专利名称：结合去唾液酸糖蛋白的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过将去唾液酸糖蛋白(ASGP)与一种专门作用于肝的医药成分结合制得的新的结合药剂，并包括一种通过将去唾液酸糖蛋白与重组体干扰素(INF)结合而制得的新的结合干扰素抗病毒剂。更具体地，本发明涉及一种对治疗病毒性肝炎是有效的新的结合干扰素。本发明的结合干扰素是有选择地分布并仅在肝中，肝炎病毒的主要复制部位被吸收，并且显示了其作为治疗B型和C型肝炎治疗剂的潜在用途。本发明还涉及一种制备该结合药剂、药用组合物的方法及其用途。
慢性病毒肝炎是世界上很普通的病。据估计约世界人口的5%和朝鲜人口的10%患有慢性病毒肝炎。此外，由于该病对生命，特别是对生命的质量及生产力方面有害，所以慢性病毒肝炎引起了医学界和社会的注意。慢性肝炎通常会发展至肝硬变，并有可能发展至导致死亡的原发性肝癌。慢性肝炎病毒是肝癌的主要原因并被认为是高发病的疾病。因此，开发一种有效的抗病毒剂是迫切需要的。当前，已经发展了对慢性病毒肝炎的可靠的抗病毒治疗。尽管已证明某些药剂在治疗慢性病毒肝炎中是部分有效的，但它们尚有许多缺点，包括尚待解决的有害副作用。
作为过去通常采用的一种抗病毒剂的腺苷阿糖苷单磷酸酯(Ara-AMP)是一种嘌呤为基的制剂，该制剂通过抑制DNA聚合酶的活性而发挥了强的抗病毒活性。在80年代早期，据报导，Ara-AMP在治疗慢性肝炎B时有10-17%的治疗响应。然而在1987年，Garcia等人(Garcia G，Smith CL，Weissberg JI.et alAdenine arabinoside monophosphate in combination with human leukocyte interferon in the treatment of chronic hepatitis B∶A randomized，double-blind，Placebo-controlled trial Ann Intern Med 107∶278-285，1987)报导了与对照组比较，Ara-AMP治疗组未显示出任何显著的更大作用。此外，施用Ara-AMP有时却发展成极严重的有害副作用，如骨髓抑制和不可逆的神经肌肉痛。因此，Ara-AMP不再用来治疗慢性病毒肝炎B。
通常知道，由动物细胞产生的，即天然存在的干扰素对治疗慢性病毒性肝炎B是有效的。天然干扰素是一种糖蛋白，即一种结合蛋白质，其中的非蛋白质基团是低分子量碳水化合物。在1957年它被描述为一种具有抗病毒活性的物质。由于对干扰素作为一种抗病毒剂和抗癌剂的兴趣，在工业界和研究领域已进行了大量的有关其作用，效果、作用机理、分离成纯化状态的方法，大规模制备等方面的研究。目前，以下种类的干扰素是已知的1.α-干扰素，它是通过白细胞病毒感染诱发和产生的，具有抗病毒活性和细胞活性的天然杀伤者的作用;
2.β-干扰素，它是通过成纤维细胞的病毒感染，特别是双链RNA病毒感染诱发和产生的，具有抗病毒活性;以及3.γ-干扰素，它是通过用分裂素或抗原免疫刺激淋巴细胞诱发和产生的，具有免疫调整活性。
据报导，与α-和β-干扰素相比γ-干扰素有优良的抗癌和抗病毒活性。
目前，基因重组法以工业规模生产重组体干扰素，致使因其抗病毒和免疫调整剂的作用而被广为采用。
已有报导，重组体干扰素治疗慢性肝炎的效果在慢性肝炎B较少流行的西方为30-40%。然而，当与未经治疗组中的15-25%的自发好转率相比，则该重组体干扰素被认为仅在约10-15%的慢性肝炎B的病人中有临床效果。
据估计，在世界人口中，约3亿人是肝炎B表面抗原携带者，其中亚洲人口占80%。当用重组体干扰素治疗这些亚洲人时，缓解率仅为10-15%，类似于每年肝炎e抗原的16-17%的自发清除率。因此在亚洲人口，包括朝鲜人口中重组体干扰素的有益效果可能还得不到公认。
已知尽管干扰素可以消除或减少慢性肝炎病人血清中的肝炎B病毒(HBV)的存在，但HBV DNA可留在某些慢性肝炎病人的肝细胞中。因此，当用干扰素间断治疗时是可预料到高的复发率的。
同时已有报导，尽管在剂量和疗程方面有少量差别，但当用自生化肝功能试验得到的血清丙氨酸转氨酶值的降低作为临床治疗效果的判断标准时，使用重组体干扰素显示出对慢性C型肝炎的治疗效果为28-71%。然而，由于约一半的病人在用重组体干扰素治疗后又临床复发，所以重组体干扰素对C型肝炎的治疗效果被认为是暂时的。因此，目前市售的重组体干扰素在某些B型和C型慢性肝炎病人中仅具有暂时的效果。
对某些B型和C型慢性肝炎病人显示出暂时效果的重组体干扰素与天然存在的干扰素不同，是一种没有糖基的多肽干扰素。由于重组体干扰素在施用后立即经肾排入尿中，因此已注意到，重组体干扰素进入肝细胞的吸收率低于天然干扰素的此吸收率，因此重组体干扰素的效果是十分有限的。在实践中已确定，重组体干扰素对B和C型慢性肝炎的临床效果在某些病人中仅是暂时的，治疗无效率和治疗终止后的复发率两者都很高。此外，为增强治疗效果，则应施用大量干扰素。然而，大剂量地使用不可避免伴随有副作用，如发烧、肌痛、关节痛和骨髓抑制。如上所述，由于现有技术的重组体干扰素作为慢性肝炎的治疗剂未能显出高效力，因此急需开发一种有高治疗效果和最低有害影响的治疗慢性肝炎的新药剂。
为何干扰素的效果是暂时的这一原因是，尽管干扰素可以降低血清中病毒DNA的含量，但它不能有效地作用于存在于肝细胞中的病毒。这样就使得肝炎病毒在肝细胞中可持续复制。因而，病人在终止用重组体干扰素治疗后，又可能复发肝炎。
因而，可预见到的最理想的治疗方法是药-靶治疗，其中将最有效的抗病毒剂直接引入目标肝细胞。
