专利名称:基于印记位点调节物兄弟(boris)的预防性癌症疫苗的制作方法
基于印记位点调节物兄弟(BORIS)的预防性癌症疫苗
发明领域
本发明涉及用于产生肿瘤疫苗的组合物和方法。
背景
脊椎动物能够产生作为针对来自环境的病原体以及针对内部产生的异常细胞，如肿瘤细胞的防御的免疫应答。免疫应答是多种细胞和因子之间复杂相互作用的结果，但是通常包含两个主要方面。一个方面是细胞组分，其中特化细胞直接攻击触犯物(具有抗原)，而另一方面是体液组分，其中抗体分子特异结合抗原并且帮助它的清除。个体成分一致地相互作用可以十分有效地限制入侵病原体的最初攻击和从宿主清除它们。
涉及提供免疫应答的初级细胞是淋巴细胞，其通常包含两种主要类别。第一种称作B细胞或B淋巴细胞，通常在骨髓中产生，并且负责产生和分泌抗体等。B细胞抗体产物倾向于与外来抗原直接作用并且中和它们或活化免疫系统的其他组分来消除外来抗原。具体地，调理性抗体结合细胞外外来物，从而使得它们易受吞噬和随后的细胞内杀死。另一方面，T细胞或T淋巴细胞通常在胸腺中产生或成熟，负责介导细胞免疫应答。这些细胞不识别完整抗原，而是应答其短肽片段，该短肽片段结合到出现在靶细胞以及抗原呈递细胞的表面上的特化蛋白质。更具体地，似乎细胞内产生的蛋白质或者细胞从胞外环境摄入的蛋白质被正常代谢途径连续地降解成肽。所得短片段与细胞内主要组织相容性复合体(MHC)分子结合并且MHC-肽复合体转运到细胞表面上以被T细胞识别。从而，细胞免疫系统不断监视细胞产生或摄入的全范围的蛋白质并且将消除呈递外来抗原或肿瘤抗原的任何细胞，即，受病毒感染的细胞或癌细胞。
免疫球蛋白G(IgG)的结构是四聚体蛋白质复合体结构，其包含两条相同的重(H)链和两条相同的免疫球蛋白轻(L)链。这些链通过二硫键连接在一起形成Y形抗体复合体。然而，在溶液中，所述分子呈现更球状形状并且易于结合生物体液中存在的外来抗原。免疫球蛋白的氨基酸序列分析已经导致在链内具有多种功能活性的特定区域的限定。每条轻链和每条重链具有在前110个氨基末端残基内限定的可变区(分别为/和Vh)。/和Vh区的三维配对构成了免疫球蛋白分子的抗原识别部分或者“抗原结合部位”(“ACS”)。因为免疫球蛋白的四聚体性质，每个分子有两个相同的抗原结合部位。这些链的可变结构域在序列中高度异质并且提供了抗原结合部位对许多抗原结构高度特异的多样性。可变结构域的异质性在整个可变区中不是均匀分布，而是位于三个片段中，所述三个片段称作互补性决定区(“⑶R”)，称作CDR1、⑶R2和⑶R3。关于这些结构的更多信息，见Watson等人，1987,Molecular Biology of the Gene,第四版,Benjamin/Cummings Publishing C0.,Inc.Menlo Park, Calif.，此处将其引用作为参考。
每条重链还包括限定特定同种型的恒定区并且将免疫球蛋白分配到免疫球蛋白类别和亚类之一。恒定区含有称作结构域的单位(即，Cm、Ch2等等)，其在单一类别的抗体中不显著不同。恒定区不参与抗原结合，但是可以与称作“效应子功能”的许多生物活性相关，所述效应子功能为诸如结合细胞表面上的Fe受体以及结合补体蛋白质。抗原呈递细胞如树突细胞和巨噬细胞的特征通常通过Fe受体的存在来区别。因此，如果抗体结合病原体，那么它可以通过Fe部分连接巨噬细胞。这允许病原体被巨噬细胞摄入和破坏一一种称作调理作用的过程。此外，如将在下面更详细讨论的，多种病原性抗原可以被APC加工和展示以进一步刺激免疫应答。
不像重链，轻链具有一个恒定结构域(CJ。轻链通过二硫键与重链配对，所述二硫键连接重链恒定区Chi与Q。此外，重链具有铰链区，其将恒定区Chi和Ch2与分子的剩余部分分开。该铰链区主要造成四聚体的柔性。分子的两条重链通过铰链区和Ch2之间接头处的二硫键配对在一起。
为了提供这种广泛所有组成成分，免疫球蛋白基因已经进化成允许从有限数目的基因产生许多种不同的免疫球蛋白蛋白质，即固有多态性。由于固有多态性，哺乳动物能够产生针对似乎无数种抗原的抗体。关于免疫球蛋白遗传学和蛋白质结构的综述见Lewin, " Genes III" , John Wiley andSons, N.Y.(1987)和 Benjamini 和 Leskowitz,1988, Immunology, AlanR.Liss, Ine., New York,将其并入本文作为参考。
