本发明涉及遗传育种，尤其涉及一种筛选抗旱茶树种质的方法和应用。
背景技术：
1、干旱是制约茶树生长的重要环境因素，其对农业造成的损失大于其他环境胁迫之和。在自然条件下，干旱是反复且连续发生的事件。在此环境背景下，植物必须进化出更高效的耐旱机制来应对这种反复发生的干旱胁迫。基因在反复胁迫中的表达模式是植物的“胁迫记忆”。响应胁迫并且在每次胁迫中做出类似反应的基因定义为“非记忆”基因，那些在随后的胁迫中做出不同反应的基因定义为“记忆”基因。表观遗传是“胁迫记忆”形成的一个重要机制。染色质重塑同样在植物对反复应激反应的“记忆”机制中发挥重要作用。
2、但目前已有的关于茶树耐旱的研究，往往将干旱胁迫视为仅发生一次的单一事件而获得的，并没有现有技术对茶树响应周期性干旱胁迫做任何研究。例如现有技术cn115948602a公开了根据参与茶树一次干旱胁迫的基因表达量，筛选出差异表达基因，获得差异表达基因序列；将ssr、ilp分子标记筛选与茶树干旱胁迫差异表达基因相关联，获得了茶树的干旱胁迫分子标记引物。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种筛选抗旱茶树种质的方法和应用。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
3、一种筛选抗旱茶树种质的方法，包括以下步骤：
4、步骤1：对茶树进行反复干旱处理后，采取新梢叶片作为样本；测定样本的表型、代谢组数据、转录组数据；
5、步骤2：从代谢组数据中筛选表达模式为第一次受到干旱时未响应或响应未有显著性，而在多次反复干旱后具有显著响应的差异代谢物作为“记忆”代谢物；
6、步骤3：筛选及分析反复干旱处理茶树中的差异基因：从差异基因中筛选出记忆关键基因；
7、步骤4：根据记忆关键基因在茶树叶片中的转录水平，确定转录水平高的为抗旱茶树种质。
8、在其中一个优选的实施例中，反复干旱处理是指干旱处理使土壤含水量降低不大于10％后，进行复水处理；复水处理后进行下一轮干旱处理；重复处理的次数不小于2次。
9、在其中一个优选的实施例中，步骤2中，筛选差异代谢物时，定义fold change>1.5或fold change＜0.67且vip>1的代谢物为差异代谢物，并对全部差异代谢物的相对含量进行z-score标准化，随后进行k-means聚类分析；对差异代谢物进行kegg富集分析，kegg富集分析说明差异代谢物所参与的代谢通路。
10、在其中一个优选的实施例中，步骤2中，还包括将转录组数据与参考基因组比对并评估质量；转录组数据与参考基因组比对的步骤为：利用hisat2将clean reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。
11、步骤2中，转录组数据质量评估的结果可以反映本转录组测序的质量高低，若转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析。
12、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，差异基因筛选的条件为|log2fold change|>1，且fdr<0.05。
13、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，差异基因的分析是：对差异表达基因进行k-means聚类分析、go富集分析和kegg富集分析；进一步具体是指：筛选出p值小于0.05的go和基因关键基因通路，go注释说明基因的基本功能，kegg说明基因所参与的代谢通路。
14、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，记忆关键基因的筛选标准为：茶树中第一次受到干旱时未响应，而在多次反复干旱后具有显著响应的基因。
15、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，还包括对记忆关键基因的验证，所述验证包括选择基因进行rt-qpcr验证转录组数据的可靠性；使用rt-qpcr方法分析干旱下记忆关键基因的表达量；使用r语言分析记忆关键基因作为标志物的可靠性验证。
16、在其中的一个优选的实施例中，所述记忆关键基因为光合作用相关基因，所述光合作用相关基因选自序列seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个。
17、本发明通过设置多轮次反复干旱胁迫处理，挖掘出茶树中第一次受到干旱时未响应，而多次反复干旱后才显著响应的“记忆关键基因”，并验证这些基因作为干旱标志物，应用在抗旱茶树品种筛选。
18、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.1所示的基因的转录水平大于13.01时，判定茶树为抗旱性茶树。
19、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.2所示的基因的转录水平大于15.14时，判定茶树为抗旱性茶树。
20、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.3所示的基因的转录水平大于14.18时，判定茶树为抗旱性茶树。
21、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.4所示的基因的转录水平大于13.65时，判定茶树为抗旱性茶树。