现有技术中已尝试了将抗病毒剂经由仅在肝细胞中特定存在的受体施用，以抑制肝细胞中存在的病毒复制的方法。Fiume等人(Biochem.Pharm.35∶967，1986)通过将一种抗病毒剂，9-β-D-阿糖呋喃糖基-腺嘌呤基-5′-单磷酸酯(ara-AMP)与乳糖胺化的(lactosaminated)血清清蛋白(L-SA)结合而合成L-SA-ara-AMP，这是一种通过血清清蛋白与乳糖结合而合成的新蛋白质。据悉，L-SA-ara-AMP可以高含量吸收于肝细胞中。然而，由于制备乳糖胺化的血清清蛋白的方法非常复杂并需使用昂贵的清蛋白，所以L-SA-ara-AMP对治疗肝炎尚无很大意义。此外，L-SA-ara-AMP是通过使用不是在人体中天然存在的合成糖蛋白以及通过结合了被鉴定为对治疗慢性肝炎B无效的ara-AMP而制得的。
除清蛋白外，血液中存在的所有血浆蛋白质都是一种含有以唾液酸基终止的碳水化合物链的糖蛋白。通过一系列以各种酶解理该唾液酸基的过程将这些血浆蛋白质从循环血流中清除掉。作为一种由糖蛋白中去除唾液酸基的酶的神经氨酸苷酶在哺乳动物血清中显示出其活性(Rosenberg A，Schengrund CLSialidases. In Rosenberg A.Schengrund CL(Eds)Biological roles of sialic acid.New York，Plenum，1976)。
可溶于并在血液中循环的血浆蛋白质在一段一定的时间后失去其溶解度及固有生理活性。这一作用的机制存在于肝中。已知，去除糖蛋白是肝的一种功能，鉴于当病人患有肝硬变或肝炎并因而使得从肝细胞中去除糖蛋白的机制无序的事实，这些病人的血清中就有在正常血清中检测不到的循环的去唾液酸糖蛋白。在实践中，当将去唾液酸的血浆铜蓝蛋白注入家兔中时，该去唾液酸的血浆铜蓝蛋白的半存留期为2分钟，这大大地短于天然血浆铜蓝蛋白的55小时的这一半存留期。这一现象在其它的血浆蛋白质的情况下也显示出来。尤其是，通过自糖蛋白的终端脱除唾液酸基显露出半乳糖基并被肝细胞膜中存在的受体所识别，从而导致其中借助受体间的内噬作用(RME)而迅速运动至肝细胞中于是从循环血流中消失。
在60年代，Morell和Ashwell等人确定，当血浆铜蓝蛋白的唾液酸基被神经氨酸苷酶去除时，这种血浆蛋白质就迅速地从血清中消失。他们公开了，这一现象是由于被肝细胞中存在的ASGP受体吸收而造成的(J.Biol Chem.，243∶155，1968)。而后据报导，ASGP受体仅存在于肝细胞中(Adv.Enzymol，41∶99，1974)。这种通过肝细胞的特殊吸收已由以下事实证明当将用氙试验标记的去唾液酸血浆铜蓝蛋白或去唾液酸血清类粘蛋白注入活体时，该同位素仅被选择性地在肝细胞中测得(Scheingberg IH，Morall AG，Stockert RJHepatic removal of circulating proteins.Davidson CS.ed.Problems in liver Piseases，pp279-285，New York，Stratton Company，1979)。此外还公开了，这一受体特定地识别和吸收具有D-半乳糖或N-乙酸半乳糖胺作为末端糖基的糖蛋白(Ann.Rev.Biochem.，51;531，1982)。肝细胞的细胞膜包含有与以半乳糖终止的去唾液酸糖蛋白结合的细胞组织。这一细胞组织最初被命名为肝结合蛋白质(HBP)，而现在则被称为去唾液酸糖蛋白受体。此外已观察到，在各种去唾液酸糖蛋白中间，去唾液酸的α(1)酸糖蛋白，去唾液酸血清类粘蛋白在注入后从血清中消失得最快。因此确定，去唾液酸-α(1)-酸糖蛋白被肝细胞特定地并良好地吸收(
图1)(J.Biol.Chem.，245;4397，1970)。
具有显著抗病毒活性的天然干扰素也是一种在碳水化合物的末端含有唾液酸的糖蛋白，而且在静脉注射后被迅速地从血流中清除。如在包括血浆铜蓝蛋白在内的其它糖蛋白的情况下也被证实的那样，通过用一种酶处理天然存在的干扰素以去除末端的唾液酸基而制得的以半乳糖终止的去唾液酸干扰素，与天然存在的干扰素相比，迅速地从血流中清除。
然而，已有这样的报导，为了仅保留多肽部分，通过用糖苷酶处理而自干扰素分子中去除85%以上的碳水化合物部分则不能改变干扰素的抗病毒活性。但能减少肝细胞的吸收，这使得血液中干扰素的半存在期提高(Bose S，Hickman JRole of Carbohydrate moiety in determining the Surival of interferon in the circulation，J.Biol.Chem.，252∶8336，1977;图2)。因而已建议，象其它去唾液酸血浆糖蛋白一样使去唾液酸-干扰素也借助去唾液酸糖蛋白受体通过选择吸收的途径进入肝细胞，这样的吸收是使之从循环血流中消失的原因。
在1980年Weissman等人通过将人白细胞的INF-
基因巧妙地处理进大肠杆菌中而制得了重组体干扰素。由于重组体干扰素仅由165个氨基酸组成，而且没有碳水化合物链，所以象用糖苷酶处理的天然存在的干扰素所形成的多肽干扰素一样，重组体干扰素被吸收入肝细胞很差。
因而，本发明的一个目的是，将重组体干扰素处理成特定地在肝细胞中的去唾液酸糖蛋白(ASGP)受体的目标，以增强该重组体干扰素抵抗几乎唯一地在肝细胞中复制的肝炎病毒的抗病毒活性。
本发明的另一目的是提供一种可被引入显示出肝炎的临床、血清和分子生物学证据的哺乳动物，包括人类体中的干扰素-结合物，以治疗肝炎病毒感染，包括肝炎B、C和D型的感染。
本发明再一个目的是提供一种治疗病毒性肝炎的方法，该方法是通过给病人施用其量足以抑制病人肝细胞中存在的肝炎病毒的复制的下述式(1)的干扰素。
本发明又一目的是提供一种治疗病毒肝炎的组合物，该组合物含有一定量的下述对抑制肝细胞中存在的肝炎病毒的复制是有效的式(1)的结合干扰素，及其可药用的载体、佐剂或赋形剂。
本发明再一个目的是通过将去唾液酸糖蛋白(ASGP)与重组体干扰素(INF)结合而制出新的抗病毒剂的方法，这种结合使得干扰素结合物在给病人进行肠胃外施用时结合到特定地存在于肝细胞中的ASGP受体上。
本发明的一个优点是提供了一种干扰素结合物，该结合物减少了与单独的重组体干扰素有害反应现象有关的有害反应现象。