在过去几年里，抗体由于它们的多样性和特异性已经在诊断和治疗应用中变得非常重要。分子生物学技术越来越多地用于扩大用于科学应用的抗体的种类和可用性。例如，产生一种抗体的B细胞可以与 肿瘤细胞融合永生化并扩大以提供具有单一特异性的抗体的体外来源，所述抗体称作“单克隆抗体”(mAb)。此类永生化B细胞系称作“杂交瘤”。
直到最近，多数mAb的来源是体外培养的鼠(小鼠)杂交瘤。即，通常用所选抗原或者免疫原注射小鼠。随后，处死动物并将从其脾脏除去的细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。尽管它们已经广泛用于诊断方法，但是鼠mAb不能很好地适于包括人的多数哺乳动物中的治疗应用。这部分是由于鼠抗体被其他哺乳动物物种识别为外来的并且引起免疫应答，其本身可以导致疾病。
为了克服至少一些外来mAb产生的免疫应答和缺少适宜的人mAb的问题，已经用基因工程构建人源化嵌合免疫球蛋白分子，其含有鼠抗体的抗原结合互补性决定区，但是其中该分子的剩余部分由不被识别为外来物的人抗体序列组成。此类抗体已经用于治疗肿瘤，因为小鼠可变区识别肿瘤抗原并且分子的人源化部分能够介导免疫应答而不被身体快速清除。见，例如，Jones等人，Nature，321:522-525 (1986)，将其并入本文作为参考。
此类抗体的其他用途在PCT公开号WO 94/14847中详细描述，将W094/14847也并入本文作为参考。在这些情况中，将外来抗原的表位，如病毒或者细菌表位嫁接到免疫球蛋白的高变区以诱导应答。即，工程化抗体用作疫苗引起免疫应答和赋予长期免疫原性记忆，从而允许受试者击退随后的感染。
这些和更常规的疫苗是有效的，因为它们刺激免疫系统的两个叉。尽管与免疫应答的体液组分相关的复杂性，但是它将不会自身能够有效保护动物免于受试者每天受到的无数病原性攻击。相反地，只有高度进化的细胞应答的存在才允许高级生物幸存和繁殖。
如上面指出的，从骨髓中前体细胞产生的T淋巴细胞或者T细胞是针对入侵病毒和其他微生物的免疫应答中的主要成员。祖先干细胞迁移到胸腺，在胸腺中，作为所称作的胸腺细胞，它们变得特化。具体地，它们开始展示受体分子，所述受体分子后来使得成熟T细胞检测感染。为了有益，T细胞必须通过它们的受体附着到抗原(蛋白质标记物信令入侵物的存在)。同时，它们将对身体产生的物质不反应(blind)，因为自身反应性T细胞可以破坏正常组织。通常，仅仅产生有用受体的那些胸腺细胞将完全成熟并且进入血流以巡视身体。健康个体中将无效或者将攻击身体的自身组织的其他胸腺细胞在离开胸腺前通过程序性细胞死亡清除。
最后进入循环作为溶细胞T淋巴细胞或者T辅助细胞的成熟T细胞保持静止，除非它们遇到它们的受体可以识别的抗原。当遇到淋巴细胞对其具有亲和性的特异抗原时，它们增殖并进行效应子功能，其结果是外来抗原的清除。
已经将T细胞基于它们执行的不同任务分类成一些亚群。这些亚群包括辅助T细胞(Th)，其是促进或增强T和B细胞应答所需的；细胞毒性(或者溶细胞)T淋巴细胞(CTL)，其通过细胞裂解直接杀死它们的靶细胞；和抑制性或调节性T细胞(Ts或者Tr)，其下调免疫应答。在每种情况中，T细胞识别抗原，但是仅仅当通过附着到抗原呈递细胞表面的特化蛋白质复合体呈递在细胞的表面上时，T细胞才会识别所述抗原。更具体地，T细胞使用称作T细胞抗原受体(TCR)的特异受体，TCR是跨膜蛋白质复合体，其能够与共同称作主要组织相容性复合体(MHC)的一组蛋白质结合识别抗原。数千相同TCR在每个细胞上表达。TCR在功能和结构上与表面抗体(非分泌的)有关，B细胞将所述表面抗体用作它们的抗原受体。此外，T细胞的不同亚群还表达许多细胞表面蛋白质，它们的一些称作“标记蛋白质”，因为它们是特定亚群特征性的。例如多数Th细胞表达细胞表面CD4蛋白质，而多数CTL细胞表达细胞表面⑶8蛋白质，Tr细胞表达⑶25和⑶4分子。这些表面蛋白质在免疫应答的启动和维持中是重要的，所述免疫应答取决于APC表面上具体蛋白质或蛋白质复合体之间的识别和相互作用。
一段时间以来已知主要组织相容性复合体或者MHC实际上包含一系列糖基化蛋白质，其包含不同的四级结构。通常，所述结构为两种类型:1类MHC，其展示来自细胞内产生的蛋白质(如自身蛋白质或者病毒复制随后产生的蛋白质)的肽，和II类MHC，其通常展示来自从外面进入细胞的蛋白质(可溶性抗原，如细菌毒素)的肽。通过固有多态性确保多种抗原的识别，所述固有多态性提供了能够结合可能产生的任何病原性肽的MHC分子的多样库。基本上，所有有核细胞都产生和表达I类MHC，其可以显示天然发生的肽、肿瘤结合的肽或者病毒入侵者产生的肽。相反地，一些其他有核细胞和其中的特化淋巴样细胞(通常称作抗原呈递细胞)产生和表达II类MHC蛋白质。不管细胞类型，两种MHC类别都将肽携带到细胞表面并将它们呈递给静息T淋巴细胞。通常，Th细胞识别II类MHC抗原复合体，而CTL倾向于识别I类MHC抗原复合体，尽管也发生抗原的交叉呈递。
当具有适当TCR的静息T细胞遇到在它的表面展示肽的APC时，TCR结合肽-MHC复合体。更具体地，数百TCR结合许多肽-MHC复合体。当接触足够TCR时，累积效应激活T细胞。负责MHC-抗原复合体的特异识别和应答的T细胞上的受体由一些整合血浆膜蛋白质的复合体组成。如同前面讨论的MHC复合体，通过固有多态性导致体细胞重排确保TCR的多样化库。将强调尽管TCR的库可以是多样的，但是每个T细胞仅表达一种特定TCR。然而，每个T细胞通常在每个细胞表面上显示对仅一种肽特异的该受体的数千拷贝。此外，一些其他类型的膜结合的蛋白质参与T细胞结合和活化。
T细胞的活化使得产生一系列化学信号(主要是细胞因子)，其导致细胞采取直接行动或者刺激免疫系统的其他细胞采取行动。对于I类MHC抗原激活，CTL增殖并破坏呈递相同抗原的受感染细胞。杀死受感染的细胞剥夺了病毒的生命支持并且使得它易受抗体接近，所述抗体最终清除该病毒。相比，II类MHC抗原复合体对Th细胞的活化不破坏抗原呈递细胞(其是宿主防御系统的部分)，而是刺激Th细胞增殖和产生影响多种细胞的信号(再次主要是细胞因子)。结果，信号转导导致B细胞刺激、巨噬细胞活化、CTL分化和炎症的启动，等等。该协同应答是相对特异的并且针对具有II类MHC系统呈递的所述肽的外来成分。
免疫系统可以接近的身体中那些结构中表位的不断监视提供了非常有效的方式用以识别和保持“自身”和破坏侵入身体或者病理性产生的表位和它们的载体。当正常运转时，免疫应答在清除微观病原体和认为在身体中不断产生的瘤(肿瘤)细胞中令人惊奇地有效并且在极大程度上它们在变得可检测之前就被免疫系统清除。身体的某些区域，如脑、眼和睾丸受到保护而免于免疫监视，这些部位称作免疫特权的。通常，自身识别的复杂机制非常有效并且允许强烈应答仅针对外来抗原。不幸的是，免疫系统偶然功能失常并且针对宿主的细胞，引起自身免疫应答。通常，当免疫细胞上的抗原受体识别健康细胞上的特异抗原时，自身免疫将发生并且导致具有那些特定物质的细胞死亡。在许多情况中，自身免疫反应是自限的，因为当引起自身免疫反应的抗原被清除时，自身免疫反应消失。然而，在一些情况中，自身反应性淋巴细胞比它们所应该的存活地更长并且继续诱导程序性细胞死亡或者消灭正常细胞。
当前数据表明针对所有癌症的免疫保护需要产生针对恶性细胞表达的独特肿瘤抗原的强烈细胞免疫应答。结果，成功的免疫保护首先需要肿瘤细胞中表达的独特抗原(肿瘤特异抗原)和其次，靶定该肿瘤抗原的强烈T细胞免疫应答的诱导。
一些肿瘤相关的抗原是当前已知的，并且已经用于产生疫苗的临床前和临床研究。例如，PSMA, PAP和PSA是前列腺肿瘤细胞中表达的抗原。Her2/neu和MUCl是乳腺癌细胞和其他癌(包括肺癌、卵巢癌、结肠癌和胰腺癌)表达的抗原。MAGEs和MART-1是黑素瘤肿瘤细胞相关的抗原，CEA是与胰腺癌或结肠直肠癌相关的抗原。还已经描述了其他组织和/或肿瘤特异抗原。然而，尽管所 有这些抗原以正常或异常形式在肿瘤细胞中表达，但是它们也在多种正常细胞中表达，并且从而不能用于预防接种。换句话说，这些肿瘤相关的抗原仍然被免疫细胞识别为自身分子并且因此不发生免疫系统的真实活化。这造成了靶定这些肿瘤相关分子作为疫苗基础的至少两个障碍。第一个障碍是免疫系统对自身分子的无应答性(耐受性)，其限制了免疫系统产生有效细胞免疫应答的能力。第二个障碍是所产生的任意有效细胞免疫应答不应该针对表达所述祀抗原的正常细胞。这是建议上面讨论的所有肿瘤相关的抗原仅用作治疗性疫苗接种的靶标的原因。
最近已经描述了一种新的蛋白质，其能够克服与已知肿瘤相关抗原相关的问题。印记位点调节物兄弟(BORIS)首次被描述为在睾丸中发现的DNA结合蛋白。该蛋白质与CCTCC结合因子(CTCF)共有11个锌指(ZF)结构域，CCTCC结合因子是多价11_锌指核因子。CTCF是涉及基因调节的多个方面的保守的、普遍的且高度通用的因子并且形成甲基化敏感绝缘体，其调节X染色体失活和印记基因的表达。然而，BORIS在N和C末端与CTCF不同，并且在雄性生殖细胞发育期间与CTCF以相互排斥的方式表达。BORIS表达局限于睾丸并且仅在精母细胞的所选细胞亚群内，所述精母细胞在雄性生殖细胞发育期间参与甲基化标记的复原。该睾丸细胞亚群也是已知不表达CTCF的唯一正常细胞类型。因为所培养细胞中CTCF表达的抑制导致程序性细胞死亡，所以有理由假定BORIS受到活化而保持睾丸细胞中一些重要 CTCF 功能(Loukinov 等人(2002) Proc.Natl.Acad.Sc1.99 (10):6806-6811 ；将其并入本文作为参考)。
最近，阐明尽管CTCF过表达也阻断细胞增殖，但是正常BORIS阴性细胞中BORIS的表达促进细胞生长，其可以导致转化(Klenova等人(2002)Cancer Biol.12:399-414 ;将其并入本文作为参考)。人BORIS定位于20ql3区，公知其在许多相同类型肿瘤中观察到的频繁扩大和/或扩增，所述肿瘤还通常显示出在CTCF存在的16q22上共生同源基因座上杂合性的丧失(L0H)。这些区域与“热点”区相关，所述热点区与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、结肠和食管癌以及肾胚细胞瘤有关。重要的是，BORIS表达的异常活化似乎在很大比例的多种癌中发现。使用RNA印迹或者RT-PCR，Klenova等人(2002)分析了代表多数主要形式的人类肿瘤的超过200种癌细胞系中BORIS mRNA水平并检测了所测试的一半以上细胞系中的转录物。对乳腺癌样品，对于原发癌的随后分析证实了用所述细胞系得到的结果。
发明概述
本发明涉及编码印记位点调节物兄弟(BORIS)肿瘤抗原的无功能突变多核苷酸和此类多核苷酸用于原发和转移癌症的预防性疫苗接种和免疫治疗的用途。多核苷酸可以是DNA或者RNA。在一个优选实施方案中，肿瘤抗原是缺少DNA结合能力的BORIS分子的无功能突变形式。在另一优选实施方案中，至少一个锌指(ZF)结构域由于突变或缺失是无功能的并且BORIS的功能被消除。在另一优选实施方案中，突变或缺失锌指结构域的任意组合并且除去BORIS蛋白质、多肽或肽的功能。在再一优选实施方案中，缺失所有ZF结合位点。在再一优选实施方案中，编码BORIS的突变形式的多核苷酸与分子佐剂融合。在再一优选实施方案中，编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸与至少一种编码分子佐剂的其他多核苷酸混合。可以使用增加细胞免疫应答的任意分子佐剂。尤其优选细胞因子、趋化因子和共同刺激分子。尤其优选的趋化因子、细胞因子和共刺激分子为防卫素2、1112、IL18、MIPa 3、IFNy 和 CD80/86。
本发明还涉及包含编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸的载体。在优选实施方案中，所述载体指导细菌、哺乳动物、酵母细胞或者病毒系统中的表达。
本发明还涉及BORIS蛋白质、多肽或肽的无功能修饰(突变)形式。使用在序列中导入产生无功能蛋白质的缺失、替代或者加入的任意方法可以产生无功能突变体。在优选实施方案中，所述突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽缺少DNA结合能力。在另一优选实施方案中，所述突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽与常规佐剂混合。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽附着到可药用载体(主链)。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽连接到修饰BORIS的肽并且保持它的抗原性质。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽连接到蛋白质转导结构域(proteintransducing domain, PTD)。
本发明还涉及表达无功能突变BORIS分子的树突细胞。在优选实施方案中，树突细胞用编码突变BORIS分子的DNA转染。在再一优选实施方案中，用编码无功能突变BORIS分子的病毒载体感染树突细胞。在再一优选实施方案中，树突细胞装载无功能突变BORIS蛋白质、多肽、肽或者BORIS的任意无功能经修饰的蛋白质形式。
本发明包括针对BORIS蛋白 质、多肽、肽的无功能突变形式或者BORIS的任意无功能经修饰的蛋白质形式产生的细胞免疫应答。本发明包括针对BORIS蛋白质、多肽、肽的无功能突变形式或者BORIS的任意经修饰的蛋白质形式产生的抗体。
本发明还包括包含编码BORIS的任意无功能突变形式的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达无功能突变BORIS分子的树突细胞的癌症预防性或者治疗性疫苗。
本发明还涉及治疗癌症的方法，其包括对需要其的患者施用有效量的编码BORIS的任意无功能突变形式的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达或含有无功能突变BORIS分子的树突细胞(预防性疫苗)。可以通过肌内、皮下、皮内、静脉内、经鼻、直肠、阴道或者腹膜途径进行施用。癌症可以是原发或转移性癌症。患者可以患有多种不同形式的癌症。在优选实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、结肠癌或者食道癌。
附图简述
图la、b、和c给出了用pB0RIS(DNA免疫)pIL12/IL18(分子佐剂)接种小鼠(η=10)的结果。这导致保护小鼠免于用天然表达小鼠BORIS的IO4个4Τ1肿瘤细胞的攻击。
图1a对于pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体，在Y轴上显示了存活率，在X轴上显示了肿瘤攻击后的天数。图1b显示了对于pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体，肿瘤体积和肿瘤攻击后天数之间的关系。图1c显示了用pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体免疫的组之间在第21天时肿瘤体积的显著不同ΓΡ < 0.001)。
图2a和b显示了对于用pB0RIS(DNA免疫)然后用Ad5_B0RIS (病毒样颗粒)并用IO4个4T1细胞刺激的小鼠，存活百分数和肿瘤刺激后天数之间的关系(a)和肿瘤体积和刺激后天数之间的关系。数据表明至少33天刺激后针对肿瘤刺激的完全保护。
图3&，13，(3给出了用？8( 15加？正^或者pIL12/IL18然后用IO5个4T1肿瘤细胞对小鼠的基因枪免疫的结果。图3a显示了肿瘤生长更长时间至2cm3的体积，图3b显示了较低的肿瘤生长速率。图3c显示了在第14天组pBORIS/pIFNy相对于载体(p < 0.05)，pB0RIS/pIL12/IL18 相对于 pIL12/IL18 (P < 0.05)和 pB0RIS/pIL12/IL18 相对于载体(P< 0.01)之间肿瘤体积的显著差异。
图4a，b，和c显示了用pB0RIS(DNA免疫)然后注射Ad5_B0RIS (病毒样颗粒)免疫小鼠的结果。图4a显示了经接种小鼠的显著延长的存活，而图4b表明这些小鼠具有较低的肿瘤生长速率和用IO5个4T1肿瘤细胞刺激小鼠后肿瘤生长到2cm3的体积的时间延长。图4c显示了在第15天组Ad5-B0RIS相对于Ad5之间肿瘤体积的显著差异(P < 0.001)。
图5显示了通过GCG程序包，对于缺口罚分用O罚分产生的人和小鼠BORIS多肽的最佳适合比对，保守的锌指区高亮显示并且指出为ZF-1I。
发明详述
尽管本发明可以以多种不同形式体现，但是在此处公开例证本发明原理的特定阐明性实施方案。应该强调的是本发明不限于所阐明的特定实施方案。
本发明包括使用仅在免疫特权的睾丸细胞中表达并且在许多经转化的肿瘤细胞中出现的抗原来防止耐受效应，其可以诱导其他肿瘤抗原。本发明还包括在编码所述抗原的DNA中引入特定 改变以消除副作用和自身免疫反应。在该上下文中应用下面的定义。
术语“肿瘤”、“癌症”、“癌”、“瘤形成”和它们的近义词在本申请的上下文中可互换使用，用来一般指异常增生疾病和相关受影响的细胞或细胞团块。优选地，异常增生细胞在本文中指表达免疫特权的抗原。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是效应T细胞，通常是⑶8+，其可以介导具有与MHC分子结合的抗原肽的靶细胞裂解。其他细胞毒性细胞包括Y/S和CD4+NK 1.1+细胞。
免疫特权和免疫特权抗原指身体内的某些部位和抗原与免疫系统分离并且从而涉及通常不针对其产生免疫应答的抗原。异位(它们的正常免疫特权部位之外)表达的免疫特权抗原可以导致自身免疫或者肿瘤免疫。免疫特权抗原由某些肿瘤表达,导致对肿瘤和表达相同免疫特权抗原的非肿瘤位点的免疫应答。
抗原呈递细胞(APC)是可以加工和呈递与I类或II类MHC分子结合的抗原肽和递送T细胞活化必需的共刺激 信号的细胞，包括树突细胞、巨噬细胞和B细胞。
“锌指结构域”指小的独立折叠的结构域，其需要一个或多个锌离子的配位以稳定它的结构。指结构(finger)结合三个碱基对亚位点并且特定接触由相对于α螺旋起始的1、2、3和6位中的氨基酸介导。
“BORIS的无功能突变形式”指缺少功能的BORIS蛋白质、多肽或者肽。“缺少功能”意在指不能执行野生型BORIS分子的关键活性的任一种，如DNA结合、父本DNA-甲基化模
式的重建，等等。
“无功能突变体”指DNA或者氨基酸水平上的改变，其破坏所得蛋白质的野生型活性。此类改变可以是作为催化位点和/或者参与结合DNA或蛋白质的分子区中的氨基酸替代、缺失或者加入。能够破坏活性的改变的实例为参与催化或结合相互作用的关键氨基酸的缺失或替代，改变参与催化和/或结合相互作用的位点所需的三维结构的氨基酸加入，或者导致移码从而破坏所需三维结构的核苷酸加入或缺失。可以使用常规分子技术，如PCR,使用寡核苷酸等等产生突变(例如,见Sambrook,Maniatis和Fritsch)。还可以从细胞群体分离自然发生的突变(见，例如，Sambrook, Maniatis和Fritsch)。
“肽”指含有通过肽键连接的至少两个氨基酸的分子。“多肽”指含有通过肽键连接的至少10个氨基酸的分子，“蛋白质”指含有至少20个氨基酸的分子。
“编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸”指与人(SEQ ID NO:1)或小鼠(SEQID NO:3)B0RIS多核苷酸具有至少50%、60%或70%序列同一性，更可能与人(SEQ ID NO:1)或小鼠(SEQ ID NO:3)B0RIS 多核苷酸具有 75%、80%、90%、95%或96%、97%、98%或99%序列同一'丨生的多核苷酸。
“无功能突变BORIS肽、多肽或蛋白质”指BORIS分子，其不能执行野生型BORIS分子的关键活性任一种，如DNA结合、父本DNA-甲基化模式的重建，等等。“无功能突变BORIS肽、多肽或蛋白质”与人(SEQ IDNO:I)或小鼠(SEQ ID NO:2)BORIS肽、多肽或蛋白质具有至少50%、60%或70%序列同一性，更可能与人(SEQ ID NO:2)或小鼠(SEQ ID NO:4)BORIS肽、多肽或蛋白质具有75%、80%、90%、95%或96%、97%、98%或99%序列同一性。
无功能突变的BORIS分子被识别为仅在经转化的肿瘤细胞中表达的非自身抗原并且用作抗原来克服现有技术的限制。BORIS的突变形式用作理想的非毒性疫苗，因为它应该不具有它的DNA结合活性和/或自然功能导致的不希望的副作用。换句话说，用于接种的突变BORIS没有功能活性并且仅作为免疫原(抗原)存在。不像其他肿瘤特异抗原，BORIS不在妇女中的正常组织中表达。此外，尽管BORIS在男人中正常睾丸的青春期发育期间表达，但是引入和/或表达无功能突变的BORIS应该无害，因为睾丸是免疫特权组织(免疫细胞不可及)。换句话说，免疫后产生的抗-BORIS免疫应答对于正常细胞没有危险并且BORIS疫苗不诱导自身免疫。此外，保证了产生有效免疫应答，因为不像其他肿瘤特异抗原，BORIS被识别为外来抗原。BORIS特异T细胞没有在胸腺中缺失并且将突变BORIS识别为非自身抗原并且产生免疫应答。
在一个实施方案中，通过RT-PCR对从小鼠或者人睾丸分离的mRNA产生编码小鼠BORIS的cDNA(mBORIS)。将该分子的DNA结合结构域缺失并用已知在产生单链Fv结构域抗体中工作良好的小间隔区代替。通过自动化核苷酸序列分析证实正确的序列。所得分子缺少IlZF结构域并且由通过18个氨基酸的间隔区连接C-末端区(氨基酸573-636)的mB0RIS(氨基酸1-258)的N-末端区组成。
将突变cDNA克隆到pORF载体中处于hEFl_HTLV启动子控制下，然而，可以使用其他表达载体。这里，所突变的cDNA有效连接能够导致在宿主细胞中表达的启动子和/或调节分子。可以使用病毒载体，包括ct -病毒DNA或者RNA载体、腺病毒和逆转录病毒(见Vasilevko, V.等人(2003)Clin.Exp.Metastas.20:489-98.；Leitner,ff.W.等人(2003)NatMed 9:33-39 ；Ribas, A 等人(2002) Curr.Gene Ther 2:57-78)。
除了上面的，本发明还包括使用编码无功能突变的BORIS分子的病毒样颗粒，如来自腺病毒、人乙型肝炎、人丙型肝炎、痘苗病毒、多瘤病毒(polyoviurs)等等的病毒样颗粒。来自不同病毒的重组病毒蛋白质具有自组装成病毒样颗粒(VLP)的有用性质。这些颗粒不含有病毒核酸并且因此是非复制的、非感染的并且保持构象正确的抗原表位。已经在许多实验系统，如哺乳动物细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、酵母、大肠杆菌、无细胞系统和转基因植物中显示了 VLP产生。重要的是，用VLP接种不仅产生体液免疫应答而且产生细胞免疫应答。VLP感染专职APC并且随后诱导保护性细胞免疫应答，包括CD4+Thl (帮助⑶8+T细胞的⑶4+T细胞类型)和⑶8+CTL应答。从而，VLP已经清楚地揭示了激活细胞免疫应答(T细胞应答)的罕见能力。VLP用作预防性疫苗的潜力当前正在许多不同临床试验中评估。来自这些试验的结果是令人鼓舞的，在每个试验中都报导了极佳的耐受性和高免疫原性。产生由截短的BORIS抗原组成的VLP疫苗将促进诱导针对表达该肿瘤结合抗原的癌细胞的强烈细胞免疫 应答。乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)和VSV是适宜的VLP的实例。
为了产生更稳固的细胞免疫应答，将截短的或者突变的mBORIS与分子佐剂如B7共刺激分子、防卫素2/3、MIP α 3、IFN Y、细胞因子、趋化因子等融合后克隆到载体中。其他适宜的分子佐剂在下表中列出。
权利要求
1.免疫原性组合物，其包含选自由编码印记位点调节物兄弟(BORIS)蛋白质、多肽或肽的非功能性突变形式的多核苷酸，非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达非功能性突变的BORIS肽、多肽和蛋白质的树突细胞构成的组的成员，上述非功能性突变BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征和蛋白质、多肽或肽具有免疫原的特征。
2.根据权利要求
1的组合物，其中所述非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽缺少全部11个锌指结构域和DNA结合性质。
3.根据权利要求
1的组合物，其中所述蛋白质、多肽或肽连接到可药用载体。
4.根据权利要求
1-3任一项的组合物，其中所述BORIS蛋白质、多肽或肽连接到蛋白质转导结构域。
5.根据权利要求
1-3任一项的组合物，其中所述非功能性突变BORIS蛋白质、多肽或肽连接到修饰BORIS的肽并且保持或增强所述BORIS蛋白质、多肽或肽抗原性。
6.根据权利要求
1的组合物，其中用编码突变BORIS蛋白质、多肽或肽的DNA转染树突状细胞以表达所述非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽。
7.根据权利要求
1的组合物，其中用编码非功能性突变BORIS蛋白质、多肽或肽的病毒载体感染树突状细胞以表达所述非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽。
8.根据权利要求
1的组合物，其中包括应用所述突变的BORIS蛋白质、多肽或肽装载所述树突细胞以表达BORIS蛋白质、多肽或肽。
9.根据权利要求
1的免疫原性组合物,其中还包含佐剂。
10.根据权利要求
9的免疫原性组合物，其中所述佐剂与编码非功能性突变BORIS蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，或者突变BORIS蛋白质、多肽或肽混合或融合。
11.根据权利要求
9的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自细胞因子、趋化因子和共刺激分子。
12.载体，其包含编码BORIS蛋白质、多肽或肽的非功能性突变形式的多核苷酸，所述的非功能性突变体BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征。
13.权利要求
12的载体，其中所述载体允许在细菌、哺乳动物、酵母或者病毒系统中表达。
14.针对乳腺癌的疫苗，其包含编码BORIS蛋白质、多肽或肽的非功能性突变形式的多核苷酸，上述非功能性突变BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征。
15.根据权利要求
14的疫苗，其还包含佐剂。
16.根据权利要求
14的疫苗，其还包含可药用载体。
17.编码BORIS蛋白质、多肽或肽的非功能性突变形式的多核苷酸，非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，以及表达非功能性突变的BORIS分子的树突细胞在制备预防或治疗哺乳动物乳腺癌的药物中的用途，所述非功能性突变BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征。
18.根据权利要求
17的用途，其中编码非功能性突变BORIS蛋白质、多肽或肽的所述多核苷酸，非功能性突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达非功能性突变的BORIS分子的树突细胞与分子佐剂混合或融合。
19.根据权利要求
18的用途，其中所述分子佐剂是增加细胞免疫应答和/或抗体应答的分子。
20.根据权利要求
18的用途，其中所述分子佐剂选自任意细胞因子、趋化因子、共刺激分子。
21.根据权利要求
17的用途，其中所述药物适用于肌内、皮下、皮内、静脉内、经鼻、直肠、阴道或腹膜的途径进行施用。
22.根据权利要求
17的用途，其中所述哺乳动物患有癌症。
23.根据权利要求
17的用途，其中所述哺乳动物没有患癌症。
24.根据权利要求
17的用途，其中所述哺乳动物没有癌症，但是具有对癌症的遗传易感性。
25.根据权利要求
17的用途，其中所述哺乳动物没有可检测的癌症，但是希望保护他自己免于可能产生恶性肿瘤。
26.根据权利要求
17-25任一项的用途，其中所述预防起因于引起包含T细胞的细胞免疫应答，所述T细胞识别来自非功能性突变的BORIS肽、多肽或蛋白质。
27.树突细胞，其表达非功能性突变的BORIS肽、多肽、或蛋白质，该非功能性突变体BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征。
28.树突细胞，其装载非功能性突变的BORIS肽、多肽、或蛋白质，该非功能性突变体BORIS具有缺少全部11个锌指结构域的特征。
专利摘要
描述了编码印记位点调节物兄弟(BORIS)分子的无功能突变形式的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽和BORIS的经修饰的蛋白质形式。这些分子用作针对癌症的治疗性疫苗。
文档编号C12N5/0784GKCN1871025 B发布类型授权 专利申请号CN 200480031413
公开日2013年6月5日 申请日期2004年8月25日
发明者M·G·阿加德简炎, A·古其科炎 申请人:杨启明导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1),