治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体的制作方法

专利名称:治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗神经损伤或再生神经细胞的方法及其载体构建体，特别涉及一种治疗神经损伤或再生神经细胞之载体构建体的制备方法与用途。
背景技术：
在发生物理横切伤、外伤、挫伤、挤压伤、手术损伤或血管药理伤害包括出血性或缺氧伤害、神经退化、其它精神疾病所造成之急性或慢性神经系统损伤后，可能需要再生神经细胞并恢复切除神经组织(denervated tissues)内之神经连结。
在神经系统损伤后，一般修复受损神经的方式是对患者进行神经缝合手术以及神经移植，其它可行的神经损伤治疗包括移植新的神经细胞与支撑细胞、递送蛋白质以刺激在脊椎神经内之细胞再生及减低抑制脑细胞再生之策略。部分研究发现在大鼠脊椎神经损害部位或附近直接施以神经修复剂能修复受损的脊椎神经(Cheng等人，1996，Science 273510-513)。
美国专利申请公开号US20040267289之内容披露了修复神经根的方法，包括将脊椎动物之一部分末梢神经系统移近脊椎动物之一部分中枢或末梢神经系统，并在两部分间之缝隙敷上包含生长因子、纤维素源及其它重要元素的纤维蛋白胶混合物，使脊椎动物的该部分末梢神经系统与该部分中枢或末梢神经系统之间形成功能性连结。

发明内容
本发明一方面提供了一种治疗神经损伤的方法，包括递送酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)之编码基因至神经损伤部位，并在神经损伤部位表达该基因。
本发明另一方面提供了一种治疗神经损伤的载体构建体，包括承载aFGF之编码基因的病毒载体。
本发明再一方面提供了一种再生神经细胞的方法，包括递送aFGF之编码基因至神经细胞，并在神经细胞表达该基因。
本发明又一方面提供了一种再生神经细胞的载体构建体，包括承载aFGF之编码基因的病毒载体。



前述内容及以下的发明详细说明，当参照附图时，将更佳地被了解。为了说明本发明之目的，在附图显示目前为较佳的具体实施例。然而，应了解的是，本发明不限于所显示之确切排列及方法。
在附图中图1A为一载体图，表示了A2殖株载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因；图1B为一载体图，表示了A4殖株载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因以及rep基因；图1C为一载体图，表示了腺相关病毒(AAV)噬菌体杂合噬质粒载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因、延长因子、聚腺苷酸化及土拨鼠肝炎病毒后转录调节元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptionalregulatory element)序列；图1D为一载体图，表示了AAV噬菌体辅助载体承载rep-2与cap-2基因；图2A为一条状图，呈现PC12细胞在AAV-aFGF之不同滴定浓度的脑神经分化。
图2B为一条状图，呈现PC12细胞在AAV-aFGF之不同滴定浓度的细胞增生。
图3A与3B为条状图，呈现活体外AAV-aFGF表达的定量分析，其中图3A显示蛋白印迹(Western Blot)分析在PC12细胞所分析的aFGF表达量，图3B显示蛋白印迹(Western Blot)分析在胞外区域所分析的aFGF表达量。
图4为一显微图像，显示稳定转染细胞在大鼠脊椎神经的腹角区域表达aFGF；图5A-5C为条状图，呈现活体内AAV-aFGF表达之定量蛋白印迹(Western Blot)分析，其中图5A显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，aFGF mRNA在脊椎组织的绝对表达量，图5B显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，aFGF在脊椎组织的校准表达量，及图5C显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，纯化aFGF在脊椎组织的校准表达量；以及图6A与6B为条状图，呈现aFGF基因转导对行为评估的影响。
具体实施方式
为使本
发明内容
清楚易懂，以下将对所使用的专有名词做更详尽的解释。
在此所使用的冠词“一”意指一或多于一(也就是至少一)的文法对象之冠词，除非另行解释该冠词仅为以单一观念的特定使用。
“载体”是指包括分离核酸的物质组合，并可将该分离核酸输送至细胞内部。多数的公知载体包括但不限于线性聚核苷酸、与离子性或两性化合物(ionic or amphiphilic compounds)有关之聚核苷酸、质粒及病毒。因此“载体”一词包括自主复制质粒或病毒，也应解释为包括能加速核酸转入细胞之非质粒与非病毒化合物，例如多离胺酸化合物、微脂体及其类似物。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体及类似物。
“腺相关病毒(AAV)载体”是取自于血清型腺相关病毒的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5及AAVX7。
AAV载体也包括转录序列，如聚腺苷酸化位点(polyadenylation site)，还有选择性标记或报导基因、增强子序列及其它能诱导转录之控制要素。
AAV病毒粒子是指完整的病毒粒子，AAV病毒粒子可为野生型AAV病毒粒子(包括线性单链AAV核酸基因体与AAV外壳结合，也就是蛋白质外鞘)或重组AAV病毒粒子。AAV病毒粒子能装入单链AAV核酸分子(如一般定义的有义链/编码链或无义链/非编码链)，有义链与无义链均具有相同感染力。
“基因”是指聚核苷酸，包含至少一个开放读码区能在转录或翻译后编码特定多肽或蛋白质，可使用在此所述之任何多核苷酸序列来辨识相关基因的较大片段或全长编码序列，而分离较大片段序列的方法为所属技术领域：
的技术人员所熟知。
