专利名称：化妆品的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的化妆品，特别是涉及到配合了具有很好的美白皮肤效果的地衣培养细胞提取物的化妆品。
地衣类是由某种菌类和藻类构成的共生体，是在植物学上占有特殊地位的一群植物。这种地衣类的代谢物，即所谓的地衣成分完全不同于其他多种高等或低等植物的成分，属于化学上的一种特定类别。具体情况由朝比奈等人进行了分类〔朝比奈，柴田著┍地衣成分的化学┘河出书房，(1948)〕。
有关地衣成分的生理学意义，人们认为，因地衣类生长发育缓慢，所以具有对微生物的侵袭和昆虫类的侵害的防御作用;或者因其不同于其他菌类，是在日光照射下生长，因而也具有对紫外线的防御作用。因此，迄今为止地衣成分就使用于由这些功能而产生的用途。例如，染料、抗生素、香料等。但是事实上，对于这些地衣成分的药理作用几乎还没有进行研究。
而且，由于地衣类生长缓慢，而且其生长容易受季节、气候、温度、纬度等自然环境以及二氧化硫气体浓度、煤烟浓度等人为的环境限制，所以它的栽培很困难，往往是不成功的。另外，从外形上即使是很相似，但其成分与地衣类完全不相同的情况很多，所以材料的挑选必须在技术上要熟练，因而从自然界进行采集是困难的。近年来，作为生产地衣成分的方法，正在进行着细胞培养的研究。因为细胞培养与以年或月为单位生长的天然物相比，生长速度要快得多，所以在短时间内能够生产出所要求的目的成分，并且不同于天然栽培，具有不受天气等因素的影响，采集也不需要很多人力，而且能够以工业规模进行计划生产等优点。关于培养地衣培养细胞，从其细胞中提取地衣成分的方法，以前曾有本发明人的申请(特开昭58-56689)，但是，关于地衣培养细胞是否会产生抑制黑色素形成的物质尚不完全清楚。
成为皮肤着色原因的黑色素在表皮和真皮之间的黑色素细胞内(黑素细胞)的生成黑色素的小颗粒中产生，并生成的黑色素向邻接的细胞扩散。目前，在这种黑素细胞内的化学反应，可以推断如下。基本的氨基酸之一，即酪氨酸，转化为多巴，通过酪氨酸酶的作用，由多巴转化为多巴醌，该多巴醌通过酶或非酶的氧化作用，经过红色色素和无色色素转化成黑色色素的过程就是黑色素的生成过程。从而，认为通过抑制酪氨酸酶的生物合成或通过抑制在反应的第一阶段酪氨酸酶的作用或通过还原在中间阶段的醌类可以抑制黑素的生成。因而，如果通过抑制酪氨酸酶的生物合成或抑制酪氨酸酶的作用，或者把抑制剂掺入(配合)化妆品中就可以期待获得美白效果。
作为抑制手段已被提出的有与作为酪氨酸酶活性中心的铜相结合的物质(例如，硫尿、半胱氨酸、曲酸)，与作为酪氨酸酶底物的酪氨酸能够成为竞争基质的物质(例如，N-乙酰酪氨酸、γ-吡喃酮、4-异丙基环庚二烯酚酮)，延长酪氨酸酶与底物反应诱导期的物质(例如，聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20等)，与多巴等的0-二羟基有选择性结合的物质(例如，钼离子等)，与O-醌类结合的物质(例如，苯胺等)，对O-醌类的还原剂(例如，抗坏血酸、氢醌及其衍生物)等。掺入这些能阻止(抑制)黑色素生成物质的化妆品，如果从对于人体的毒性、稳定性、官能基的影响来考虑，不能令人满意。因此，正期待着开发含有安全性高，并稳定的能阻止黑色素生成物质的化妆品。
鉴于上述存在的问题，本发明人从安全性考虑，着眼于将天然物质掺入化妆品中，对于过去曾作为生药(中药)使用，并已取得实际效果的地衣类提取物进行检索，精心研究其中是否存在可作为具有美白效果的化妆品而能使用的组份，结果发现，通过掺入从地衣培养物中提取出来的能阻止黑色素生成的物质，可以实现本发明的目的，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供了含有从地衣类细胞培养物中提取出来的一种或二种以上能抑制黑色素生成物质的化妆品。