22、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.5所示的基因的转录水平大于14.05时，判定茶树为抗旱性茶树。
23、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.6所示的基因的转录水平大于13.54时，判定茶树为抗旱性茶树。
24、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.7所示的基因的转录水平大于14.40时，判定茶树为抗旱性茶树。
25、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.8所示的基因的转录水平大于15.63时，判定茶树为抗旱性茶树。
26、在其中的一个优选的实施例中，seq id no.9所示的基因的转录水平大于14.36时，判定茶树为抗旱性茶树。
27、基于同一发明构思，本发明还要求保护一种筛选响应周期性干旱胁迫的记忆关键基因的方法，包括以下步骤：
28、步骤1：对茶树进行反复干旱处理后，采取新梢叶片作为样本；测定样本的表型、代谢组数据、转录组数据；
29、步骤2：从代谢组数据中筛选表达模式为第一次受到干旱时未响应或响应未有显著性，而在多次反复干旱后具有显著响应的差异代谢物作为“记忆”代谢物；
30、步骤3：筛选及分析反复干旱处理茶树中的差异基因：从差异基因中筛选出记忆关键基因。
31、在其中一个优选的实施例中，步骤2中，筛选差异代谢物时，定义fold change>1.5或fold change＜0.67且vip>1的代谢物为差异代谢物，并对全部差异代谢物的相对含量进行z-score标准化，随后进行k-means聚类分析；对差异代谢物进行kegg富集分析，kegg富集分析说明差异代谢物所参与的代谢通路。
32、在其中一个优选的实施例中，步骤2中，还包括将转录组数据与参考基因组比对并评估质量；转录组数据与参考基因组比对的步骤为：利用hisat2将clean reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。
33、步骤2中，转录组数据质量评估的结果可以反映本转录组测序的质量高低，若转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析。
34、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，差异基因筛选的条件为|log2fold change|>1，且fdr<0.05。
35、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，差异基因的分析是：对差异表达基因进行k-means聚类分析、go富集分析和kegg富集分析；进一步具体是指：筛选出p值小于0.05的go和基因关键基因通路，go注释说明基因的基本功能，kegg说明基因所参与的代谢通路。
36、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，记忆关键基因的筛选标准为：茶树中第一次受到干旱时未响应，而在多次反复干旱后具有显著响应的基因。
37、在其中一个优选的实施例中，步骤3中，还包括对记忆关键基因的验证，所述验证包括选择基因进行rt-qpcr验证转录组数据的可靠性；使用rt-qpcr方法分析干旱下记忆关键基因的表达量；使用r语言分析记忆关键基因作为标志物的可靠性验证。
38、在其中的一个优选的实施例中，所述记忆关键基因为光合作用相关基因，所述光合作用相关基因选自序列seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个。
39、基于同一发明构思，本发明还要求保护光合作用相关基因在筛选抗旱茶树中的应用，其中，所述光合作用相关基因选自序列seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个。
40、在其中的一个优选的实施例中，所述光合作用相关基因为如seq id no.4所示的基因。
41、在其中的一个优选的实施例中，所述光合作用相关基因为seq id no.7所示的基因。
42、一种筛选抗旱茶树的试剂盒，包括检测光合作用相关基因转录水平的试剂；所述光合作用相关基因选自序列seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个。
43、在其中的一个优选的实施例中，所述检测光合作用相关基因转录水平的试剂包括检测光合作用相关基因的引物、taqman探针或基因芯片。
44、在其中的一个优选的实施例中，所述检测光合作用相关基因的引物包括以下引物对中的任意一对或几对：
45、检测seq id no.1所示的基因的引物对：seq id no.10：
46、aggcttttgcagagctcaag；seq id no.11：cataagcccatgcattgttg；
47、检测seq id no.2所示的基因的引物对：seq id no.12：
48、ttgtatttgggcccactctc；seq id no.13：caccgaacttgacaccattg；