互补脱氧核糖核酸库只包含由细胞内信息核糖核酸分子所合成之互补脱氧核糖核酸分子。
引物是指聚核苷酸，能与特定聚核苷酸模板产生专一性杂合并在合成互补聚核苷酸时提供起始点。在引发合成条件下(也就是当核苷酸、互补聚核苷酸模板及聚合化试剂，如DNA聚合酶存在时)放置聚核苷酸引物会发生此合成。引物一般为单链，但也可能为双链。引物一般为脱氧核糖核酸，但在许多应用中亦可使用多种合成及天然引物。引物是与模板互补并可设计为与模板杂合以作为合成的起始位点，但不必反映模板的确切序列。在此情况下，引物与模板的专一性杂合取决于杂合条件之严苛度。可以发色性、放射活性或荧光性分子部分标记引物，并作为可检测之分子部分。
寡核苷酸一般是指不超过大约50核苷酸的短聚核苷酸，并且当核苷序列是由DNA序列(也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C))所表示时，也包括了RNA序列(也就是A、尿嘧啶(U)、G、C)，其中U取代T。
定序引物是寡核苷酸引物，能与至少部分聚合苷酸互补并能通过DNA或RNA聚合酶类，如DNA聚合酶所延长，其中以公知方法结合定序引物到聚核苷酸并延长引物产生了与至少部分聚合苷酸互补的寡核苷酸转录本。
“报导基因”在此是指可由已知方法检测表达之基因，例如大肠杆菌的半乳糖酶(lacZ)基因可作为培养基内的报导基因，因为能使用已知方法通过对培养基添加呈色基质ο-硝基苯-β-半乳糖甘酶，检测lacZ基因的表达(Gerhardt等人，1994，Method for General and Molecular Bacteriology，美国微生物学会，哥伦比亚特区，华盛顿，第574页)。
“启动子/调节序列”是指需要表达与启动子/调节序列连结运作之基因产物的核酸序列。例如，此序列可为核心启动子序列，又例如，此序列也可包括增强子序列及需要表达基因产物之其它调节元件。启动子/调节序列能以组织专一性方式表达基因产物。
限制位点是指由限制性核酸内切酶所辨识之部分双链核酸。当核酸与内切酶接触时，如限制性核酸内切酶可在该部分切割核酸的两条链，限制性核酸内切酶便能辨识部分的双链核酸。
“转染”是将基因物质，如核酸放入培养细胞内的一种方法。
“感染”根据医学字典的解释是以感染生物或包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、朊毒体(prions)及类病毒(viroids)等利用宿主生物加倍繁殖之病源体对宿主生物的有害群聚。根据本发明的一较佳实施例，“感染”一词为无害的病毒感染，使病毒基因物质能引进适当的宿主细胞，且病毒能通过最外表面的蛋白进行辨识。病毒核酸使用细胞内宿主系统(host machinery)复制病毒核酸、病毒所需的酶及病毒包覆蛋白。
神经损伤一词是指物理横切伤、外伤、挫伤、挤压伤、手术损伤、血管药理伤害包括出血性或缺氧伤害、神经退化、其它精神疾病或造成神经受损或有害情况之其它因素所造成的急性或慢性神经损伤或有害情况。
多肽是指由氨基酸残基、相关天然结构变异及其非天然合成同源物通过肽键连结所组成的聚合物、相关天然结构变异及其非天然合成同源物，合成多肽能使用自动多肽合成机进行合成，在此使用已知记号描绘多肽序列多肽序列的左手端为胺基，多肽序列的右手端为羧基。
本发明涉及一种改善神经损伤的方法，包括传递酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)之编码基因到神经损伤区域，接着在该神经损伤区域表达该基因，其中aFGF基因可转录成aFGF信使核糖核酸或更进一步翻译为aFGF多肽。神经损伤区域可为神经器官、神经组织、可转导载体之神经细胞系统、或神经细胞或其突起所存在部位，包括但不限于神经轴突路径。
根据本发明一较佳实施例，aFGF基因具有如SEQ ID NO1所示之DNA序列。请参照图1A至1D，载体的构建体包括如SEQ ID NO1所示之aFGF基因，载体可为病毒载体，包括将载体装入病毒粒子的病毒基因体，病毒基因体可为重组病毒，如重组腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒或反转录病毒的基因体。根据本发明，可使用任何病毒载体将aFGF基因导入宿主细胞基因体，而较佳的病毒载体至少包括腺相关病毒基因与腺病毒基因的其中之一。载体构建体也包括报导基因，较佳为细菌lacZ的互补脱氧核糖核酸(cDNA)。可使用所属技术领域：
的技术人员所熟知的方法构建表达载体，包含结合了适当的转录/翻译控制因子的aFGF编码序列，这些方法包括Sambrook等人1992年在纽约冷泉港实验室实验手册之分子克隆部分所描述的体外重组DNA技术。
根据本发明的另一较佳实施例，载体可构建为包括具有如SEQ IDNO2所示之氨基酸序列的aFGF编码基因，如SEQ ID NO2所示的aFGF包括如SEQ ID NO2所示之aFGF多肽折叠成不同型式与蛋白质构型。
根据本发明的又一实施例，载体包括人脑cDNA库所取得的aFGFcDNA。然而载体构建体不应仅限于此，视所需的神经损伤治疗或神经再生种类，构建载体时可使用其它物种的aFGF基因。
此外，载体至少是质粒与噬菌体的其中之一，例如AAV质粒，如Samulski等人首先披露的pSub201(Journal of Virology，1987，Vol.61，No.10，pp.3096-3101)，此载体包含所有克隆入质粒骨干的腺相关病毒第二型(AAV-2)野生型编码区域以及顺式调控终端重复区域(cis-acting terminalrepeats)，此载体相当适合克隆，因其设计使限制酶XbaI的限制消化能移除AAV编码区域而维持质粒骨干内的AAV终端重复区域不受破坏。
载体还包含辅助质粒pDG(Grimm等人(1998))具有AAV繁殖所需的AAV基因(rep及cap)以及辅助基因以产生重组AAV，此质粒提供扩增及包装AAV载体所需的AAV与腺病毒基因功能。
因此，较佳的AAV粒子包装是以磷酸钙质粒转染的方式对细胞共同转染载有aFGF cDNA的pSub201质粒以及包装AAV的pDG辅助质粒，在宿主细胞内包装成熟病毒粒子，而本实施例的宿主细胞可为HEK293细胞。
