本发明属于医药，涉及aldh1a2抑制剂和检测aldh1a2或ra的试剂的应用，尤其是在制备移植血管重构疾病的治疗和诊断制剂中的应用。
背景技术：
1、移植血管重构是器官移植术、血管搭桥术后慢性血管炎症引发的移植物结构重塑，其发病机制涉及免疫细胞浸润、平滑肌细胞异常增殖、细胞外基质成分异常改变和内膜新生等环节，导致远期管腔狭窄或闭塞、血管功能异常以及移植器官的功能衰竭。
2、目前移植血管的重构主要通过影像学手段进行诊断评估，例如超声造影是评估移植肾动脉重建后血流灌注的首选无创工具；在移植血管重构进程中，可观测到血管壁的逐步增厚和血管管腔的逐步狭窄；此外，彩色多普勒超声、增强ct和静脉造影可发现肝移植后肝静脉吻合口狭窄或血栓形成，确诊肝移植后肝静脉流出道梗阻。但这些手段只能用于识别中晚期血管壁已出现较严重增厚、血管管腔已出现较严重狭窄的移植血管重构，缺乏早期灵敏性，不利于对移植血管重构进行早期识别和早期干预治疗。本发明前期研究发现，ccl21a-cxcr3趋化通路在移植血管重构过程中发挥重要作用，提示新兴生物标志物可能具有预测和诊断移植血管重构的重要价值。目前移植血管重构的主要治疗策略包含外科手术、免疫干预和再生医学技术应用。但外科手术血管重建的方法具有自体血管来源有限，人工血管易感染和形成血栓的等局限性；传统免疫干预传统使用免疫抑制剂和细胞毒性药物遏制移植受体对供体器官和供体器官血管的排斥反应，但面临治疗靶向特异性差、毒副作用大、血管重构远期发生率居高不下等挑战；再生医学通过组织工程血管等手段进行人工血管支架重构，但存在成本高昂、缺乏统一质控标准、生物材料降解速率快等问题。因此，寻找特异性靶向移植免疫关键环节、缓解移植排斥反应的新靶点，以及构建新的早期辅助诊断标志物和开发针对性的新兴药物，有利于避免上述存在的外科手术局限性、传统免疫干预的特异性差和毒副作用强、再生医学手段成本高昂且尚不成熟等问题。
3、目前也报道了一些基因可以作为血管重构的靶点。如：公开号为cn120142655a的专利申请公开了alox15b基因作为靶点在筛选用于治疗肺血管重构及肺动脉高压的药物中的用途，公开号为cn119345368a的专利申请公开了亚甲基四氢叶酸脱氢酶2及其编码基因在血管重构中的应用，等等。但这些靶点基因并非专门针对移植血管重构，目前还未见专门针对于移植血管重构治疗和诊断的靶标分子出现。普通血管重构的病理生理学改变以力学和代谢应激为主，其病变较为局限，进展速度常为数年到数十年；而移植血管重构以免疫微环境失调为核心，存在特异性免疫结构（三级淋巴组织），病变呈现弥漫性，且进展速度显著加快，例如50%心脏移植者10年内发病。此外，控制血管疾病危险因素的基础治疗，如降压、降脂、抗血小板对于普通血管重构的疗效显著，而对移植血管重构进展的改善程度有限。因此，开发特异性针对移植血管重构的诊断和治疗新手段，成为本领域基础研究与转化发明的重要课题。本发明通过针对移植免疫排斥的重要环节—三级淋巴组织形成，锚定促进后者形成的关键细胞类型和信号通路，寻找缓解移植免疫排斥的新靶点，有望推动移植血管重构诊断和治疗的改善。
4、醛脱氢酶家族1 （aldehyde dehydrogenase 1, aldh1）广泛分布于原核和真核生物中，其核心功能是将醛类转化为酸。aldh1包括亚家族a（aldh1a）和亚家族b（aldh1b），前者包含aldh1a2、aldh1a2、aldh1a3，主要定位于细胞质，催化视黄醛转化为视黄酸（ra），调控胚胎发育、细胞分化和免疫反应；后者以aldh1b1为代表，定位于线粒体，参与乙醛代谢和能量稳态维持。ra是细胞内的重要信号分子，可结合细胞核内的视黄酸受体（rar）和视黄酸x受体（rxr）调控基因转录，在细胞分化、器官发生和发育、免疫调节等生命活动中发挥关键作用。aldh1a2主导胚胎期的ra合成，促进心脏、神经管和四肢的发育，aldh1a2敲除小鼠模型出现严重心脏畸形和胚胎致死。相关研究显示，aldh1a2表达异常与癌症、器官纤维化和动脉粥样硬化等疾病密切相关。aldh1a2和ra作为诊断或治疗移植血管重构的靶标分子从未见报道。
技术实现思路
