202110320814.3的专利），本发明通过雾化喷涂交联处理羊膜的方式，羊膜本身的有益成分包括水溶性生长因子和细胞因子保存了下来，避免了已有专利技术通过浸泡的方式对羊膜进行交联而造成羊膜自身有益成分的流失，有利于维持羊膜自身的生物活性。
26、（2）本发明雾化喷涂交联处理后提高了羊膜的力学强度：从羊膜单轴拉伸测试结果可知，采用本发明所述方法制备的较优实施例的羊膜，相比于新鲜的羊膜，最大单轴拉伸断裂应力由0.56mpa提高至2.69mpa，最大单轴拉伸断裂应力提高了2.13mpa，即提高了380.36%，一定程度上解决了在临床应用中很容易发生撕裂、破损，导致其目前仅适用于小面积的组织修复手术的问题。
27、（3）相比于现有非冷冻干燥干法保存羊膜技术（申请号为cn 202310187395.x的专利），已公开技术当中醇溶液处理是在碳碳双键聚合交联增韧处理之后且采用浸泡处理的方式进行；而本发明中的亲水氢键补充试剂处理是在雾化喷涂交联步骤前后均进行，且采用雾化喷涂的非浸泡处理方式进行。这种处理方式的意义在于：能够解决“羊膜棚板固定之后自然风干导致的氢键作用减弱，进而发生不可逆结构坍塌并造成力学强度下降”。具体针对以下三种情况论述如下：
28、a. 如果羊膜交联前后均不进行亲水氢键补充试剂雾化喷涂处理，羊膜会由于自然风干导致其氢键作用减弱，进而羊膜结构会发生不可逆坍塌并造成其力学强度的下降，即：从羊膜单轴拉伸测试结果可知，采用本发明所述方法制备的较优实施例4制备的羊膜，相比于对比例6自然风干的羊膜，最大单轴拉伸断裂应力由1.38mpa提高至2.69mpa，最大拉伸断裂应力提高了1.31mpa，即提高了94.93%。
29、b. 如果仅在羊膜交联前进行亲水氢键补充试剂雾化喷涂处理而交联后未做相应处理，如本发明中对比例8制备的羊膜相比于对比例6自然风干的羊膜，其最大单轴拉伸断裂应力由1.38mpa提高至1.62mpa，即提升了17.39%。
30、c. 如果仅在羊膜交联后进行亲水氢键补充试剂雾化喷涂处理而交联前未做相应处理，如本发明中对比例9制备的羊膜相比于对比例6自然风干的羊膜，其最大单轴拉伸断裂应力由1.38mpa提高至1.58mpa，即提升了14.49%。
31、由以上a、b、c所述可知，交联前后均进行亲水氢键补充试剂处理相比于仅交联前或仅交联后单次的亲水氢键补充试剂处理对于力学强度具有显著提升。
32、（4）本发明雾化喷涂交联处理后提高了羊膜的抗酶降解能力：从酶降解测试结果可知，采用本发明所述方法制备的较优实施例的羊膜，相比于新鲜的羊膜，酶降解百分比由100%降低至93.89%，抗酶降解能力提高了6.11%。