在本发明中使用的地衣培养物是通过培养属于下述科的地衣类而得到的。例如，可以举出黄枝衣科(Teloschistaceae)、蜈蚣衣科(Physciaceae)、标氏衣科(Buelliaceae)、松萝科(Usneaceae)、绵腹衣科(Anziaceae)、梅花衣科(Parmeliaceae)、蜡烛衣科(ロウソクゴヶ科，Canelaria-ceae)、茶渍科(Lacanoraceae)、微孢衣科(Acarospo-raceae)、石脐科(Gyrophoraceae)、石蕊科(Cladoni-aceae)、羊角衣科(センニソゴヶ科，Baeomycetaceae)、珊瑚枝科(キゴヶ科，Stereocaulonaceae)、网衣科(Lecideaceae)、凹盘衣科(Gyalectaceae)、星木科(Asterothyriaceae)、牛皮叶科(Stictaceae)、地卷科(Peltigeraceae)、鳞叶衣科(Pannariaceae)、河滩衣科(ヵヮラゴヶ科，Coccocarpiaceae)、黑斑衣科(クロサビゴヶ科，Lecotheciaceae)、亥普衣科(Heppiaceae)、胶质衣科(Collemaceae)、盾藻衣科(Lichinaceae)、文字衣科(Graphidaceae)、终穴目衣科(Thelotremataceae)、双缘衣科(Diploschistaceae)、瓶口衣科(Verrucariaceae)、核衣科(Pyrenulaceae)、内刷衣科(Strigulaceae)、球粉衣科(Sphaerophoraceae珊瑚衣科)，粉衣科(Calciaceae)、桂钟菌科(Cypheliaceae)、隔孢皿科(Lecanactidaceae)、孔文字衣科(Opegraphaceae)、ニササネゴヶ科(Arthopyre-niaceae)、斑衣科(Arthoniaceae)、网笔石科(云片衣科)(Dictyonemataceae)、多枝瑚科(Clavariaceae)、蘑菇(伞菌)科(Agaricaceae)等。其中，从属于梅花衣科、松萝科、文字衣科、网衣科、石脐科、茶溃科的地衣类的培养物中可以得到高活性的阻止生成黑色素的物质，因而是为理想的。这里所谓的地衣培养物是指地衣菌细胞、藻细胞、或是混合这两种细胞的未分化共生培养组织的培养物。
为了从地衣培养细胞配制黑色素生成抑制物质，把已经过培养的地衣培养物冷冻干燥后进行溶剂浸渍。从抑制黑色素生成的活性的稳定性考虑，浸渍最好是在低温(0～15℃)进行。浸渍溶剂，虽然均可以使用水，极性有机溶剂，非极性有机溶剂，但其中较理想的浸渍溶剂是醇、酮、酯等极性溶剂，而从提取效率看最好的是醇。
将浸渍液过滤后，蒸馏出所得的提取后的溶剂，得到具有抑制黑色素生成的活性物质。
从上述地衣培养物得到的物质中选取一种或二种以上进行混合后，使之溶解或分散于经常使用的化妆品基质(例如，橄榄油和貂油等的油脂类，羊毛脂和蜂蜡等蜡，凡士林和角鲨烯等烃类，棕榈酸异丙酯等酯类，十六(烷)醇和月桂醇等高级醇类，硬脂酸和棕榈酸等高级脂肪酸，胆甾醇等甾醇类)和醇类(例如，乙醇、异丙醇、丙二醇)等中;可以广泛地适用于各种化妆品(例如，乳膏、乳液、填充剂(パッヶ)，洗脸用基料等各种基础化妆品、底衬、面颊红粉、口红、白粉等各种化妆材料，肥皂、香波、漂洗液(リンス)、香水、花露水等化妆品)。这时，也可以与各种化妆品添加剂(例如，各种表面活性剂、溶剂、色素、香料、防腐剂、防氧化剂、保湿剂、维生素、动植物提取物等添加剂)结合使用。
另外，以上各种化妆品可以采用下述各种形态如，可以是溶液、乳剂、软膏、油、蜡、凝胶、溶胶、粉末、喷雾等状态适用。