1、本发明的首要目的是提供aldh1a2抑制剂在制备预防和/或治疗移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病产品中的应用。本发明实验研究发现，aldh1a2在移植血管frc细胞（成纤维网状细胞）群中显著激活，移植血管组织ra（视黄酸）含量显著增加。体外研究发现小鼠胚胎成纤维细胞系（nih3t3细胞系）向frc的分化过程中aldh1a2表达显著上调，ra含量显著增加；抑制aldh1a2酶活性或下调aldh1a2表达均可显著减少nih3t3细胞系的ra含量并抑制其向frc分化。体内研究发现，aldh1a2抑制剂可显著减少移植血管tlo（三级淋巴组织）形成并抑制重构血管内膜新生、降低新生内膜/中膜比率。研究表明，抑制aldh1a2、减少ra生成可通过阻碍frc分化发育和tlo形成缓解移植血管重构。
2、所述aldh1a2抑制剂包括如下中的一种或多种：
3、1）针对aldh1a2的抗体或其抗原结合片段；
4、2）以aldh1a2或其转录本为靶序列，且能够抑制aldh1a2表达或基因转录的小干扰rna、dsrna、微小rna或反义核酸；
5、3）基于aldh1a2结构的小分子抑制剂。
6、进一步地，
7、小干扰rna序列如：seq id no.17和no.18所示；基于aldh1a2结构的小分子抑制剂包括：aldh1a2酶活性抑制剂双硫仑。
8、所述aldh1a2抑制剂具有如下一种或多种功能：
9、（1）抑制aldh1a2蛋白的活性和/或表达；
10、（2）抑制aldh1a2蛋白编码基因的表达；
11、（3）抑制aldh1a2酶产物视黄酸（ra）的生成。
12、所述产品包括血管支架或带有球囊的导管，或药物组合物；还包含药学上可接受的辅料。
13、本发明第二个方面的目的是提供检测aldh1a2或ra的试剂在制备移植血管重构疾病诊断制剂中的应用。
14、本发明发现在移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病的患者体内的aldh1a2蛋白的表达水平和/或活性、aldh1a2蛋白编码基因的表达水平、aldh1a2酶产物ra的含量较正常对照组增加。
15、移植血管重构相关疾病包括：同种异体移植后的移植血管病变、bypass术后血管狭窄、实体器官移植排斥反应等。
16、上述应用中，检测aldh1a2的试剂包括：特异性扩增aldh1a2的引物、特异性识别aldh1a2的探针；检测aldh1a2蛋白表达水平的试剂包括：aldh1a2蛋白抗体、能与aldh1a2蛋白结合的适配体或aldh1a2蛋白染料。
17、进一步地，
18、所述检测aldh1a2的试剂包括通过pcr、流式细胞术、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术或生物素-亲和素技术检测的试剂。
19、本发明所述移植血管重构是与移植血管相关疾病相关的血管重构；
20、所述疾病或状况包括：bypass术后血管狭窄、同种异体移植后的移植血管病变、移植排斥反应或它们的任意组合。
21、本发明所述醛脱氢酶家族1成员a2（aldh1a2）是人aldh1a2，其氨基酸序列的ncbi登录号为np_003879.2，见seq id no.1，或与其具有至少80%序列同一性且具有醛脱氢酶家族1成员a2活性的氨基酸序列，或与其相比具有一个或多个氨基酸取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合且具有醛脱氢酶家族1成员a2活性的氨基酸序列。
22、在一些实施方案中，aldh1a2是小鼠aldh1a2，其氨基酸序列的ncbi登录号为np_033048.2，见seq id no.2，或为与其具有至少80%序列同一性且具有醛脱氢酶家族1成员a2活性的氨基酸序列，或与其相比具有一个或多个氨基酸取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合且具有醛脱氢酶家族1成员a2活性的氨基酸序列。
23、在一些实施方案中，上述任一所述的应用中，所述aldh1a2蛋白编码基因包括编码aldh1a2蛋白的dna序列、由编码aldh1a2蛋白的dna（包括了内含子和外显子的基因组dna）转录的pre-mrna序列，以及编码aldh1a2蛋白的mrna序列。