有关治疗神经损伤的方法，递送包含aFGF基因之载体至神经损伤部位的其它方式包括以病毒载体感染神经损伤部位，注射载有aFGF基因的病毒粒子至神经损伤部位，以及利用所属技术领域：
的技术人员所熟知的细胞转染方式，如电穿孔法(electroporation)、显微镜下注射法(microinjection)、微脂体转染试剂、多聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、脂类转染试剂(effectene)、以及活化树枝状高分子(activated-dendrimers)将aFGF基因转染到神经损伤部位。
另外，改善神经损伤的方法包括以具有aFGF基因的病毒粒子感染神经损伤部位，而使aFGF表达在神经损伤部位。病毒粒子可根据溶原性路径(lysogenic pathway)感染神经损伤部位，其中在神经损伤部位之细胞基因体的特定位点导入aFGF基因并在复制细胞时复制基因。病毒载体可为含病毒载体包装成载有aFGF cDNA的病毒粒子，较佳的病毒粒子为pPAM-AAV质粒包含人类aFGF及/或细菌lacZ的cDNA。
根据本发明另一实施例，也提供了一种神经再生的方法，包括递送载体包括aFGF基因到神经细胞，在神经细胞内表达aFGF基因，接着转录并翻译aFGF基因以便在神经细胞内产生aFGF多肽。表达aFGF的神经细胞也可能包括星状细胞、寡凸细胞、神经胶细胞、脉络丛细胞、室管膜细胞、脑脊椎神经膜细胞、许旺氏细胞(Schwann cell)、神经母细胞、微胶细胞、脊椎神经组织内细胞及可以上述载体构建转型的神经源细胞株，如嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PC12)细胞。
根据本发明的一较佳实施例，aFGF基因可为具有如SEQ ID NO1所示之DNA序列的基因，或具有如SEQ ID NO2所示之氨基酸序列的aFGF之编码基因，aFGF基因可与多种不同启动子/增强子元件结合，其包括但不限于启动子、增强子、转录因子结合位点及其它基因表达调控序列，如延长因子、聚腺苷酸化序列、长终端重复区域、及抗生素抗药性基因。这些载体之表达元件可具有不同强度与专一性，并且视所使用之宿主/载体系统，可使用多数适当转录及翻译元件的其中之一。启动子的形式可能是与所需基因自然结合的启动子。另外，DNA的位置可能受重组或异性启动子，也就是通常不与此基因联合之启动子所控制。启动子在任何情况下包括有效连结的启动子，是指启动子在上述任何实施例启动如SEQ ID NO1所示之aFGF基因转录的情况。
本发明将由以下之实例做进一步说明，但不应以此限定本发明之范围。
实例1构建pPAM-AAV质粒包含全长人类aFGF cDNA并产生AAV-aFGF粒子构建pPAM-AAV质粒包含人类aFGF及/或细菌lacZ的cDNA如下，首先克隆并扩增人类aFGF eDNA，使用扩充高精确度PCR系统(RocheDiagnostics有限公司，德国Nonnenwald)对由人脑cDNA基因库(ClontechLaboratories公司，美国，加州，山景市)所取得之人类aFGF cDNA以下列条件，包括在95℃进行30秒、60℃进行60秒、及72℃进行30秒的30个循环之PCR步骤，进行人类aFGF的PCR分析。对于对照载体，则以下列条件，在95℃进行30秒、55℃进行60秒、及72℃进行30秒的30个循环之PCR反应由pDNR-lacZ供体报导子(Clontech Laboratories公司，美国，加州，山景市)扩增全长细菌lacZ cDNA的报导基因。aFGF及/或细菌lacZ的引物购自于生工有限公司(台湾，台北)，其序列所列如下。
人类aFGF的引物(正向定序引物位置为如SEQ ID NO3所示的5’-ATGGCTGAAGGGGAAATC-3’；及反向定序引物位置为如SEQ ID NO4所示的5’-TTAATCAGAAGAGACTGGCAGGGG-3’)细菌lacZ的引物(正向定序引物位置为如SEQ ID NO5所示的5’-ATGTCGTTTACTTTACTTTGACCAACAAG-3’；及反向定序引物位置为如SEQ ID NO6所示的5’-CTTTTTTTGACACCAGACCAACTGG-3’)。
直接将扩增的片段克隆到pGEM-T easy TA载体系统(Promega公司，美国，威斯康星州，麦迪逊市)，以取得如图1A所示的A2殖株包含人类aFGF之cDNA，接着以限制酶EcoRI消化A2殖株并溶离，使含有人类aFGF序列的溶离片段与EcoRI-消化pBluescript-SK质粒(Stratagene公司，美国，加州，拉荷雅市)连接，结果产生含aFGF序列之pBluescript质粒并与两个可能方向的精确序列查对后，显示为图1B的A4殖株。随后通过连接A4殖株之较小片段与限制酶HindIII/XbaI所共同消化之pSub201质粒，产生含有人类aFGF cDNA的AAV质粒。载有人类aFGF cDNA的AAV质粒如图1C显示为pPAM-AAV并在随后的实例简称为AAV-aFGF。含有野生型AAV基因体以及重组辅助质粒pDG的质粒pSub201是由马许医生(台北荣民总医院，整形手术科)(参考数据The Journal of Trauma，March2003；54(3)569-73，“以腺相关病毒载体进入蟹足肿组织的基因疗法”)所赠。
通过磷酸钙质粒转染法在HEK293细胞(Life Technology公司，美国，纽约州，长岛市)包装成熟病毒粒子。AAV粒子的包装如图1D所示，以载有aFGF cDNA的pPAM-AAV质粒以及含有野生型AAV与AAV包装所需之腺病毒基因的pDG辅助质粒共同转染细胞。在转染后48小时以棉棒收集细胞，悬浮在Opti-MEN溶液(GibcoInvitrogen公司，美国，加州，卡尔斯巴德)并以高频声波分裂细胞，接着对细胞悬浮液与三分之一容量的三氟二氯乙烷(1，1，2-tri-chloro-trifluoroethane)进行两轮的氯化铯密度梯度离心(cesium chloride density gradient centrifugation)以进一步纯化AAV-aFGF粒子。接着进行病毒制备的第一型脱氧核糖核酸水解酶(DNaseI)处理，以消化未用病毒核子包覆的脱氧核糖核酸，并且将含有纯化AAV-aFGF粒子的上清液保存在-80℃，通过Progen生技有限公司(德国，海德堡)所取得的三明治酶联免疫吸附检测法(ELISA)试剂盒预测纯化AAV-aFGF粒子的滴定浓度，并同样根据制备AAV-aFGF粒子的步骤制备AAV-lacZ粒子。