上面已概括了本发明的某些适当的目的。这些目的应被认为仅是说明本发明某些较确切的特色和用途。通过以不同的方式应用这公开的发明，或在所公开的范围内改变本发明都可得到许多有益的结果。因此，除由权利要求书连同附图所定义的本发明的范围外，通过参考本发明的摘要和描述较佳实施方案的详细说明可以得知本发明的其它目的以及对本发明有更充分的理解。
一方面，本发明涉及一种有如下通式(1)的新的结合药剂
其中P是人的血清糖蛋白的一种肽基;S是人血清糖蛋白的一种糖基;Gal是一种半乳糖基;GA是戊二醛基;x是一个等于或大于1的整数;R是下面将述及的医药成分。
适于通过与去唾液酸糖蛋白结合而制备上述式(1)的结合药剂的医药成分基本上全是特定地作用于肝的药物。所推荐的该医药成分为一种治疗B和C型慢性病毒肝炎的抗病毒剂，如干扰素、无环鸟苷钠、三唑核苷、阿糖腺苷(腺苷阿糖酐)、叠氮胸苷(AZT)、苏拉明、反义低核苷酸和核糖酶(rebozyme)(催化RNAs);防止因抗癌化学治疗术所诱发的毒性的生物调节剂，如防止氨甲喋呤毒性的甲酰四氢叶酸钙;鉴别肝脏图象的放射性对比物，如泛影葡胺钠和钆-DTPA;肝细胞保护剂，如谷胱甘肽(GSH)和前列腺素;以及用于肝扫描的放射性同位素，如99mTC(锝)和131I。本发明式(1)的结合剂的医药成分是治疗慢性病毒肝炎最有效的干扰素(INF)则更好。这样，在下文中本发明将对通过将去唾液酸糖蛋白与干扰素结合而制得的结合干扰素作专门解释。
本发明以某些结合干扰素为目标，这些干扰素是在患有病毒肝炎的人显示出抗病毒效果的，并且是旨在通过肝从血流中选择性地为肝细胞所吸收的。本发明的结合干扰素包括式(1)的结合干扰素，
其中P是人血清糖蛋白的一种肽基;S是人血清糖蛋白的一种糖基;Gal是一种半乳糖基;GA是戊二醛基，x是一个等于或大于1的整数;INF是干扰素，较佳的是INF为重组体干扰素。
干扰素是α-干扰素、β-干扰素或γ-干扰素，最好是α-干扰素。
α(1)-酸糖蛋白(血清类粘蛋白)、胎球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白、甲状腺球蛋白、巨球蛋白是较佳的人血清糖蛋白。
式(1)的P-(S)x-Gal一部分较佳地是选自由去唾液酸血清类粘蛋白、去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血浆铜蓝蛋白、去唾液结合珠蛋白、去唾液酸甲状腺蛋白以及去唾液酸巨球蛋白构成的物组中的去唾液酸的人血清糖蛋白。
本发明的另一个方面是一种治疗肝炎的药用组合物。该组合物含有其量足以抑制存在于患病毒肝炎的病人肝细胞中的肝炎病毒复制的式(1)的结合干扰素和可药用的载体、佐剂或其赋形剂。较佳的是该药用组合物是一种适于静脉用药的组合物。
本发明的又一方面是一种治疗患病毒肝炎病人的病毒肝炎的方法，该方法是通过施用其量足以抑制患肝炎病人的肝细胞中存在的肝炎病毒复制的式(1)结合干扰素。较好的是，该结合干扰素通过静脉给药的方式用药。
本发明再一个方面是一种制备式(1)结合干扰素的方法，
其中P是人血清糖蛋白的一种肽基;
S是人血清糖蛋白的一种糖基;
Gal是一种半乳糖基;
GA是戊二醛基;
x是一个等于或大于1的整数;而INF是干扰素，较佳的是重组体干扰素。
本方法包括提供含有通式为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA糖蛋白的人血清的步骤，其特征在于距糖基末端的第二个基是D-半乳糖(Gal)，而最后的基是N-乙酰神经氨酸(NANA)或(唾液酸)。然后处理人血清，从此人血清中分离蛋白质-(糖)x-Gal-NANA并回收此P-(S)x-Gal-NANA。然后用神经氨酸苷酶处理此P-(S)x-Gal-NANA以去掉NANA而得到去唾液酸糖蛋白(ASGP)，即是一种去掉唾液酸的人血清糖蛋白残余，即P-(S)x-Gal部分。然后借助戊二醛交联法将去唾液酸糖蛋白，P-(S)x-Gal与该干扰素连接(Reichlin MUse of glutaradehyde as a coupling agent for protein and peptide.Methods Enzymol70∶159-165，1980)。然后回收化学式为P-(S)x-Gal-GA-INF(1)的结合干扰素。
较佳的是，人血血清是一种人血清的Cohn馏分V上清液，并且它用常规的公知方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色谱法处理是可从Cohn馏分V上清液中分离的蛋白质-(糖)x-Gal-NANA，一种制备式(1)干扰素其中
P是人血清糖蛋白的一种肽基;
S是人血清糖蛋白的一种糖基;
Gal是人血清糖蛋白的一种半乳糖基;
x是一个等于或大于1的整数;而INF是干扰素的更为具体的方法，该方法包括提供人血清的Cohn馏分V上清液。处理此人血清的Cohn馏分V上清液以分离并从中回收蛋白质-(糖)x-Gal-NANA糖蛋白，用神经氨酸苷酶处理该糖蛋白以使之脱去唾液酸，从而得到结构为蛋白质-(糖)x-Gal的糖蛋白残余部，即去唾液酸糖蛋白(ASGP)。借助戊二醛交联法将该去唾液酸糖蛋白与干扰素连接。然后回收结构为蛋白质-(糖)x-Gal-GA-INF的结合干扰素。
较佳的是用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色谱法以常规方式处理人血清的Cohn馏分V上清液以从此Cohn馏分中分离出结构为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白。
以上概括了本发明的较确切和重要的特色以便使本发明的详细描
被更好地理解，及充分评价本发明对现有技术的贡献。在下文中所述及的附加的特征构成了本发明各权利要求的主题。本技术领域的普通技术人员可以理解到的是，本文所公开的构思及特定的实施方案可以方便被用作改变或设计为实现本发明相同目的的其它结构的基础。此外，本技术领域中的普通技术人员都可意识到这些等价的构成不超出权利要求所列出的本发明的精神和范围。