所制得的一种或二种以上的物质在各种化妆品中的掺入量，可根据其使用形态适当地进行选择或改变。原则上是只要存在有效量就可以，一般在化妆品组合物中可以掺入0.001～20重量%(相对于化妆品组合物的总重量)，最好是掺入0.5～10重量%。
根据本发明，通过从地衣培养物提取出的黑色素生成抑制物质的活性作用，能够制造出具有很好的美白效果的化妆品。经过实用试验，其使用后的美白效果已得到确认。
因此，本发明的化妆品，以各种化妆品，以乳膏、乳液、化妆水、填充剂、口红、底化妆品(under makeup)、基色(foundetion)、防晒剂(sun Care)等各种制品形状，特别适合用作皮肤化妆品。
〔参考例〕参考例1抑制酪氨酸酶活性的试验方法用下述方法评价了抑制酪氨酸酶活性。
(1)反应体系试剂使用了下述的反应体系试剂。
底物2μM L-多巴(和光纯药制)缓冲液0.1M磷酸钾(PH6.8)溶液抑制剂1%的地衣培养物酪氨酸酶抑制物质的溶液酶酪氨酸酶(Sigma公司制)0.05%mg/ml(2)酪氨酸酶活性的测定①反应液的配制在测定酪氨酸酶活性时，按下述表1所示的成分比例配制No.1，No.2，No.3的反应液，然后将其分别放入分光光度计测定槽(1ml)中。
表1 反应液的组成(ml)No.1 No.2 No.3缓冲液 0.50 0.50 0.50底物 - 0.20 0.20抑制剂 - - 0.10离子交换水 0.48 0.28 0.18②测定将酶溶液(0.20ml)加入测定槽中，从加入3分钟后用分光光度计进行测定波长471nm的吸光度随时间的变化。用下式计算抑制率(%)，式中Ab.2为No.2的吸光度，Ab.3是在Ab.2成为最大值时No.3的吸光度，Ab.1是Ab.2成为最大值时No.1的吸光度。
抑制率(%)＝1-(Ab.3-Ab.1/Ab.2-Ab.1)
参考例2将梅花衣科クズレウチキウメノキゴヶ(Parmelia entotheiochora)的未分化增殖组织进行冷冻干燥，用乳钵粉碎，将得到的粉末20g在1000ml甲醇中冷浸一昼夜。过滤，并从得到的提取液中蒸馏出溶剂，得到了抑制物质2.5克。将10mg甲醇提取物溶解于少量的甲醇中，进一步用离子交换水稀释至1ml，将其中的0.1ml提供参考例1的试验。酪氨酸酶抑制率为63%。
参考例 抑制物质 抑制率3.梅花衣科桧树衣属 1.5g 65%(Cetraria juniperina)4.松萝科 ナガサルオガセ 2.5g 44%(Usnea longissima)5.松萝科 イワカラタチゴケ 2.2g 54%(Ramalina yasudae)6.文子衣科文字衣属 1.8g 46%(Graphis scripta)7.文字衣科 カバイロイワモジゴケ 2.3g 38%(Graphis scripta)菌培养物8.文字衣科 ヘ刂トリモジゴケ 3.3g 52%(Phaeographis exaltata)9.网衣科 エノウラヘ刂トリゴケ 2.4g 35%(Lecideaadressula)藻培养物参考例 抑制物质 抑制率10.网衣科网衣属 1.8g 41%(Lecidea albocoerulescens)11.网衣科地图衣属 1.9g 44%(Rhizocarpon geographicum)12.石脐科 シヮイヮタケ 2.1g 45%(Umbilicaria caroliniana)13.石脐科 オオイヮブスマ 1.2g 52%(Lasallia pensylvanica)14.茶渍科 チヤザクロゴケ 2.1g 48%(Haematomma ocrophaeum)15.茶渍衣科 モエギトリハダゴヶ 2.1g 49%(Pertusaria flavicans)参考例16 黑色素生成抑制作用的测定对黑色素细胞的酪氨酸酶合成抑制以及酪氨酸酶抑制作用，利用培养色素细胞通过下述方法进行评价。