实例2在培养PC12神经细胞之重组AAV-aFGF的活体外功能性检测在含有85％(v/v)RPMI-1640(GibcoInvitrogen公司，美国，加州，卡尔斯巴德)、10％(v/v)热钝化马血清、5％(v/v)胎牛血清(Biochrom有限公司，德国柏林)、2mM麸酰胺、以及25mM HEPES缓冲液在pH7.3具有100U/ml盘尼西林与100μg/ml链霉素的培养基内培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞(美国菌种中心编号CRL-1721TM)，在具有5％二氧化碳的保湿保温箱内维护PC12细胞。在分析PC12细胞时，以补充2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基培养PC12细胞。此外，对细胞培养添加100ng/ml神经生长因子(CytoLab公司，以色列，雷霍沃特)以提供分析PC12细胞之分化及/或增生的正对照组。其它所有材料都是购自于Sigma化学公司(美国，密苏里州，圣路易市)。
在神经细胞的分化分析，以每孔5×105细胞的密度再次于6孔培养盘培养细胞。为要测量AAV-aFGF所诱发的神经突外长，以含有对照载体或不同量之AAV-aFGF(每细胞具有200、2000或20000病毒粒子)的无血清RPMI替换培养基。将细胞暴露于AAV-aFGF 8小时后，移除含病毒之无血清培养基，再以补充2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基培养细胞24或48小时。以含4％三聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebuffer saline，PBS)溶液固定细胞后，在显微镜(EclipseT100TM，Nikon公司，日本，东京)下观察并拍摄神经突外生长的程度。神经突之全长测量取自于每个条件至少100个细胞、三个重复培养孔及三个独立实验，并使用美国国家卫生研究院(National Health Institute，NIH)图像软件ImageJ所量化，该图像软件可由NIH网站http://rsb.info.nih.gov/ij/所取得。
请参照图2A，当细胞以AAV-aFGF粒子处理时，可于PC12细胞发现神经突外生长，显示AAV-aFGF引起脑神经细胞分化，在滴定浓度增加到200、2000及20000个AAV-aFGF粒子时，会增加神经突外生长的全长(以μm为测量单位)，而当培养期由24小时延长到48小时，也会在特定滴定浓度增加PC12细胞的脑神经细胞分化。
为测量AAV-aFGF的增生效果，在37℃补充2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基以每孔5×103个细胞的密度于96孔培养盘培养PC12细胞。以含有对照载体或不同量之AAV-aFGF(每细胞具有200、2000或20000病毒粒子)的无血清RPMI替换培养基。将细胞暴露在AAV-aFGF8小时后，移除含病毒之无血清培养基，再以补充2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基培养24小时。培养24小时后，利用温的无血清RPMI-1640清洗细胞并在所检测的孔内添加0.1ml MTT(3-[4，5-dimethyl-thiazol-2-yl]2，5-diphenyltetrazolium bromide)(Promega公司，美国，加州，圣路易欧比斯波)工作溶液(5mg/ml MTT在无血清RPMI-1640)，在37℃培养3小时后，移除工作溶液并对细胞添加MTT溶解缓冲液(20％SDS与50％DMF溶于二次水)反应6小时。使用TecanSunriseTMELISA阅读机(Phenix研究产品公司，美国，加州，海沃市)在波长570nm测量吸光值，并在波长650nm减除背景值。并且也利用显微镜的tryptan blue排除检测法及具有碘化丙啶染色的流式细胞技术分析aFGF所引起的细胞增生。通过比较每一组所测量的吸光值与作为100％之对照组所测量的吸光值(在波长570nm具有在波长650nm的背景减除)，计算出每一组之细胞增生百分比。
如图2B所示，当剂量增加到每个细胞200、2000及20000个AAV-aFGF粒子时会增加PC12细胞的增生。例如，在以每个细胞2000或20000个病毒粒子的剂量处理细胞会增加120％的细胞增生，因此AAV-aFGF对PC12细胞的分裂效果呈剂量依存反应(dose-dependentresponse)。
实例3重组AAV-aFGF在活体外表达的定性与定量分析以无血清RPMI内的重组AAV-aFGF感染PC12细胞8小时，接着在补充2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基内培养细胞24小时以进行免疫细胞化学分析，并分别在培养基内培养24、48及72小时以进行蛋白印迹(Western Blot)分析。
进行免疫细胞化学分析时，在AAV感染24小时后以甲醇/丙酮/PBS(容积比为1∶1∶8，溶于10mM MES，pH6.9、0.1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)及氯化镁溶于1倍PBS)于4℃固定PC12细胞25分钟，接着以1倍PBS(含0.1％吐温20)清洗两次，在室温以溶于PBS的1％胎牛血清阻隔细胞大约2至3小时。以PBS清洗细胞后，在室温以抗aFGF多株抗体(Santa Cruz生技公司，美国，加州，圣塔克鲁斯市)培养细胞两个小时，随后以PBS与水清洗细胞并进一步以溶于PBS之50％与70％乙醇及100％乙醇进行梯度溶剂清洗，接着在显微镜下观察细胞。当细胞以每个细胞2×103或2×104个AAV-aFGF粒子处理时会发现细胞因显性特征改变，如神经突的形成而产生细胞分化。