24、在一些实施方案中，所述aldh1a2 mrna是人aldh1a2 mrna，其核酸序列的ncbi登录号为nm_003888.4，见seq id no.3，或为与其具有至少80%序列同一性且编码上述任一所述的aldh1a2蛋白的核酸分子。
25、在一些实施方案中，所述aldh1a2 mrna是小鼠aldh1a2 mrna，其核酸序列的ncbi登录号为nm_009022.4，见seq id no.4，或为与其具有至少80%序列同一性且编码上述任一所述的aldh1a2蛋白的核酸分子。
26、在一些实施方案中，上述任一所述的应用中，所述aldh1a2酶催化产物是视黄酸（ra）。
27、在一些实施方案中，上述任一所述的应用中，所述aldh1a2抑制剂选自如下一种或多种：针对aldh1a2的抗体或其抗原结合片段、核酸（例如aldh1a2 sirna）、化合物小分子（例如aldh1a2酶活性抑制剂双硫仑）；其中，所述核酸是以aldh1a2或其转录本为靶序列，且能够抑制aldh1a2表达或基因转录的小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸；所述化合物小分子可以是那些基于aldh1a2结构或者类似现有aldh1a2抑制剂结构的小分子抑制剂。
28、本发明提供醛脱氢酶家族1成员a2（aldh1a2）或其催化产物视黄酸（ra）作为生物标志物或靶点，和/或检测所述醛脱氢酶家族1成员a2（aldh1a2）或其产物视黄酸（ra）试剂还可以有如下应用：
29、i．在筛查移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病或制备筛查移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病的产品中的应用；
30、ii. 在评估移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病或制备评估移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病的产品中的应用；
31、iii．在制备诊断移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病的产品中的应用；
32、iv．在筛选和/或制备预防、治疗和/或缓解移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病的产品中的应用；
33、v．在监测移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病病程或制备监测移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病病程的产品中的应用；
34、vi．在分析移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病预后或制备分析移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病预后的产品中的应用；
35、vii．在抑制血管成纤维祖细胞向frc细胞分化和/或血管三级淋巴组织形成或制备抑制血管成纤维祖细胞向frc细胞分化和/或血管三级淋巴组织形成的产品中的应用。
36、相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
37、本发明经研究发现了具有潜在的治疗移植血管重构及多种心血管疾病的靶点——醛脱氢酶家族1成员a2(aldh1a2)。重构血管中的成纤维网状细胞（frc细胞）分化过程中aldh1a2显著活化、aldh1a2酶产物ra增多，这与血管周围区域的淋巴样聚集体三级淋巴样组织（tlo）形成及其炎症激活相关。体内研究发现，aldh1a2抑制剂能显著减少重构血管中tlo形成并能有效缓解移植血管病变。本发明提出以aldh1a2为生物标志物用于判断移植血管重构、移植血管重构相关疾病（特别是器官移植排斥反应）进展或以aldh1a2为靶点用于预防、治疗和/或缓解移植血管重构、移植血管重构相关疾病（特别是器官移植排斥反应），本发明为实现预防、治疗和/或缓解移植血管重构和/或移植血管重构相关疾病提供了新思路。