49、检测seq id no.3所示的基因的引物对：seq id no.14：
50、gttcggtgaggctgtatggt；seq id no.15：tagagtgggtcggtcacctc；
51、检测seq id no.4所示的基因的引物对：seq id no.16：
52、ttgaattccttgccatctcc；seq id no.17：aacacagatccccacgaaag；
53、检测seq id no.5所示的基因的引物对：seq id no.18：
54、agcctatggcgagatcttca；seq id no.19：gggtcagcccaatagtcgta；
55、检测seq id no.6所示的基因的引物对：seq id no.20：
56、atattctcggcggttccttt；seq id no.21：agccgtagtcccctggtagt；
57、检测seq id no.7所示的基因的引物对：seq id no.22：
58、ggtgtcaccggaatgctact；seq id no.23：agggtagccacactcattgg；
59、检测seq id no.8所示的基因的引物对：seq id no.24：
60、gtacggtcccgacagaagaa；seq id no.25：ggccacagttagcaccaaat；
61、检测seq id no.9所示的基因的引物对：seq id no.26：
62、gtgtttgggttgcagaggtt；seq id no.27：aagctcagcattcctttgga。
63、在其中的一个优选的实施例中，所述检测光合作用相关基因的引物包括检测seqid no.4所示的基因的引物对：seq id no.16：ttgaattccttgccatctcc；seq id no.17：aacacagatccccacgaaag。
64、在其中的一个优选的实施例中，所述检测光合作用相关基因的引物包括检测seqid no.7所示的基因的引物对：
65、检测seq id no.7所示的基因的引物对：seq id no.22：
66、ggtgtcaccggaatgctact；seq id no.23：agggtagccacactcattgg。
67、一种鉴定植物种质抗旱能力的方法，以所述的试剂盒检测植物内的seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的基因的转录水平，转录水平高的植物种质为抗旱植物。
68、基于同一发明构思，本发明还要求保护一种提高植物抗旱性的制剂，包括如下i)-v)中的至少一种：
69、i)、如seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的核酸分子；
70、ii)、包含seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的核酸分子的表达载体；
71、iii)、含有ii)的重组宿主；
72、iv)、增强seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的基因表达的启动子或增强子；
73、v)、促进seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的基因表达的诱导剂。
74、基于同一发明构思，本发明还要求保护所述的制剂在提高植物抗旱能力中的应用。
75、基于同一发明构思，本发明还要求保护一种提高植物抗旱能力的方法，以所述的制剂，提高植物内源seq id no.1-seq id no.9中的任意一个或几个所示的基因的水平和/或活性。
76、根据本发明的实施例，所述的lhcp1、lhcp2、lhcp3、lhcp4、lhcp5、lhcp6、lhcp7、lhcp8、lhcp9基因在植物体内表达抑制可以降低植物的干旱耐受性。将该基因超表达提高了茶树的耐旱性，通过反义寡核苷酸技术在茶树中抑制lhcp1、lhcp2、lhcp3、lhcp4、lhcp5、lhcp6、lhcp7、lhcp8、lhcp9基因的表达可显著加剧茶树的干旱损伤。
77、本发明的有益技术效果为：
78、本发明基于多组学技术，筛选出茶树中第一次受到干旱时未响应，而在多次反复干旱后才显著响应的“记忆关键基因”。结合差异代谢物富集的通路以及对差异表达基因的生物信息学分析的结果，准确高效地挖掘鉴定重要的茶树干旱记忆关键基因。实验结果显示，不同轮次干旱处理下的差异代谢物共同富集的代谢通路为氨基酸生物合成和氨基酰基-trna生物合成。典型的茶树干旱记忆关键基因主要为seq id no.1-seq id no.9所示的基因。通过选取9个记忆关键基因进行rt-qpcr验证，说明选取的基因的表达模式与转录组测序结果一致，说明本发明实验测序结果以及筛选的记忆关键基因正确。本发明中，首次克隆并验证了调控茶树响应干旱胁迫的lhc类茶树光合作用基因(即lhcp1、lhcp2、lhcp3、lhcp4、lhcp5、lhcp6、lhcp7、lhcp8、lhcp9)，这些基因在茶树响应干旱胁迫过程中实现调控作用，影响茶树的抗旱性形成。本发明还提供了含有lhcp1、lhcp2、lhcp3、lhcp4、lhcp5、lhcp6、lhcp7、lhcp8、lhcp9基因的重组质粒、转基因工程菌。本发明为遭受高频、反复干旱胁迫的茶树寻求合理调控措施和筛选合适抗旱育种材料奠定了基础。