在进行如SEQ ID NO2所示之aFGF蛋白质水平的蛋白印迹(WesternBlot)分析时，于每一时间点(AAV感染后24、48及72小时)收集细胞，通过离心收集细胞并将其溶解于溶解缓冲液(1％NP-40含30mM焦磷酸钠(Na4P2O7)、30mM氟化钠(NaF)、1mM钒酸钠(Na3VO4)及1倍的蛋白酶抑制剂综合锭(Roche Diagnostics有限公司，德国，Nonnenwald))。随后通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳(SDS-PAGE)分离10μg的样本并使用抗aFGF多株抗体(Santa Cruz生技公司，美国，加州，圣塔克鲁斯市)分析如SEQ ID NO2所示的aFGF表达水平，进行SDS-PAGE及免疫点渍的方法是根据Conway等人(Conway et al.，1999，Biochemical Journal 337171-177)所述的方法。请参照图3A，由于以每个细胞20000个AAV-aFGF粒子的剂量感染PC12细胞超过72小时比以较低剂量并较短时间感染的细胞具有较高的表达水平，以绝对光密度所测量的分析如SEQ ID NO2所示之aFGF蛋白质水平是以时间与剂量依存方式增加。
进行进一步分析以判断如SEQ ID NO2所示之aFGF是否能分泌到胞外环境(extracellular environment)。以无血清RPMI培养基内之AAV-aFGF(1μl)感染PC12细胞8小时后，在含有2％马血清与1％胎牛血清的RPMI培养基内培养细胞24小时。在培养24小时后，移除含血清培养基并另以无血清RPMI培养基培养细胞3小时，接着收集以AAV感染之PC12细胞所产生的无血清条件培养基。此外，在条件培养基内注射1ng的重组人类aFGF蛋白以提供正对照组。使用透析膜管(3号3.5kDa的截断大小，Spectrum Microgon公司，美国，加州，拉古纳岗)透析条件培养基，并以冷冻干燥机(Labconco公司，美国，密苏里州，堪萨斯市)进行冷冻干燥及浓缩，接着对完全冷冻干燥样本进行上述SDS-PAGE分离及蛋白印迹(Western Blot)分析。
请参照图3B，以1μl AAV-aFGF感染的细胞在条件培养液显示很少或没有增加aFGF的表达，表示如SEQ ID NO2所示之aFGF没有从细胞溶质分泌或释放到胞外区域。
实例4Sprague-Dawley(SD)大鼠的脊椎神经挫伤及使用重组AAV-aFGF转导活体内人类aFGF基因进入非受伤或受伤成鼠的脊椎神经。
由台湾科会动物中心取得SD大鼠，在此实验选取重量为240至280克的SD母鼠引发脊椎神经受损(Spinal Cord Injury，SCI)，动物处理与实验步骤由荣民总医院动物研究次委员会所仔细审核与通过，麻醉SD母鼠并在脊椎神经的T9-10层进行椎弓切除减压手术(laminectomy)，在椎弓切除减压手术后使用纽约大学(New York University，NYU)重量坠落组件，如NYU冲击式损伤机，从25至50mm的高度坠落10公克的棒子以引发脊椎神经受损，使挫伤组的脊椎神经背面受损。没有脊椎神经受损的SD鼠作为模拟组，与挫伤组及没有进行任何前处理与椎弓切除减压手术的正常组形成对照，同时在脊椎神经受损的7、14、21及28天后，以移动评比等级(locomotor rating scale)对受损程度进行定量测量。
此外，在椎弓切除减压手术后于模拟+AAV-aFGF组之SD鼠脊椎神经的T8与T10段注射AAV-aFGF，挫伤+AAV-aFGF组之SD鼠在脊椎神经受损5分钟后于神经受损中心点前后大约1至2mm处注射AAV-aFGF。为要给予AAV-aFGF，先将大鼠放在立体定位笼(stereotaxic frame)，再通过装有标准规格33之斜口针头的5μl注射器(Hamilton syringe)以每分钟0.5μl的注射速率，以两分钟注射1μl重组AAV-aFGF至脊椎神经的目标位点。注射后一分钟向后退回针头0.5mm，并多维持一分钟后，再由脊椎神经抽离。
为要在脊椎神经找出人类aFGF转植基因的表达，解剖大鼠的脊椎神经后固定及冷冻保存，并在七天后使用冷冻切片机制作连续横向切片以进行免疫组织分析。在手术后七天以正常生理食盐水及溶于PBS的4％仲甲醛(paraformaldehyde)灌注模拟组的大鼠，接着移除脊椎神经并以溶于PBS的4％仲甲醛固定两小时。在0.8M蔗糖溶液内储存脊椎神经两周后，于-20℃使用冷冻切片机水平切割脊椎神经成厚度10m的切片。在AAV感染14天后，以抗aFGF单株或多株抗体(Santa Cruz生技公司，美国，加州，圣塔克鲁斯市，R&D Systems公司，美国，明尼苏达州，明尼亚波里斯)来对脊椎神经切片的aFGF免疫反应进行染色并拍摄。请参照图4，在脊椎神经的腹角区(ventral horn area)发现了具有aFGF的神经细胞。
为要分析在AAV-aFGF刺激后aFGF的表达水平，即刻移除脊椎神经组织、解剖成切片或区域并在手术后冷冻3及7天。对使用高纯度RNA萃取分离试剂盒(Roche Diagnostics有限公司，德国，Nonnenwald)，从有或没有AAV感染之脊椎神经T9段所分离的total RNA(5μg)进行反转录PCR分析，使用SuperScript单一步骤RT-PCR系统(Invitrogen公司)进行反应(RT步骤55℃进行30分钟；30个循环的PCR步骤95℃进行30秒、60℃进行55秒及72℃进行30秒)以判断人类aFGF的mRNA水平。人类aFGF的引物(正向引物为如SEQ ID NO7所示的5’-CGAATTCACTAGTGATTATGG-3’及反向引物为如SEQ ID NO8所示的5’-CTGCAGGAATTCGATTTTAATC-3’)。
大鼠肌动蛋白的引物(正向引物为如SEQ ID NO9所示的5’-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3’及反向引物为如SEQ ID NO10所示的5’-AGCGATGCCTGG-GTACATGG-3’)。