为充分理解本发明的实质和目的需参阅与附图结合的如下详细说明，其中
图1代表静脉注射的去唾液酸的血浆蛋白在血浆中的存留期的曲线。
图2表示天然存在的干扰素，用神经氨酸苷酶处理过的干扰素及用糖苷酶处理过的干扰素在静脉给药后的清除率。
图3是经分离和纯化后的α(1)-酸糖蛋白和去唾液酸糖蛋白的电泳图。
图4是去唾液酸糖蛋白和干扰素结合后所得到的电泳图。
图5是比较肝中牛血清清蛋白和去唾液酸糖蛋白吸收的γ摄影图象和放射性曲线图。
图6是γ摄影图象和放射性曲线图，在其中比较了在肝中的干扰素的吸收和新的结合干扰素的吸收。
图7是代表用药3小时后活体中干扰素和新的结合干扰素的生物分布的图。
图8是代表一段时期的肝中干扰素和新的结合干扰素的相对生物分布的图。
为减少现有技术重组体干扰素的上述缺点，则必须使干扰素进入肝细胞。因此，本发明可有选择地将重组体干扰素载入肝细胞，以使之直接得到重组体干扰素。因此，用神经氨酸苷酶处理血浆-糖蛋白，通过去除唾液酸部分而暴露出半乳糖基，即形成去唾液酸糖蛋白(ASGP)。然后将抗病毒剂、重组体干扰素与糖蛋白(ASGP)的暴露的半乳糖基结合，以使该结合了的药剂结合到特定地存在于肝细胞中的ASGP受体上。欲被结合的抗病毒剂包括重组体α-、β-、γ-INF、这些都是目前所知的治疗B和C型慢性肝炎最有效的药剂。
重要的是要注意一个特别令人惊异的事实当单独用α、β或γ干扰素治疗肝炎时，只有α干扰素是有效的。而根据本发明，当将α、β或γ干扰素与去唾液酸糖蛋白(ASGP)结合时，每种干扰素，即α、β或γ干扰素在治疗肝炎时都有效。
此外，由于本发明的新的结合干扰素仅特定地为肝细胞所吸收，并而后在肝细胞中长时期地存留，因而最佳剂量可得以减小。
因此，因频繁剂量地或大剂量地施用干扰素而带来的有害作用经常可得以减少。尽管欲被用于制备结合干扰素的糖蛋白不限于任何特定的种类，但如图1所示，易于被吸收入肝的α(1)-酸糖蛋白，即血清类粘蛋白，以及胎球蛋白，血浆铜蓝蛋白，结合珠蛋白，甲状腺蛋白和巨球蛋白都是优选的。
可用以下方法制备本发明的结合干扰素。首先用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色谱法以常规方式处理人血清Cohn馏分V上清液以分离出结构为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白(NANA是唾液酸)(Hao Y-L，Wickerhauser M∶Aglycoprotein，Biochem.Biophys.Acta 322;99，1973)，然后用神经氨酸苷酶处理该糖蛋白而得到因去掉了唾液酸结构为蛋白质-(糖)x-Gal的去唾液酸糖蛋白(ASGP)。然后借助戊二醛交联法将该去唾液酸糖蛋白与干扰素连接而合成结构为蛋白质-(糖)x-Gal-GA-INF的结合物。
上述的本发明的方法概括如下
表 1
上述方法所用的糖蛋白是存在于人血清中的糖蛋白。就本发明的目的而言，只要距糖蛋白糖部分末端的第二个基是D-半乳糖、糖蛋白的最后的基是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，任何的糖蛋白，如α(1)-酸糖蛋白(血清类粘蛋白)，都可使用。这也包括可被采用的诸如胎球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白等之类的糖蛋白。
因此，血清类粘蛋白、胎球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白、甲状腺蛋白和巨球蛋白等糖蛋白在去掉唾液酸后则分别被称为去唾液酸血清类粘蛋白，去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血浆铜蓝蛋白、去唾液酸结合珠蛋白、去唾液酸甲状腺蛋白和去唾液酸巨球蛋白，并且它们可用于本发明的结合干扰素。这些去唾液酸糖蛋白可与将α(1)-酸糖蛋白脱去唾液酸(即去唾液酸血清类粘蛋白)相同的程序制得。
然而参看图1，由于在注射后血浆中保持的去唾液酸血清类粘蛋白的百分比为约0.18%/ml血浆，所以α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清类粘蛋白)是最好的一种。为测定静脉注射的去唾液酸血浆蛋白质的存留期，在约200g重的雄白鼠的尾静脉注入注射液(1ml)，每1ml的注射液应答如下3H-去唾液酸转铁蛋白，0.3mg，6.6×106dpm;64cu-血浆铜蓝蛋白，0.3mg;3H-去唾液酸甲状腺球蛋白，0.3mg，12.6×106dpm;3H-去唾液酸-α2-巨球蛋白，0.19mg，11.2×106dpm;3H-去唾液酸结合珠蛋白，0.12mg，9.5×106dpm;3H-去唾液酸血浆铜蓝蛋白，0.3mg，6.7×106dpm;3H-去唾液酸胎球蛋白，0.11mg，2×106dpm;3H-去唾液酸血清类粘蛋白，0.13mg，14.4×106dpm。以不同的时间间隔从尾静脉中将血液试样取在肝素管中并离心分离，测定该血浆的放射性。将动物杀死，并按指定的时间取出其肝、将20mg湿组织等分试样用于测定放射性。结果示于图1。
图1说明了自静脉注射12分钟后血液中存留的去唾液酸的-α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清类粘蛋白)、去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血浆铜蓝蛋白和去唾液酸结合珠蛋白的百分比分别为0.18、0.37、0.6和1.20。从而可看出，去唾液酸的-α(1)-酸糖蛋白(去唾液酸血清类粘蛋白)从血液中消失得最快，这表明，与其它糖蛋白相比，它被肝细胞以最快的速率吸收。
