本发明涉及负载细胞的生物医药，具体为一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法。
背景技术：
1、rna 干扰（rnai）现象被发现之后，该技术迅速被科研人员应用于疾病治疗领域，使基因治疗的发展迎来了巨大的契机，该技术通过导入小干扰 rna（sirna）特异性抑制致病靶向基因的表达，起到治疗疾病的作用，如何让 sirna 在体内稳定传输，能否找到一种安全、可靠、与机体高度兼容的递送载体，一直是 rnai 转化应用的核心科学问题。
2、在基因治疗领域，sirna 具有巨大的潜力，其能够特异性地沉默致病基因，为众多疾病的治疗提供了新途径，然而，sirna 药物的临床应用面临诸多挑战，其中高效核酸递送是关键难题之一，由于 sirna 本身带负电荷且分子相对较大，其在体内稳定性差，易被核酸酶降解，同时难以穿透细胞膜进入细胞内部发挥作用，此外，sirna / 载体复合物在体内运输过程中，难以穿透紧密连接的血管内皮，尤其是血脑屏障等特殊屏障，这极大地限制了其向肿瘤或特定组织的递送，导致核酸递送效率低，严重制约了 sirna 药物的疗效和应用范围。
3、目前，为解决 sirna 递送问题，研究人员开发了多种递送技术，例如脂质纳米颗粒（lnp）、聚合物载体和其他类型的纳米材料，但这些载体在实际应用中存在诸多问题，如安全性不佳、制造成本高昂等，特别是对于非肝脏组织，sirna 从内吞体逃逸到细胞质的过程更加困难，因为大多数细胞表面受体的数量远低于肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体（asgpr），后者能够帮助 galnac 修饰的 sirna 高效地进入肝细胞，而在其他类型的细胞上，类似的受体数量极少，使得 sirna 很难通过传统的受体介导的内吞途径进入细胞，即使 sirna 被细胞内吞，也面临着从内吞体逃逸到细胞质中的难题，这是实现基因沉默效应的关键步骤，但对于许多非肝细胞而言，这一过程效率极低，限制了 sirna 的效果，并且，当前的递送技术往往难以精确控制 sirna 的分布模式，导致药物可能分散到非目标区域，增加了脱靶效应的风险，同时也浪费了宝贵的药物资源。
4、因此，开发一种能够高效穿透血管内皮屏障（尤其是血脑屏障），实现 sirna 精准、高效递送至肿瘤或特定组织的方法具有迫切的现实需求。
技术实现思路
1、本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，以解决上述背景技术中所提出的技术问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，包括以下步骤：
3、构建以可生物降解聚合物为核心的多功能纳米载体，所述可生物降解聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其分子量为10-100 kda，乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50:50至85:15；
4、在所述多功能纳米载体表面修饰靶向配体，所述靶向配体为狂犬病毒糖蛋白肽，其氨基酸序列为ytiwmpenprpgtpcdiftnsrgkrasng，修饰密度为0.1-5 μg/mg载体；
5、在所述多功能纳米载体表面引入穿透增强分子，所述分子为短链脂肪酸衍生物，负载量为0.5-10 wt%；
6、通过静电吸附和物理包裹将sirna负载到载体中，sirna与载体的质量比为1:10至1:50，最终形成的复合物粒径为80-200 nm，zeta电位为-10至+10 mv。
7、优选的，所述sirna的化学修饰为2'-o-甲基化修饰，修饰位点包括反义链的第1-3位及第18-21位核苷酸，且5'端连接胆固醇分子以增强载体结合效率。
8、优选的，所述靶向配体修饰方法具体为：将rvg肽溶解于ph 7.4的pbs缓冲液中，浓度调整为1 mg/ml，加入edc和nhs室温活化15分钟，随后以1:1体积比逐滴加入至plga纳米载体悬浮液，在25℃下反应6小时，超速离心纯化。
9、优选的，所述穿透增强分子的引入方法为：将癸酸钠溶于无水乙醇，按载体质量的3%加入至已修饰rvg的plga悬浮液中，37℃振荡孵育2小时，透析去除游离分子。
10、优选的，所述复合物的表征参数包括：
11、动态光散射测得的平均粒径为120±15 nm，多分散指数<0.2；
12、透射电镜显示球形或近球形形态，表面光滑；
13、琼脂糖凝胶电泳验证sirna包封率≥90%。
14、优选的，所述递送系统在体外实验中实现：
15、靶向神经元细胞的转染效率≥70%；
16、紧密连接穿透效率较未修饰载体提高3-5倍；
17、血清稳定性>24小时。
18、优选的，所述sirna为针对亨廷顿病相关htt基因的序列，其正义链为5'-guaucuacaucaagacuua-3'，反义链为5'-uaagucuugauguagauac-3'。
19、本发明提供的技术方案，与已知的现有技术相比，具有如下有益效果：
20、1、高效穿透血管内皮屏障：通过靶向配体与血管内皮细胞表面受体的特异性结合，以及穿透促进分子对紧密连接的可逆调节，本发明的 sirna / 载体复合物能够高效穿透血管内皮，包括血脑屏障。
21、2、显著提高核酸递送效率：精准的靶向性和高效的穿透能力使得 sirna 能够大量递送至肿瘤或特定组织细胞内。
22、3、良好的生物安全性：所选用的可生物降解聚合物和修饰分子均具有良好的生物相容性，在体内不会引起明显的免疫反应和毒性。
1. 一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述sirna的化学修饰为2'-o-甲基化修饰，修饰位点包括反义链的第1-3位及第18-21位核苷酸，且5'端连接胆固醇分子以增强载体结合效率。
3. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述靶向配体修饰方法具体为：将rvg肽溶解于ph 7.4的pbs缓冲液中，浓度调整为1mg/ml，加入edc和nhs室温活化15分钟，随后以1:1体积比逐滴加入至plga纳米载体悬浮液，在25℃下反应6小时，超速离心纯化。
4. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述穿透增强分子的引入方法为：将癸酸钠溶于无水乙醇，按载体质量的3%加入至已修饰rvg的plga悬浮液中，37℃振荡孵育2小时，透析去除游离分子。
5. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述复合物的表征参数包括：
6. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述递送系统在体外实验中实现：
7. 根据权利要求1所述的一种全新载体 sirna 药物的高效核酸递送方法，其特征在于：所述sirna为针对亨廷顿病相关htt基因的序列，其正义链为5'-guaucuacaucaagacuua-3'，反义链为5'-uaagucuugauguagauac-3'。