在PCR反应后，由0.5％琼酯凝胶分离cDNA产物并以50μM溴化乙锭溶液进行染色，染色的胶体配合Foto/UV-26系统(Fotodyne公司，美国，威斯康星州，哈特兰)并使用Polaroid胶体照相机TM，以黑白实时包胶卷(Polaroid公司，英国，赫特福德郡)拍摄，使用NIH发行的软件ImageJ进行RT-PCR产物水平的定量。
请参照图5A，在脊椎神经组织所表现的mRNA水平以计量依存方式所增加。然而，当重组AAV-aFGF的计量增加到1μl时，发现表现水平显著的增加。
在AAV-感染后的每一时间点(24、48及72小时)收集细胞，以蛋白印迹(Western Blot)分析法分析胞内aFGF的蛋白质水平。由脊椎神经收集的细胞质蛋白不需进行进一步蛋白质纯化步骤。将细胞离心并溶于溶解缓冲液(1％NP-40含30mM焦磷酸钠(Na4P2O7)、30mM氟化钠(NaF)、1mM钒酸钠(Na3VO4)及1倍的蛋白酶抑制剂综合锭(Roche Diagnostics有限公司，Nonnenwald，德国))，使用Bio-RadDC试剂盒(Bio-Rad Laboratories公司，美国，加州，Hercules)检测组织样本的蛋白质浓度。由脊椎神经组织T9段所取得的30μg蛋白质以SDS-PAGE分离，并分别以抗aFGF抗体及抗肌动蛋白抗体在蛋白印迹(Western Blot)分析法分析aFGF及肌动蛋白的表达水平。如图5B所示，感染AAV-aFGF的脊椎神经较没有感染的脊椎神经稍微表达更高的如SEQ ID NO2所示之aFGF蛋白。此外，使用50μg的组织蛋白样本，利用aFGF ELISA Quantikine试剂盒(R&DSystems公司，美国，明尼苏达州，明尼亚波里斯)分析准确的蛋白质水平，在每一组50μg的蛋白样本内计算如SEQ ID NO2所示之aFGF的水平(pg/ml)，并如以下表1所示。
表1


单位pg/ml如表1所列，不论处理期间为3天或14天，接受AAV感染的模拟组通常较没有AAV感染的仿真组显示更高的aFGF表达，接受AAV感染的挫伤组则比没有AAV感染的挫伤组显示更显著的aFGF表达增加。
此外，对这些活体内组织样本进行进一步的蛋白质纯化。将每一样本直接通过Ultrafree-0.5离心过滤器(Millipore公司，美国，麻州，比勒瑞卡)并收集残留上清液，以具有连结缓冲液(10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)的肝磷素亲合性管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美国，纽泽西州，Piscataway)分离上清液并以梯度连结缓冲液(包括梯度浓度为0.15M、0.5M、0.8至1.5M的氯化钠溶于pH7.0，10mM磷酸钠缓冲液)洗脱，洗脱的蛋白质溶液再通过SephadexG25旋转管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美国，纽泽西州，Piscataway)去盐，并以冷冻干燥机(Labconco公司，美国，密苏里州，堪萨斯市)进行冷冻干燥并浓缩。以SDS-PAGE分离总冷冻干燥样本，并分别以抗aFGF抗体及抗肌动蛋白抗体在蛋白印迹(Western Blot)分析法分析如SEQ ID NO2所示之aFGF的表达水平。
请参照图5C，感染AAV-aFGF的脊椎神经比没有以任何AAV-aFGF感染的脊椎神经显示较高的如SEQ ID NO2所示之aFGF蛋白表达，以1μl的AAV-aFGF感染脊椎神经将显著增加蛋白质表达。
实例6行为评估所有动物在手术后1至6周的期间每周接受两个行为测试，拍摄所有行为测试，且参与行为评估的两位检测人员并不清楚那些为经处理之动物。以Basso，Beattie，Bresnahan(BBB)开放田间移动测试(Basso等人(1995)Journal of Neurotrauma 121-21)及综合行为分数(CBS)评估大鼠的后肢移动行为。
首先，在开放田间(至少150cm×100cm)进行大鼠的BBB分析，脊椎神经挫伤的大鼠分别有8只为对照载体处理组(SCI)、12只为AAV-aFGF处理组(SCI+AAV-aFGF)及3只为AAV-lacZ处理组(SCI+AAV-lacZ)，每一段时间持续5分钟。通过观察并对涉及臀部动作、膝盖动作、关节动作以及躯干与尾巴或后肢之间位置的行为计分以决定开放田间移动分数，另外也决定踏步、脚趾分开、脚掌放置、重量支撑及协调性的详细预测，分数范围包括由0到21(0为没动作，21为正常动作)。请参照图6A，SCI-AAV-aFGF组显示显著的分数增加，表示接受脊椎神经内注射AAV-aFGF之挫伤大鼠比没有注射AAV-aFGF或注射AAV-lacZ之挫伤大鼠的复原状况更好。相较于SCI组或SCI+AAV-lacZ组，SCI-AAV-aFGF组在第四周至第六周的分数增加最为显著。
接着，CBS分析为综合了Tarlov计分系统测试、评估单一及复杂反射动作，还有自发与引发运动型态之倾斜面测试的综合测试，此多重测量包含运动功能、甲趾分开、归正动作、退缩反应、放置、倾斜面及游泳测试，将记录的行为水平分级并计分。失去多数活动力的大鼠为100分，最明显具有活动力改善的大鼠为少于100分并接近0分。如图6B所示，以AAV-aFGF处理之挫伤大鼠的CBS分数随着时间降低，处以AAV-aFGF的挫伤大鼠比那些接受AAV-lacZ或对照载体之SCI大鼠的CBS分数较低，因此接受AAV-aFGF处理之挫伤大鼠的活动力具有最显著的改善。
由以上之描述得知，所属技术领域：
的技术人员可轻易了解本发明中之必要特征，且在不悖离其精神及范围下，可做各种改变及修改以使本发明适用于各种用途及情况。