在制备本发明的结合干扰素的第一步骤中，可按已知的常规方法，如制备清蛋白的方法从人血清中分离及得到Cohn馏分V上清液(Cohn E.J.et al，J.Am.Chem Soc.68∶459，1946)。按概括于下的已知方法(Hao Y-L，Wicherhauser M.;A Simple Method for the large-Scale Preparation of Alpha(1)-acid glycoprotein，Biochem.Biophys.Acta，322;99，1973)进行自Cohn馏分V上清液中分离α(1)-酸糖蛋白及其大规模提纯。
表 2
然后按如下反应流程使被分离及纯化的α(1)-酸糖蛋白经去唾液酸反应而得到去唾液酸糖蛋白。
回收的去唾液酸糖蛋白的电泳图示于图3，C列。图3、A列说明蛋白质的分子量标记，B列表示带有被分离的唾液酸基的α(1)-酸糖蛋白的43kd(“kd”意指千道尔顿)单带，而C列表示去除了1.7kd唾液酸基的41kd去唾液α(1)-酸糖蛋白的单带。
用干扰素制备去唾液酸糖蛋白的结合物的最后步骤采用了戊二醛(GA)交联反应，该反应是最温和的交联反应中的一种。在中性的pH值范围(6.0-8.0)内，在4-40℃的温度下，使用缓冲范围很宽的缓冲液使戊二醛与暴露的胺基结合。此反应包括在蛋白质的氨基和醛基间形成一种席夫碱。在此反应中，由于戊二醛含有两个醛基，所以如下所示，它们直接与两个氨基结合(Pozmanski M.J.and Juliano R.L.∶Biological approaches to the controlled dilivery of drugs∶a critical review.Pharmacological Reviews 36∶277-336，1984)。
这种结合物可用放射性自显影装置鉴别出来首先用合成I(131)-干扰素-去唾液酸糖蛋白结合物的Iodogen法标出在干扰素部分有I(131)的此结合物，然后使之经电泳再用考马斯兰着色(图4，B和C)。在图4中，C柱代表该蛋白分子量的标记，而B柱代表67kd谱带的此结合物及41kd谱带的在结合合成后未反应的去唾液酸糖蛋白。此外，柱A系得自柱B的电泳胶的放射性自显影并示出67kd谱带，该带与I(131)-干扰素-去唾液酸糖蛋白结合物相适应。
为证明在本发明中被用作干扰素载体的去唾液酸糖蛋白特定地被吸收在肝脏中，进行了以下的动物试验。按下面所示的目的将该实验分成两组，每组都包括一个对照组。
去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白组织特性实验
将得自注射了I(131)-标记的去唾液酸糖蛋白的家兔的γ摄影图象及整个时间内的放射性的变化都与得自I(131)-牛血清清蛋白(BSA)的此图象及变化进行比较。经鉴定结果是此种从人血清分离出来的经提纯的去唾液酸糖蛋白特定地为肝脏所吸收(图5)。在图5中，上部的γ摄影图像是处于仰卧位置的家兔的各器官所发出的放射性图形。从此图形，可有比较地鉴定出存在于家兔器官中的整个时间内去唾液酸糖蛋白的量。这样，通过与I(131)-牛血清清蛋白比较可以确定I(131)-去唾液酸糖蛋白更特定地为该肝脏所吸收，并在其中存在更长的时间。在下部的照片中，横座标代表时间(X轴)，纵座标(Y轴)分别代表在肝脏及心脏，即血流中测出的放射性。从图5的图象中可以看到，相对于清蛋白而言，去唾液酸糖蛋白则更明显并更特定地被吸收于肝脏中。
a.γ摄影图象b.放射性的时间过程c.生物学分布得自一只注射了I(131)-标记的干扰素的家兔的γ摄影图象及整个时间中的肝、心脏及膀胱中的放射性都与得自本发明的I(131)-标记的结合干扰素的这种图象和放射性相比较。其结果示于图6。
从图6的γ摄影图象可知，在注射后干扰素主要存留在肝中，时间最多为30分钟，但已开始排泄入膀胱。3小时后，肝中已基本没有干扰素，它主要存在于膀胱之中。而与此同时，本发明的去唾液酸糖蛋白干扰素结合物则在注射后大部分持续地存留于肝中长达30分钟，2小时和3小时，而进入膀胱的排泄则未观察到。这也符合下部照片中所示的整个时间内的放射性的变化。于是，在干扰素的情况下，在上部线中的肝放射性及中部线中的血液放射性在30分钟内逐渐下降而后下部线中的膀胱放射性则升高。相反，注射去唾液酸糖蛋白的组中，肝放射性则持续保持不变，并且未发现膀胱放射性的升高。
为了将此新的结合干扰素与干扰素进行组织特性对比，在分别给家兔注射干扰素及去唾液酸糖蛋白-干扰素结合物3小时后，将其杀死。测定每个器官中的放射性，然后对比家兔组织中的分布(见图7)。
结果，根据观察每种器官中的相对残存率，如果在6个器官，即肝、肾、肺、脾、心和甲状腺中存留的放射性为100，在去唾液酸糖蛋白-干扰素结合物的情况下，肝残存量为全部器官残存量的85%左右，而在肾、肺和心中此残存率仅分别为7%、5%及1%。相反，在干扰素的情况下，肾、肝和心中的此残存量相当高，分别为32%、11%和2%，而在肝中的这种残存率仅为53%。
图8是显示在整段时间中干扰素及该新的结合干扰素在肝中的残存率。从该图可知，去唾液酸糖蛋白-干扰素结合物在肝中的残存比干扰素的残存要高得多和长得多。也就是说，去唾液酸糖蛋白-干扰素结合物在注射后30分钟、3小时和12小时后的残存量比干扰素分别高1.5、4.3和6倍。
本发明的干扰素结合物可与常规用于干扰素制剂的医学上可接受的载体，如助剂、稳定剂、缓冲剂等结合被配制成治疗肝炎的可注射的组合物。适用于此目的的缓冲剂最好是磷酸钠、磷酸钾等。本发明的组合物还可包括防腐剂，如酚、稳定剂，如清蛋白、L-半胱氨酸氢氯化物、麦芽糖、氯化钠或氯化钾等。
虽然剂量可根据病人的年龄和体重、病情等而变化，但通常本发明的结合干扰素作静脉注射的剂量为每平方米身体表面以干扰素为基数的20-300万国际单位，一天或二天一次。然而，给药时期及给药量可根据为本技术领域中普通技术人员已知的其他常规干扰素制剂的给药方法调整。
本发明的结合干扰素特定地为肝细胞所吸收，并在肝中存留很长时间。所以，与常规干扰素配方相比该结合干扰素的剂量可大为减少。这种减低的剂量可使用药的肝炎病人免除干扰素本身带来的副作用，如发烧、肌痛、骨髓抑制等。因此人体对本发明的结合干扰素的容许剂量要比常规的干扰素大得多。