(1)试验培养基的制备将1%的地衣类提取物溶液1.25ml加入到45ml不含牛胎儿血清的Eagle′s MEM培养基中，用0.2μm的过滤器进行过滤后，加入2ml牛胎儿血清制成试验培养基。
(2)试验方法将试验培养基4ml放入直径6cm的培养皿中，加入培养基色素细胞(B-16黑色素瘤)1×105/0.2ml，在37℃，在5%二氧化碳/空气的混合气氛中培养6天，4天后更换试验培养基。6天后加入0.025%胰蛋白酶/0.01%EDTA混合溶液，使细胞浮游，以700转/分的速度离心10分钟，收集色素细胞，用分光光度计在波长660nm处测定生成的黑色素量。将由不含地衣类提取物中培养的黑色素生成量作为未添加的对照，求出黑色素生成抑制率。
黑色素生成抑制率＝1-( (试验培养细胞的黑色素生成量)/(未添加的对照物中的黑色素生成量) )×100(%)参考例17将用参考例2同样方法得到的梅花衣科クズレウチキウメノキゴヶ(Parmelia entotheiochora)提取物20mg溶解于极少量的乙醇中，用离子交换水稀释至2ml，取其中的1.25ml溶液用于参考例16的试验。结果，黑色素生成抑制率为76%。
〔实施例〕实施例1.化妆用乳膏(组成) (重量%)参考例2的抑制物质 5.0蜂蜡 2.0硬脂醇 5.0硬脂酸 8.0三十碳六烯(角鲨烯) 10.0甘油-硬脂酸酯 3.0
(组成) (重量%)聚氧乙烯硬脂酸酯 1.0丙二醇 5.0氢氧化钾 3.0香料 适量防腐剂、防氧化剂 适量精制水 剩余部分实施例2，将实施例1中的参考例2改为参考例9，其余同实施例1。
实施例3 乳液(组成) (重量%)参考例3的抑制物质 2.5参考例4的抑制物质 2.5三十碳六烯(角鲨烯) 8.0凡士林 2.0蜂蜡 0.5山梨糖醇酐倍半油酸酯 0.8聚氧乙烯油醚 1.2羧乙烯聚合物 0.2丙二醇 5.0氢氧化钾 0.1乙醇 7.0香料 适量
(组成) (重量%)防腐剂，防氧化剂 适量精制水 剩余部分实施例4将实施例3中的参考例3和4改为参考例10和11，其余同实施例3。
实施例5 化妆水(组成) (重量%)参考例5的抑制物质 2.5参考例6的抑制物质 2.5甘油 5.0聚氧乙烯油醚 1.5乙醇 10.0香料 适量防腐剂、防氧化剂 适量核准的色素(法定色素) 适量精制水 剩余部分实施例6将实施例5中的参考例5和6改为参考例12和13，其余同实施例5。
实施例7 填充剂
(组成) (重量%)参考例7中的抑制物质 2.5参考例8中的抑制物质 2.5乙酸乙烯酯乳液 15.0聚乙烯醇 10.0橄榄油 3.9甘油 5.0氧化钛 8.0高岭土 7.0乙醇 5.0香料 适量防腐剂、防氧化剂 适量精制水 剩余部分实施例8将实施例7中的参考例7和8改变为参考例14和15，其余同实施例7。
权利要求
1.一种化妆品，其特征在于该化妆品含有从地衣类细胞培养物中提取的一种或二种以上的抑制黑色素生成的物质。
2.按照权利要求1所述的化妆品，其中细胞培养之前的地衣类植物属于梅衣科、松萝科、文字衣科、网衣科、石脐科、茶渍科。
全文摘要
研制了一种含有安全性高，并稳定的可抑制黑色素生成的物质的化妆品。该化妆品含有从地衣类细胞培养物中提取出来的一种或二种以上黑色素生成抑制物质。
文档编号A61K8/00GK1065202SQ92102210
公开日1992年10月14日 申请日期1992年3月7日 优先权日1991年3月8日
发明者樋口允子, 木下靖浩, 三浦靖高, 山本好和, 田代圭介, 吉井隆 申请人:密丝佛陀株式会社, 日本油漆株式会社