序列表<110>郑宏志<120>治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体<130>6P04065-TW<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2357<212>脱氧核糖核酸<213>人类<400>1gagccgggct actctgagaa gaagacacca agtggattct gcttcccctg ggacagcact 60gagcgagtgt ggagagaggt acagccctcg gcctacaagc tctttagtct tgaaagcgcc 120acaagcagca gctgctgagc catggctgaa ggggaaatca ccaccttcac agccctgacc 180gagaagttta atctgcctcc agggaattac aagaagccca aactcctcta ctgtagcaac 240gggggccact tcctgaggat ccttccggat ggcacagtgg atgggacaag ggacaggagc 300gaccagcaca ttcagctgca gctcagtgcg gaaagcgtgg gggaggtgta tataaagagt 360accgagactg gccagtactt ggccatggac accgacgggc ttttatacgg ctcacagaca 420ccaaatgagg aatgtttgtt cctggaaagg ctggaggaga accattacaa cacctatata 480tccaagaagc atgcagagaa gaattggttt gttggcctca agaagaatgg gagctgcaaa 540cgcggtcctc ggactcacta tggccagaaa gcaatcttgt ttctccccct gccagtctct 600tctgattaaa gagatctgtt ctgggtgttg accactccag agaagtttcg aggggtcctc 660acctggttga cccaaaaatg ttcccttgac cattggctgc gctaaccccc agcccacaga 720gcctgaattt gtaagcaact tgcttctaaa tgcccagttc acttctttgc agagcctttt 780acccctgcac agtttagaac agagggacca aattgcttct aggagtcaac tggctggcca 840gtctgggtct gggtttggat ctccaattgc ctcttgcagg ctgagtccct ccatgcaaaa 900gtggggctaa atgaagtgtg ttaaggggtc ggctaagtgg gacattagta actgcacact 960atttccctct actgagtaaa ccctatctgt gattccccca aacatctggc atggctccct 1020tttgtccttc ctgtgccctg caaatattag caaagaagct tcatgccagg ttaggaaggc 1080agcattccat gaccagaaac agggacaaag aaatcccccc ttcagaacag aggcatttaa 1140aatggaaaag agagattgga ttttggtggg taacttagaa ggatggcatc tccatgtaga 1200ataaatgaag aaagggaggc ccagccgcag gaaggcagaa taaatccttg ggagtcatta 1260ccacgccttg accttcccaa ggttactcag cagcagagag ccctgggtga cttcaggtgg 1320agagcactag aagtggtttc ctgataacaa gcaaggatat cagagctggg aaattcatgt 1380ggatctgggg actgagtgtg ggagtgcaga gaaagaaagg gaaactggct gaggggatac 1440cataaaaaga ggatgatttc agaaggagaa ggaaaaagaa agtaatgcca cacattgtgc 1500ttggcccctg gtaagcagag gctttggggt cctagcccag tgcttctcca acactgaagt 1560gcttgcagat catctgggga cctggtttga atggagattc tgattcagtg ggttgggggc 1620agagtttctg cagttccatc aggtcccccc caggtgcagg tgctgacaat actgctgcct 1680tacccgccat acattaagga gcagggtcct ggtcctaaag agttattcaa atgaaggtgg 1740ttcgacgccc cgaacctcac ctgacctcaa ctaaccctta aaaatgcaca cctcatgagt 1800ctacctgagc attcaggcag cactgacaat agttatgcct gtactaagga gcatgatttt 1860aagaggcttt ggccaatgcc tataaaatgc ccatttcgaa gatatacaaa aacatacttc 1920aaaaatgtta aacccttacc aacagctttt cccaggagac catttgtatt accattactt 1980gtataaatac acttcctgct taaacttgac ccaggtggct agcaaattag aaacaccatt 2040catctctaac atatgatact gatgccatgt aaaggccttt aataagtcat tgaaatttac 2100tgtgagactg tatgttttaa ttgcatttaa aaatatatag cttgaaagca gttaaactga 2160ttagtattca ggcactgaga atgatagtaa taggatacaa tgtataagct actcacttat 2220ctgatactta tttacctata aaatgagatt tttgttttcc actgtgctat tacaaatttt 2280cttttgaaag taggaactct taagcaatgg taattgtgaa taaaaattga tgagagtgtt 2340aaaaaaaaaa aaaaaaa 2357<210>2<211>155<212>蛋白质<213>人类