给显示出病毒性肝炎的临床学、血清学及分子生物学症状的治疗对象用药。对HBsAg及抗HCV的阳性反应分别是慢性肝炎B和C的标志。该药的组分列述于前，而静脉内施药的结果示于图7和8。
以下的实施例旨在更确切地解释本发明而决不是限制其范围。在这些实施例中，除另有说明，干扰素均为重组体α-干扰素。制备去唾液酸糖蛋白(蛋白质-(糖)x-半乳糖)实施例1用α(1)-酸糖蛋白制备去唾液酸糖蛋白1.制备2，2，2-三氟乙醇磺酸酯化的(tresylated)载体将10g湿Sepharose 4B(Phamacia)移入一玻璃过滤器中，然后依次用30%、60%、80%(v/v)的丙酮水溶液及无水丙酮各100ml洗涤。将洗过的Sepharose 4B胶引入一个盛有30ml无水丙酮及150μl(μ＝微)2，2，2-三氟乙醇磺酰(tresyl)氯(Fluka AG，Buchs，Switzeland)的干烧杯中，同时用磁棒搅动。使此烧杯在室温下静置10分钟后，将全部上述混合物再移入同一玻璃过滤器中，并用溶在HCl中的70%、50%和30%(v/v)丙酮洗涤，最后用1mM HCl洗涤。所形成的产物在4℃下贮存，或另用丙酮处理、干燥，然后在室温下贮存。这样获得的载体的负载能力是每克此种干胶可负载450μmol的酶。
2.将神经氨酸苷酶结合于该2，2，2-三氟乙醇磺酸酯化的载体将1ml(0.4mg/ml)神经氨酸苷酶(Sigma Chem)通过一个NAPTM-10柱(Pharmacia)，然后再溶于1.5ml0.2M磷酸钠-0.5M NaCl缓冲液(pH7.0)(A230＝0.534)中，再将1.0g活化的2，2，2-三氟乙醇磺酰基Sepharose 4B加入其中。在4℃下将此混合物缓缓地振荡16小时，并向其中添加1.5ml0.5M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5)。将全部混合物在4℃下放置5小时以使反应完全。用0.1M磷酸钠-0.15M NaCl(pH5.5)洗涤所得的胶，结果得到神经氨酸苷酶-Sepharose 4B，随后将该产物在4℃下贮存(A230＝0.45)(在该缓冲液中的神经氨酸苷酶的产率OD0.084/OD0.534＝0.064mg/0.4mg＝16%)。
3.制备去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白将250mgα(1)-酸糖蛋白溶于25ml0.15M NaCl-0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)中，然后将所得的溶液与一种溶在2ml同样的缓冲液中的200mg神经氨酸苷酶-Sepharose 4B的溶液相混合。在37℃下使该混合物反应过夜。得到洗脱物，然后按硫代巴比土酸分析法(Warren LThe thiobarbituric acid assay of sialic acids.J Biol Chem 234∶1971-1975，1959)，测定去唾液酸效率。这样，用神经氨酸苷酶-Sepharose 4B处理过的1.0mlα(1)-酸糖蛋白再用NAPTM-10柱处理而去除盐。然后，将50μl1N H2SO4加到1ml该洗脱物中，然后摇动此混合物，在80℃下保温1小时再冷却下来而从神经氨酸苷酶处理后仍含有唾液酸基团的α(1)-酸糖蛋白中去除唾液酸基团。将0.2ml的此样品与0.1ml高碘酸盐充分混合，再将该混合物静置20分钟，在添加1.0ml亚砷酸盐后，摇动此混合物直到淡黄-褐色消失。向所得的溶液加3ml硫代巴比土酸，再将此混合物沸腾15分钟，然后在冰水中冷却5分钟。将一份2.0ml的此混合物等分试样与2ml环己酮混合。在将此混合物离心分离3分钟后，在549nm波长上测量红色上清液的吸收度。对照的α(1)-酸糖蛋白的吸收度为0.008，而试样去唾液酸α(1)-酸糖蛋白的吸收度则为0.118。
因此，纯唾液酸的吸收度为0.110(0.118-0.008)OaD。去唾液酸的分子吸收度指数为5700而唾液酸的释放量(μmol)可用以下等式算出
V 是硫代巴比土酸的量，1000是将ml换成升，而
用硫酸从去唾液酸糖蛋白中释放出唾液酸的量是0.00825μmol(＝0.075×0.110)。1mlα(1)-酸糖蛋白(1mg/ml)含0.369μmol唾液酸。那么，由于在实验中所用的α(1)-酸糖蛋白的量是2mg，所以唾液酸的总量是0.728μmol(＝0.369μmol×2)，而用神经氨酸苷酶释放出的唾液酸的量是0.7298μmol(＝0.738-0.0082)。因此算出该效率为0.7298/0.738×100＝99%。
实施例2按实施例1中所述的步骤，用胎球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白和甲状腺球蛋白替代α(1)-酸糖蛋白分别制备去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血浆铜蓝蛋白、去唾液酸结合珠蛋白、及唾液酸甲状腺球蛋白。
实施例3制备去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白和重组体干扰素的结合物(蛋白质)-(糖)x-半乳糖-戊二醛-干扰素以下列方式用Harlow and Lane(1988)的一步法进行该结合物的合成。用NAPTM-10柱处理1.0mlI(131)-标记的干扰素(150μg/ml)以将缓冲溶液0.5M磷酸钠，pH7.5改变成0.1M磷酸钠pH6.8。将所得的溶液移入一个盛小磁搅棒的管子中，该管中引入了100μl(0.6mg)去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白。在通风橱中，用1分钟将100μl1%戊二醛滴加到该管中的混合溶液中，同时搅动。将全部混合物于室温下保温3小时，然后加100μl1M的乙醇胺(pH7.2)。而后该混合物再于室温下保温1小时，并用Sepharose 12柱作液相色谱分离(FPLC)而得到在214nm的两种馏分。第一种I(131)-标记的干扰素的同位素值为86.1μCi，而第一和第二馏分的同位素值分别为6μCi和6μCi。电泳产生了3条谱带;浅的和宽的大于70kd代表聚合了的结合物，67kd的结合物谱带及在反应后残存的去唾液酸的41kd谱带也可鉴别出来。电泳后的胶体经放射性自显影以鉴别两个谱带，即密而宽的70kd以上的聚合了的结合物谱带及67kd的结合物谱带。在使用一只家兔的实验中所用的去唾液酸糖蛋白和I(131)-标记的干扰素的结合物与经FPLC分离的第一馏分相对应。
实施例4按实施例3中所述的步骤，用去唾液酸胎球蛋白、去唾液酸血浆铜蓝蛋白、去唾液酸结合珠蛋白及去唾液酸甲状腺球蛋白替代去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白以制备上述去唾液酸血浆蛋白质及干扰素的结合物。
实验例下面的动物实验旨在鉴定去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的组织特性，并对比本发明结合干扰素的肝细胞特性。
A.制备对比实验的样品按Franker and Speck法(Biochem Biophys Res.Commun.80∶849-857)将干扰素、牛血清清蛋白、和去唾液α(1)-酸糖蛋白碘化以制备有以下比放射性的，并用作动物试验试样的，放射性碘化的(131I)天然干扰素、牛血清清蛋白和去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白。
·碘化干扰素的比放射性359μCi/15μg＝23.9μCi/μg·碘化牛血清清蛋白的比放射性400μCi/30μg＝13.3μCi/μg·碘化去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的比放射性1607μCi/60μg＝26.8μCi/μgB.试验方法及结果试验1去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白的组织特性试验使称重1.5-2.0kg的家兔接受通常的麻醉再注射I(131)-标记的碘化牛血清清蛋白或碘化α(1)-酸糖蛋白于耳静脉内。此后取得由图象计算机确立的有意义部位的图象，该图象是用一台γ-摄影机在一点上每5秒一次摄取的，这样以使每个器官中的放射性得以测量。所用的照象机是一台装有视准仪的，有高分辨能力的Ohio NuclearTM410γ相机。每5分钟摄取一张照片，因此用30分钟获取6张照片。这样取得的图象照片与图5相对应。图5上段的图象照片显示出I(131)-去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白与I(131)-牛血清清蛋白相比更特定地被肝吸收。在图5下段，横座标代表时间，上面的线代表在肝中测得的放射性，下面的线代表在心脏中测得的放射性，即血流的放射性。从这些照片可见，去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白为肝特定吸收。
试验2干扰素及本发明的结合干扰素的对比试验按前面于实验1中所述的相同方式将I(131)-干扰素和I(131)-去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白注射入家兔的耳静脉。为了比较测量肝中的放射性，每30分钟摄取一张300000单个尖峰信号的照片，在3小时中得到6张照片。这些图象照片在图6中示出。从图6的γ照相图象中可知，注射后干扰素大部存在于肝上最长达30分钟。此后它经肾排入膀胱。另外，注射后3小时，干扰素基本上不存在于肝中而主要存在于膀胱中。然而，在注射去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白-干扰素结合物的情况下，30分钟后，2小时后甚至3小时后它仍存留在肝中，而未发现它在膀胱中的存在。
在比较图6的下段时，在干扰素的情况下，上部线中所示的肝的放射性和中部线中所示的血液放射性在30分钟内逐渐下降，而示于下部线的血液放射性则升高。而在去唾液酸的α(1)-酸糖蛋白结合物的情况下，肝的放射性持续保持，而且观察不到膀胱中放射性的增加。上述试验确定了本发明的干扰素结合物在肝中的存留时间比天然干扰素要长得多。
试验3比较干扰素和本发明的结合干扰素在组织中的生物学分布完成上述试验2后将家兔杀死并自其中取出肝、肾、肺、脾、心和甲状腺。测量分布于每个器官中的放射性以计算分布于其中的放射性量。其结果示于图7。
从上述各试验可知，本发明的干扰素结合物对肝的透入强于常规干扰素，而且该结合物在肝中的存留时间也长得多，因此其医学效应可延长一段更长的时间。
组合物实施例配制实施例1去唾液酸血清类粘蛋白-α-干扰素结合物-500000I.U＊氯化物 -8.0mg磷酸氢二钠 -1.74mg磷酸二氢钾 -0.2mg氯化钾 -0.2mg酚 -3.3mg清蛋白(人的) -1.0mg将上述组分溶于用于注射的，其量足以形成溶液的无菌蒸馏水中，而后将形成的溶液置于一无菌管形瓶(1ml)中并在2-10℃下贮存。
＊干扰素活性国际单位。
配制实施例2-4以去唾液酸胎球蛋白-干扰素结合物5000000I.U.去唾液酸血浆铜蓝蛋白-干扰素结合物6000000I.U.，或去唾液酸结合珠蛋白-干扰素结合物1000000I.U.替代配制实施例1中所用的去唾液酸血清类粘蛋白-α-干扰素结合物，并将它们分别与如配制实施例1中的防腐剂、缓冲剂和稳定剂相混合。用注射用无菌蒸馏水使该混合物增溶，而后将此溶液置于无菌的1ml管形瓶中以便注射，再将它如配制实施例1中所述的方式贮存。
配制实施例5去唾液酸血清类粘蛋白-β-干扰素结合物-1000000I.U.
氯化钠 -9.0mg清蛋白(人的) -5.0mg酚 -3.0mg将上述组分溶于注射用的，其量足以形成溶液的无菌蒸馏水中，而后将形成的溶液置于一个无菌管形瓶(1ml)中，并贮存于2-10℃下。
配制实施例6用去唾液酸血清类粘蛋白-γ-干扰素结合物500000I.U.取代配制实施例5的去唾液酸血清类粘蛋白-β-干扰素结合物并以相同的佐剂混合，然后将此溶液置于用于注射的无菌管形管(1ml)中。
按以上的配制实施例制得的制剂是适于静脉注射的。
本公开包括包含在所附的权利要求书中的以及前面所述的内容。尽管本发明以其带有某种程度的特性的较佳形式进行描述，但应理解的是较佳形式的这种公开仅是通过实施例进行的，而各组成部分在结构上，组合上及布置上的细节的变更是可以采用而不违背本发明的精神和范围的。
权利要求
1.一种化学式如下的结合去唾液酸糖蛋白的药剂其中P为人血清糖蛋白的肽基；S为人血清糖蛋白的糖基；Gal为半乳糖基；GA为戊二醛基；X为等于或大于1的整数；而R是选自由干扰素、无环鸟苷钠、三唑核苷、阿糖腺苷、叠氮胸苷、苏拉明、反义低核苷酸、核糖酶(ribozyme)、亚叶酸钙、洗影葡胺钠、钆-DTPA、谷胱甘肽、前列腺素、99mTc及131I所构成的物组中的一种药物组分。
2.一种化学式如下的结合去唾液酸糖蛋白的药剂其中P是人血清糖蛋白的肽基;S是人血清糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;x是等于或大于1的整数;INF是干扰素。
3.权利要求2的结合药剂，其中INF是α干扰素。
4.权利要求2的结合药剂，其中INF是β干扰素。
5.权利要求2的结合药剂，其中INF是γ干扰素。
6.权利要求2的结合药剂，其中所述的P-(S)x-Gal-是去唾液酸的人血清糖蛋白基，其中P是人血清糖蛋白的蛋白质基，S是人血清糖蛋白的糖基而Gal是D-半乳糖基。
7.权利要求6的结合药剂，其中所述的去唾液酸人血清糖蛋白系选自由去唾液酸血清类粘蛋白、去唾液酸胎球蛋白、去唾液血浆铜蓝蛋白、去唾液酸结合珠蛋白、去唾液酸甲状腺球蛋白和去唾液酸巨球蛋白所构成的物组。
8.权利要求2的结合药剂，其中INF是重组体干扰素。
9.一种治疗肝炎的药用组合物，它包含其量足以抑制感染了病毒性肝炎的病人肝细胞中肝炎病毒复制的权利要求2中化学式(1)的结合干扰素、一种药学上可接受的载体、辅助剂或其赋形剂。
10.权利要求9适于静脉给药的药用组合物。
11.一种治疗染有病毒性肝炎病人的病毒性肝炎的方法，该方法通过施用其量足以抑制感染病毒性肝炎病人肝细胞中肝炎病毒复制的权利要求2中化学式(1)的结合干扰素。
12.权利要求11的方法，其中所述结合干扰素是通过静脉给药而施用的。
13.权利要求12的方法，其中足以抑制所述感染了病毒性肝炎病人肝细胞中肝炎病毒复制的权利要求2中的化学式(1)的结合干扰素的量是一天或两天一次，每次以每平方米身体表面干扰素为基准，20-200百万国际单位。
14.制备化学式(1)的结合干扰素的方法，其中P是人血清去唾液酸糖蛋白的肽基;S是人血清去唾液酸糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;GA是戊二醛基;x是等于或大于1的整数;INF是干扰素，该方法包括提供一种人血清的Cohn馏分V上清液;处理此人血清的Cohn馏分V上清液而从中分离出化学式为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白，然后回收该α(1)-酸糖蛋白;用神经氨酸苷酶处理此α(1)-酸糖蛋白以去除唾液酸并得到去唾液酸糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal);以戊二醛(GA)交联法将该去唾液酸糖蛋白与干扰素相联;而后回收结构式为蛋白质-(糖)x-Gal-GA-INF的结合干扰素。
15.权利要求14的方法，其中用常规方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色谱分离该人血清Cohn馏分V上清液而从其中分离出结构式为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的α(1)-酸糖蛋白。
16.权利要求14的方法，其中α(1)-酸糖蛋白是血清类粘蛋白。
17.制备化学式如下的结合干扰素的方法，其中P是人血清糖蛋白的肽基;S是人血清糖蛋白的糖基;Gal是半乳糖基;GA是戊二醛基;x是等于或大于1的整数;INF是干扰素;该方法包括提供包含化学式为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的人血清糖蛋白的人血血清，其特征是自糖蛋白端的第二个基是D-半乳糖(Gal)，而最后一个基是N-乙酰神经氨酸(NANA);处理该人血血清而从中分离出人血清糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal-NANA)，而后回收糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal-NANA);用神经氨酸苷酶处理此糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal-NANA)去除NANA而得到去唾液酸糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal);以戊二醛(GA)交联法使去唾液酸糖蛋白(蛋白质-(糖)x-Gal)与干扰素相联，及回收化学式为P-(S)x-Gal-GA-INF(1)的结合干扰素。
18.权利要求17的方法，其中的人血血清是人血清的一种Cohn馏分V上清液，而且它以常规方式用DEAE-Sephadex或CM-Cellulose色谱分离处理而从Cohn馏分V上清液中分离出化学式为蛋白质-(糖)x-Gal-NANA的人血清糖蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种将去唾液酸糖蛋白与一种对肝有专门作用的药物结合而制成的结合药剂。本发明的结合药剂的化学式为，P—(S)其中，在P-(S)
文档编号A61K45/00GK1068744SQ9210599
公开日1993年2月10日 申请日期1992年6月18日 优先权日1991年6月19日
发明者金丁龙, 李孝锡 申请人:韩国肝研究财团, 金丁龙, 李孝锡