<400>2Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1 5 10 15Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser20 25 30Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly35 40 45Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu50 55 60Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu65 70 75 80Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu85 90 95Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr100 105 110Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys115 120 125Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala130 135 140Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145 150 155<210>3<211>18<212>脱氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>3atggctgaag gggaaatc 18<210>4<211>24<212>脱氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>4ttaatcagaa gagactggca gggg 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>5atgtcgttta ctttgaccaa caag 24<210>6<211>25<212>脱氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列
<400>6ctttttttga caccagacca actgg 25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>7cgaattcact agtgattatgg 21<210>8<211>22<212>脱氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>8ctgcaggaat tcgattttaatc 22<210>9<211>20<212>脱氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>9aagatcctga ccgagcgtgg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>10agcgatgcct gggtacatgg 20
权利要求
1.一种治疗神经损伤的载体构建体，其包括病毒载体承载酸性成纤维细胞生长因子的编码基因。
2.根据权利要求
1所述的载体构建体，其中该基因具有如SEQ IDNO1所示之脱氧核糖核酸序列。
3.根据权利要求
1所述的载体构建体，其中该基因是aFGF的编码基因具有如SEQ ID NO2所示之氨基酸序列。
4.根据权利要求
1所述的载体构建体，其中该病毒载体至少包括腺相关病毒基因与腺病毒基因的其中之一。
5.根据权利要求
4所述的载体构建体，其中以该病毒载体感染神经损伤部位，使该基因传递到该神经损伤部位并在该神经损伤部位表达该基因。
6.根据权利要求
5所述的载体构建体，其中该神经损伤部位至少包括神经器官、神经组织、可以载体转导的神经细胞系统及神经细胞或其突起所在位置的其中之一。
7.根据权利要求
1所述的载体构建体，其中还包括病毒基因体，使病毒载体装入病毒粒子。
8.根据权利要求
1所述的载体构建体，其中还包括报导基因。
9.根据权利要求
8所述的载体构建体，其中该报导基因是细菌半乳糖酶的互补脱氧核糖核酸。
10.一种再生神经细胞的载体构建体包括病毒载体承载aFGF的编码基因。
11.根据权利要求
10所述的载体构建体，其中该基因具有如SEQ IDNO1所示之脱氧核糖核酸序列。
12.根据权利要求
10所述的载体构建体，其中该基因具有如SEQ IDNO2所示之氨基酸序列。
13.根据权利要求
10所述的载体构建体，其中该病毒载体至少包括腺相关病毒基因与腺病毒基因的其中之一。
14.根据权利要求
13所述的载体构建体，其中以该病毒载体感染该神经细胞，使该基因传递到该神经细胞并在该神经细胞内表达该基因。
15.根据权利要求
14所述的载体构建体，其中该神经细胞至少包括星状细胞、寡凸细胞、神经胶细胞、脉络丛细胞、室管膜细胞、脑脊椎神经膜细胞、许旺氏细胞、神经母细胞、微胶细胞、脊椎神经组织内细胞及以该基因转型的神经源细胞株的其中之一。
16.根据权利要求
10所述的载体构建体，其中还包括病毒基因体，使病毒载体装入病毒粒子。
17.根据权利要求
10所述的载体构建体，其中还包括报导基因。
18.根据权利要求
17所述的载体构建体，其中该报导基因是细菌半乳糖酶之互补脱氧核糖核酸。
专利摘要
本发明提供一种治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体，包括病毒载体承载酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)之编码基因。
文档编号C12N15/63GKCN1977976SQ200610103261
公开日2007年6月13日 申请日期2006年7月20日
发明者郑宏志, 张佩德 申请人:郑宏志导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan