糖尿病治疗剂的制作方法

专利名称：糖尿病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖尿病或高脂血症治疗剂，更详细的说是涉及含有作为有效成分的神经营养因子的糖尿病或高脂血症治疗剂。
背景技术：
近年来，由于生活水平的提高，随着饮食生活向欧美型转变或缺乏锻练倾向的增加，成年人病如糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症病的患者也不断增加。高脂血症与动脉硬化及其引起的缺血性心脏病有关，有时也是与急性胰腺炎的发病有关的重要基础性疾病。另外，确认有患者逐步年轻化的趋势。
糖尿病分为胰岛素依赖性(I型、IDDM)和非胰岛素依赖性(II型、NIDDM)，糖尿病患者的90％以上属于后者。IDDM的治疗可以选择注射胰岛素，NIDDM的治疗可以选择运动疗法、食物疗法以及磺酰脲或双胍类糖尿病口服治疗药(“今日医疗指南TODAY’S THERAPY 1993”日野原重明、阿部正和主编，医学书院，494～498页)。为了调节糖尿病的治疗中最重要的因素——血糖值经常使用这些药物，但是并不能得到理想的效果，其现状是持续的高血糖状态会引起神经障碍、肾病、视网膜病、心血管疾病或者创伤治愈延迟、溃疡化等各种并发症。另外，注射胰岛素容易引起血糖迅速降低、胰岛素分泌刺激剂磺酰脲容易引起延迟性低血糖、厌氧性糖元酵解类抑制剂双胍会引起乳酸中毒的危险，从而使糖尿病患者的生活变得不稳定。
另外，II型糖尿病经常并发高脂血症，胆固醇至甘油三酯异常高的值(总胆固醇220mg/dl以上，甘油三酯150mg/ml以上)是包括心肌梗塞在内的动脉硬化性疾病乃至急性胰腺炎的危险因素，已成为药物疗法的对象。治疗血中胆固醇过高可以使用HMG-CoA还原酶抑制剂(帕伐他丁(Pravastatin)或Simvastatin等)、抑制胆汁酸肝肠循环的消胆胺(cholestyramine)，治疗血中甘油三酯过高主要可以使用作用温和的fibrate类制剂或烟碱酸制剂。(“今日医疗指南TODAY’STHERAPY 1995”日野原重明、阿部正和主编，医学书院，515～517页；以及伴野祥一等“治疗”78卷增刊号，标准处方入门，961060～1066页)。但是，对于高脂血症的基本药物疗法目前尚未确立，持续的血清脂类异常引起的动脉硬化、缺血性心脏病等并发症仍然是先进国家中主要的死因。HMG-CoA还原酶抑制剂可以经口给药，是具有优良作用的药物，但是已知对肝功能障碍或肾障碍患者会带来严重的副作用，已知的有横纹肌融解证。
II型糖尿病还多并发肥胖症。从流行病学的研究来看，可以说肥胖与高血压、脑或心脏的血管病变相关连，主要可以采用节食疗法和运动疗法进行治疗。高度肥胖或不能运动的场合，虽然可以使用外科手术(胃缩小术)或药物疗法(肾上腺素类、5-羟色胺等中枢刺激剂、消化吸收抑制剂)，但目前还仅仅处于试行阶段，也可以说对于肥胖症的基本药物疗法尚未确立〔“肥胖症”日本临床，第53卷·1995年特别号，平成7年6月22日发行，418～492页，日本临床社〕。
如上所述，目前的现状是尽管II型糖尿病、高脂血症、肥胖是关系非常密切的病症，但是为了改善各种症状还是可以对症治疗或给药的。但是节食等疗法、联合用药由于增加了患者的负担，因而也不是优选的。
另一方面，神经营养因子是由生物体内的靶细胞或神经及神经胶质细胞·许旺氏细胞(神经鞘细胞)供给，具有维持神经细胞生存、促进分化等作用的蛋白质的总称，根据所作用的神经或受体可以分为很多种。其中与作为神经营养蛋白已知的蛋白组之间有很高的同源性，形成了一个家族。NGF(神经生长因子)、BDNF(来自脑的神经营养因子)、NT-3(神经营养蛋白)、NT-4/5等均是具有代表性的物质，已知对作为受体的P-75和trk基因产物具有特异性配体的作用(野

村健、Hiroshi HATANAKA；实验医学第13卷376页(1995))。NGF、BDNF等神经营养因子一直作为阿尔察默病(Alzheimer’s disease)、糖尿病性神经病、ALS等神经变性疾病的治疗药来研究其医药用途，但是其降低高血糖状态生物的血糖值的作用以及对于高脂血症等脂肪代谢异常的作用尚未报道。例如A.P.Mizisin等，Society for Neuroscience，第20卷1535页(1995)中说明了BDNF对于糖尿病性末梢神经障碍的药效，该文献基于BDNF在体内可以减轻运动神经传导速度低下的知识，仅仅可以得知其对于神经病的效果，而完全没有记载其对于糖尿病的根本症状高血糖或由其引起的胰岛素抵抗性等病症的改善作用。在特表平7-507053(WO93/15608)中以糖尿病性视网膜病为例说明了BDNF的药效，该申请是以视网膜的神经障碍为对象的。另外，同样，以前未认识到作为神经营养因子对于脂肪代谢系统异常引起的高脂血症和肥胖、内分泌异常引起的高胰岛素血症的改善作用。另外，也并不知道其它神经营养蛋白的下述降血糖作用。也就是说，关于NGF，在Brainresearch，第634卷，第7-12页(1994)中记载了对于链脲霉素诱发糖尿病的大鼠模型NGF具有改善末梢知觉障碍的作用，但是对于其降血糖作用并没有任何研究。关于NT-3，在特愿平5-161493(WO91/3659)中描述了其对于包括糖尿病性神经病在内的末梢性神经障碍的用途，但是并未记载其降低血糖值的作用。另外，关于NT-4，在特表平7-509600(WO93/25684)或特表平6-501617(WO92/5254)中描述了其对于包括糖尿病性神经病在内的末梢性神经障碍的用途，但是并未记载其降低血糖值的作用。只有对于CNTF，报道了其血糖值降低作用(Cytokine，第7卷，150-156页(1995)和cytokine，第8卷，784-793(1996))，其内容为发现静脉注射10μg/kgCNTF后的正常小鼠其血糖由正常血糖值开始降低(约100mg/dl→约80mg/dl)，另外，通过移植能产生CNTF的细胞可以降低正常血糖值。如同一文献记载，这种一时将血糖降低到正常以下的作用是细胞因子(cytokine)IL-1样的作用，但与本发明的核心——使II型糖尿病模型动物的高血糖显著降低的神经营养因子作用——有着本质的区别。
发明描述本发明的目的在于提供一种可以安全地控制糖尿病患者血糖值的新型糖尿病治疗剂，以及可以安全地控制高脂血症患者血中脂肪值的新型高脂血症治疗剂。特别是提供一种可以治疗伴随胰岛素作用不足、胰岛素抵抗性、胰岛素分泌低下或分泌不足产生高血糖、合并葡萄糖毒性、高脂血症、肥胖或高胰岛素血症多种症状的II型糖尿病的糖尿病治疗剂。
本发明者通过各种糖尿病模型动物研究了末梢给药的神经营养因子所带来的影响，得知对于II型糖尿病模型动物的一种伴有高血糖、肥胖、胰岛素抵抗性、高胰岛素血症的自然发病的糖尿病小鼠(C57db/db小鼠石田均等，最新医学，第48卷，34页(1993年))通过投给BDNF可以降低血糖值以及血中脂类的浓度。基于这些知识又进一步进行了研究，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及下述药物。
(1)以神经营养因子为有效成分的糖尿病或高脂血症治疗剂。
(2)如(1)的治疗剂，神经营养因子选自神经营养蛋白家族。
(3)如(1)的治疗剂，其特征在于神经营养因子为trk受体或p75受体的配体。
(4)如(1)的治疗剂，其特征在于神经营养因子为trkB或trkC受体的配体。
(5)如(1)的治疗剂，神经营养因子为来源于脑的神经营养因子(BDNF)。
(6)如(1)的治疗剂，神经营养因子为NGF。
(7)如(1)的治疗剂，神经营养因子为NT-3或NT-4/5。
(8)如(1)的治疗剂，神经营养因子为CNTF。
(9)如(1)的治疗剂，神经营养因子为GDNF。
(10)如(1)的治疗剂，神经营养因子为HGF。
(11)如(1)至(10)的治疗剂，糖尿病为非胰岛素依赖性糖尿病(II型，NIDDM)。
(12)如(1)至(10)的治疗剂，其特征在于糖尿病为伴有高血糖、高胰岛素血症、高脂血症和/或肥胖的非胰岛素依赖性糖尿病。
(13)如(1)至(12)的治疗剂，其特征在于神经营养因子通过诱导的体液生理活性物质发挥药效。
(14)以神经营养因子为有效成分的高胰岛素血症的治疗剂。
(15)如(14)的治疗剂，其特征在于高胰岛素血症伴随着综合症X、死亡四重奏或内脏脂肪综合症。
(16)如(1)至(10)的高脂血症治疗剂，用于治疗伴随着糖尿病的高脂血症。
(17)如(1)至(10)的高脂血症治疗剂，用于治疗伴随着肥胖的高脂血症。
(18)如(1)至(10)的高脂血症治疗剂，高脂血症治疗剂是血中甘油三酯过高的治疗剂。
图面说明

图1表示对于db/db小鼠血中脂类的调节作用。BDNF给药组与PBS给药组相比，血中甘油三酯浓度显著减少。另外，对于总胆固醇，由于投给BDNF其血中浓度也有某些降低趋势。
图2表示对于db/db小鼠的抗肥胖作用。BDNF给药组与PBS给药组相比，确认体重没有增加，抑制了肥胖。
图3表示对于db/db小鼠改善胰岛素抵抗性的作用。BDNF给药组与PBS给药组相比，血中胰岛素浓度显著降低。
发明的最佳实施方式以下详细的说明本发明。
在本说明书中，“神经营养因子”是1950年发现的神经生长因子(NGF)等具有维持神经细胞生存、促进神经分化等生理作用的蛋白质的总称。具体的说，是指来源于脑的神经营养因子(BDNF)，NGF，包括神经营养蛋白3(NT-3)、神经营养蛋白4/5(NT-4/5)和神经营养蛋白6的神经营养蛋白家族(R.M.Lindsay等，TISN，第17卷182页(1994)以及R.M.Lindsay，Phil.Trans.R.Ssoc.Lond.B.，第351卷，第365-373页(1996))，以及睫状体神经营养因子(CNTF)、来源于神经胶质的神经营养因子(GDNF)、神经胶质生长因子(GGF2)、中枢神经系统生长因子(AF-1)、肝实质细胞增殖因子(HGF)(A.Ebens等，Neuron，第17卷，第1157-1172页(1996)等)等。而且，采用基因工程的常规方法使氨基酸序列部分取代、添加、缺失、除去所制成的上述神经营养因子的变更产物，只要具有天然型神经营养因子的生理活性，可以包括在本发明的神经营养因子中。
“神经营养蛋白”是指在生物体内由神经生长靶细胞分泌，或通过自分泌和旁分泌有助于神经元生长、分化、生存并使之形成神经回路(神经突触)的神经营养因子。目前已知有BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5、NT-6，是氨基酸序列有很高同源性并具有类似结构的蛋白质组。以后也有可能发现新的神经营养蛋白，根据本专利申请的实施例所描述的公知的实验动物模型可以评价其药效，该神经营养蛋白也包括在本发明所提供的“糖尿病治疗剂”的概念中。这些神经营养蛋白家族中，作为神经营养蛋白受体已知的trk基因(trkA、trkB、trkC)表达产物是很有用的，特别是通过trkB或trkC基因表达产物TrkB或TrkC受体表现其生理活性的BDNF、NT-3、NT-4/5作为糖尿病治疗剂是非常有用的。
“糖尿病”是通常控制在100～120mg/dl的血糖值异常升高的疾病。按照现在诊断的基准，负载75g葡萄糖2小时后血糖值为200mg/dl以上，空腹时血糖达到140mg/dl以上。一般，糖尿病分为伴有胰岛素产生细胞减少的胰岛素依赖性(I型，IDDM)和由胰岛素敏感性降低或胰岛素分泌降低引起的非胰岛素依赖性(II型，NIDDM)，糖尿病患者90％以上属于后者。前者被认为是基于一定因素造成的病毒感染或自身免疫机制引起的胰岛炎，由于胰脏的胰岛出现炎症，胰岛素产生细胞被破坏，导致绝对的胰岛素缺乏。多数场合下发病迅速，酮病的趋势增强，为了维持生命必需继续注射胰岛素。
“非胰岛素依赖性糖尿病(II型，NIDDM)”是酮病倾向弱、发展缓慢，并不一定必须进行胰岛素治疗的糖尿病。其发病有的被认为是由于对葡萄糖负载胰岛素分泌不足、特别是初期分泌不足的遗传因素，由加上肥胖、过度饮食、缺乏锻练、年龄增大等环境因素造成的。另一方面，其发病也有的被认为是由于胰岛素作用不足(胰岛素抵抗性)的遗传因素导致胰脏B细胞负荷过大、疲惫，由加上环境因素造成的。后一种类型以欧美的患者居多，血中胰岛素的浓度很高(高胰岛素血症)、并伴有肥胖的场合较多。总之是处于相对的胰岛素缺乏状态，但并不一定必须用胰岛素进行治疗，能够以食物疗法、运动疗法作为基础，在血糖调节不良的场合，采用促进胰岛素分泌的磺酰尿素药(SU药)、抑制小肠吸收糖的药物进行治疗。特别是对于伴有肥胖的患者不能使用US药，可以考虑使用双胍进行治疗或使用最近上市的可以解除胰岛素抵抗性的新药等。胰岛素依赖性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病两者，在由于血糖调节不良而持续高血糖状态时，均可以引起糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、皮肤溃疡、坏死、心血管障碍等各种并发症。
在本发明、本说明书中，被称为MODY(maturity-onset type of thediabetes in the young)的青年发病的非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素受体异常、与胰岛素分泌或胰岛素作用等糖代谢有关的酶或分子等的基因异常引起的糖尿病也包括在II型糖尿病内。另外，虽然与糖代谢之间的直接关系、机理尚不清楚，但伴有作为II型糖尿病发病基因进行解析的线粒体等基因异常的糖尿病也包括在内。而且，糖皮质激素等甾体类药物连续给药时所产生的病理高血糖状态(甾体类糖尿病)、库兴氏综合征(Cushing’s syndrome)或肢端肥大症中的高血糖状态，从正常乃至高胰岛素状态下的糖尿来看，也包括在II型糖尿病内。
“高脂血症治疗剂”是指投药给高脂血症患者，使由甘油三酯(中性脂肪)和胆固醇组成的血中脂类浓度下降的药物。
“高脂血症”是血中脂类浓度持续处于异常高值的疾病，按照现在的诊断基准，可以说是处于空腹时血清总胆固醇值为220mg/dl以上或血清甘油三酯为150mg/ml以上的状态。已知高脂血症一般是缺血性心脏病等动脉硬化性疾病的危险因素，特别是LDL胆固醇的增加、HDL胆固醇的减少是最危险的。LDL-C值达到100-160mg/ml以上、HDL值不满40mg/ml的场合即成为“高脂血症治疗剂”的给药对象。“高脂血症”中有由于家族性血胆固醇过高等遗传因素引起的，以及由于肥胖或过度饮食、讲究饮食引起的，而且按症状可以分为高乳糜微粒血症(I型)、高胆固醇血症(IIa型高脂血症)、高甘油三酯血症(IV型)、其并发型(IIb型或III型)等。本说明书中的高脂血症是将这些全部包括在内的概念。
“血糖调节作用”是指将糖尿病患者的血糖值降低或保持在正常范围内的作用。“血中脂类调节作用”是指将高脂血症患者的血中总胆固醇值或血中总甘油三酯值降低或者保持在正常范围内的作用。“组织脂肪蓄积调节作用”是指通过使肥胖患者减少能量摄取或减少体内脂肪蓄积，从而减少体重的作用。
“胰岛素抵抗性”是指为了与健康人同程度的发挥胰岛素作用所必需的胰岛素水平比健康人高很多的状态。即胰岛素的作用、敏感性降低的状态。胰岛素作用的靶器官，例如肝脏、肌肉(骨骼肌)、脂肪组织。在本发明、本说明书中，末梢器官是指胰岛素作用的肝脏、肌肉(骨骼肌)、脂肪组织。对于肝脏，胰岛素具有抑制糖异生、抑制糖释放等作用。对于肌肉、脂肪组织，胰岛素具有促进糖吸收的作用，糖的吸收与从被称为GLUT4的糖运输载体由细胞质内向细胞膜表面移位(translocation)有关。作为胰岛素抵抗性的临床评价，例如降血糖高胰岛素血夹(euglycemic hyperinsulinemic clamp)法等。
虽然胰岛素抵抗性的原因并不清楚，但是对于末梢器官即肝脏、肌肉、脂肪组织，胰岛素作用不足的原因可以认为有以下几点。可以认为是以胰岛素受体为媒介的信号传导通路障碍·异常、胰岛素对于肌肉·脂肪组织的激素作用所引起的与糖吸收有关的GLUT4(糖运输载体)低下·机能异常、向GLUT4的细胞膜转运(translocation)表达低下异常、肌肉·肝脏中糖元合成低下、肝脏的糖异生亢进等。造成胰岛素抵抗性的分子并不清楚，但可以指出其与葡萄糖胺、被称为RAD的低分子G蛋白、Chyroinositol肌醇、TNF-α、游离脂肪酸、被称为PC-1的膜蛋白等有关。胰岛素受体基因异常引起的胰岛素作用不足是已知的胰岛素受体异常。
另外，糖尿病中所确认的高血糖，并不是单纯的一个检查结果，高血糖可以障碍胰岛素的分泌造成，使胰岛素抵抗性不断恶化。这样高血糖可以被认为是助长代谢异常的重要病因“葡萄糖毒性”(参见门胁孝编，糖尿病分子医学，羊土社(1992年)等)。
“胰岛素抵抗性的改善作用”是指拮抗末梢组织的糖吸收低下、糖元分解亢进、糖异生亢进等，特别是II型糖尿病中可见的体细胞对于胰岛素敏感性钝化引起的变化(胰岛素抵抗性的增大)的药理作用。显示该药理作用的场合，一般降低了血糖值，由于生物体系的反馈血中胰岛素浓度也降低。
1988年G.M.Raven提出了综合症X(Syndrome X)的概念，即同时患有胰岛素抵抗性、耐糖能力低下、高胰岛素血症、高VLDL甘油三酯血症、低HDL胆固醇血症、高血压，容易发生动脉硬化的综合症(G.M.Raven，Diabetes，第37卷第1595-1607页(1988))。在1994年第15回国际糖尿病学会的讨论会中，对以胰岛素抵抗性为基础的高胰岛素血症发病后继续引起耐糖能力低下、高VLDL甘油三酯血症、低HDL胆固醇血症、高血压最终导致心血管系统障碍的“胰岛素抵抗性综合症”这一概念展开了讨论。另外，在1989年N.M.Kaplan将上半身肥胖、耐糖能力低下、高甘油三酯血症、高血压称为死亡的四重奏(deadlyquartet)，并指出对于同时患有这些病症的人缺血性心脏病的发病率很高(N.M.Kaplan，Arch.INtern.Med.第49卷，1514-1520页(1989))。而且，松泽等由肥胖的病理研究开始着眼于脂肪分布与并发症的关系，发现腹腔内的内脏脂肪(肠系膜脂肪或大网膜脂肪)蓄积形成的内脏脂肪型肥胖与皮下脂肪肥胖相比多伴有耐糖能力低下、胰岛素抵抗性、高脂血症、心血管障碍。松泽等提出了内脏脂肪综合症(visceral fat syndrome)的概念，即以内脏脂肪蓄积为基础的耐糖能力低下、胰岛素抵抗性、高脂血症、高血压等数个危险因素同时存在容易引起动脉硬化的病态(中村正等，第12回日本肥胖学会记录，第161-162页(1992)；藤冈滋典、松泽佑次，分子糖尿病学的进步，第145-151页(1994))。上述各个概念均是相互关连的概念，除上述名称以外，以饮食生活欧美化为病因的可以类似地称为可口可乐综合症(coca-colanization)、文化互渗(Acculturation)、现代化(Modernization)、西化(Westernization)等，也可以称为“New WordSyndrome”。如本发明、本说明书的实施例所示，神经营养因子的确对于预防、治疗上述概念的综合症、疾病、病态等有效。
在本说明书中，“高胰岛素血症”是血中的胰岛素浓度比正常范围高的病态、疾患的总称。“综合症X”是指同时患有胰岛素抵抗性、耐糖能力低下、高胰岛素血症、高VLDL甘油三酯血症、低胆固醇血症、高血压容易发生动脉硬化的综合症。“死亡的四重奏(deadly quartet)”是指同时患有上半身肥胖、耐糖能力低下、高甘油三酯血症、高血压的疾病。“内脏脂肪综合症(visceral fat syndrome)”是指腹腔内内脏脂肪(肠系膜脂肪或大网膜脂肪)蓄积、以内脏脂肪蓄积为基础的耐糖能力异常、高脂血症、高血压等数个危险因素同时存在，容易引起动脉硬化的病态。
“神经营养因子诱导的液体生理活性物质”是指投给神经营养因子后在动物的生物体内进行诱导，由末梢血释放的具有血糖调节作用、血中脂类调节作用、体内脂肪蓄积调节作用或改善胰岛素抵抗性作用的生理活性物质的总称。
制备方法本发明的糖尿病或高脂血症治疗剂中所使用的神经营养因子，只要具有其各自固有的生理活性即可，无论天然提取物、基因重组产物都可以在纯化后用于本发明。以下说明它们的制备方法。
BDNF的制备方法BDNF是根据Barde，Y.E(The EMBO J.，第5卷，第549-553页(1982))从猪脑分离出来之后克隆得到的具有由119个氨基酸构成的一级结构的物质(Leibrock，J等，Nature，第341卷，第149页(1989))，N末端具有蛋氨酸残基的Met-BDNF通过现在公知的手段将上述天然序列的一部分取代、缺失或添加制成的重组BDNF变更产物，只要是具有BDNF活性的药物制剂均包括在本发明的技术范围内。
另外，在本说明书中，BDNF的活性是指后根神经节、迷走神经下神经节、运动神经元、视网膜神经节、黑质多巴胺能神经元、前脑基底胆碱能神经元等维持生存、促进分化的作用等。其在生物体内的作用可以通过体外或体内进行确认(特开平5-328974、US5180820)。
已经报道了多种BDNF的生产方法，采用任何一种方法制得的BDNF均可用于本发明的制剂。动物组织提取物的场合，只要是纯化到可以用作药物的程度即可(The EMBO J.，第5卷第549-553页(1982))。另外，也可以培养产生BDNF的原代培养细胞或株化细胞，从培养物(培养上清，培养细胞)分离纯化得到BDNF由表，可通过基因工程学方法将编码BDNF的基因重合到合适的载体中，然后将它们插入到适宜的宿主中进行转化，从所得转化体的培养上清中可得到目的重组BDNF(例如Proc.Natl.Acad.Sic.USA，第88卷，961页(1991)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，第186卷，1553页(1992))，该方法适于均匀且大量的生产BDNF。上述宿主细胞并无特别的限定，可以使用以前在基因工程的手段中使用的各种宿主细胞，例如大肠菌、枯草芽孢杆菌、酵母、植物或动物细胞。
NGF的制备方法NGF与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。以动物细胞作为宿主的场合(CHO细胞Schmelzer，C.H.，J.Neurochemistory，59，1675-1983(1992))、以原核细胞作为宿主的场合(大肠杆菌日本专利2637392号)均可以制得具有活性的NGF。
NT-3的制备方法NT-3与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。Neuron，第4卷，767-773(1990)或特开平5-161493(WO91/3659)中公开了其制备方法、鉴定方法。
NT-4的制备方法NT-4与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。Proc.Natl.Acad.Sic.USA，第89卷，3060-3064页(1992.4)、特表平7-509600(WO93/25684)或特表平6-501617(WO92/5254)中记载了重组NT-4表达方法以及鉴定方法。
CNTF的制备方法CNTF与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。Biochimica et Biochimica Acta，第1090卷，70-80页(1991)、J.Neurochemistry，第57卷，1003-1012(1991)中记载了重组CNTF表达方法以及鉴定方法。另外，特表平4-502916(WO90/7341)中公开了重组制法和纯化方法。
GDNF的制备方法GDNF也与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。Science，第260卷，第1130-1132页(1993.5)、WO97/19694、WO97/19695中公开了制备方法。
HGF的制备方法HGF与BDNF同样，可以使之在各种宿主细胞中表达而制得。例如可以按照Nature，第342卷，440(1989)、特开平5-111383、特开平4-30000中记载的方法得到重组HGF，并评价其活性。
制剂上述各种神经营养因子的制剂，可以使用注射剂、口服剂、液体制剂、冷冻干燥物中的任意一种，特别优选皮下给药用的注射剂。这些药物制剂中可以使用本领域(药用蛋白质制剂技术)中所公知的稳定剂、载体，例如可以使用白蛋白等来源于血浆的蛋白、甘氨酸等氨基酸、甘露醇等糖用于皮下、静脉内或肌肉内给药用的冷冻干燥制剂。另外，作为水溶制剂、冷冻干燥制剂使用时，为了防止凝集优选添加Tween80等表面活性剂。需要长期的药效时，也可以使用公知的蛋白质缓释制剂载体来制备。
使用方法本发明的糖尿病或高脂血症治疗剂的使用方法如下所述。
BDNF的使用方法主成分为BDNF时，1天的用量为成人每公斤0.01μg～100mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下、皮内或肌肉给药。给药次数可以根据给药量、给药途径或患者的症状适当增减，并没有特别的限制，可以1月1次至1日3次给药，进行给药治疗1日至9个月。经过这种治疗，血糖值、血中脂类和体内脂肪(或体重)减少，可以适度降低血糖值、血中脂类并使之稳定。另外，同时考虑日常的饮食生活，为了控制饭后的高血糖，可以在饭前投给本发明的速效性治疗剂；为了增强两餐之间空腹的时候或睡眠中胰岛素基础分泌带来的作用，可以投给具有持续性作用的治疗剂。
NGF的使用方法主成分为NGF时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～10mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。另外，NGF与BDNF或NT-3等通过trkB、trkC受体作用的神经营养蛋白相比，为了使之显示降血糖作用还需要更大的给药量。也就是说，在动物试验中，其它神经营养蛋白20mg/kg即可确认其有效性，而通过trkA受体作用的NGF使用相同用量是无效的，100mg/kg才可以确认其有效性。
NT-3的使用方法主成分为NT-3时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～40mg，优选0.1μg～lmg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。
NT-4的使用方法主成分为NT-4时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～40mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。
CNTF的使用方法主成分为CNTF时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～40mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。
GDNF的使用方法主成分为GDNF时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～40mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。
HGF的使用方法主成分为HGF时，通常1天的用量为成人每公斤0.01μg～40mg，优选0.1μg～1mg/kg，经静脉、皮下或肌肉给药。
作用机理神经营养因子的降血糖作用和治疗高脂血症的作用不能根据以前的知识来解释，至少可以认为是与胰岛素或IGF的作用或者HMG-CoA还原酶抑制剂(帕伐他丁或Simvastatin等)、抑制胆汁酸肝肠循环的消胆胺(cholestyramine)，或fibrate类制剂及烟碱酸制剂完全不同，通过新的药理机制发生作用。
神经营养因子的抗糖尿病作用的机理尚不清楚。但是，可以假定为以下的作用方式。首先，可以考虑通过神经细胞特别是trk、p75等受体发生作用的可能性以及通过非神经细胞中存在的含有trk、p75等的受体发生作用的可能性。也可能由于这些刺激直接的或通过其它第二生物体内分子间接的发生作用。作用部位可以假定为(1)丘脑下部等中枢神经或下垂体，(2)肌肉、脂肪、肝脏等末梢组织，以及(3)可以产生胰岛素的胰脏3个部位。首先，可以认为是通过丘脑下部或下垂体维持血糖等生物内环境稳定的调节作用。对于第二末梢组织，可以假定是胰岛素抵抗性的缓解、解除。对于胰脏，可以认为是对胰高血糖素的影响。由于已经确认了其速效作用，其缓释作用可以假定为通过投给神经营养因子在生物体内诱导作为第二活性本体的不稳定活性物质或液体生理活性物质。
毒性、副作用BDNF对大鼠和弥猴分别以BDNF100mg/kg、60mg/kg的量皮下给药4周，未出现死亡例，另外至于急性毒性，对大鼠和弥猴以200mg/kg以上的给药量给药也未发现死亡，安全性较高。另外，将BDNF投给大鼠等正常动物时，血糖未降低，认为没有引起低血糖的危险性。将BDNF投给断食一夜的正常动物时，血糖也未降低。
NGFNGF静脉注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)1次给药的场合，已有报告指出使用0.1μg/kg以上的用量对于健康正常人志愿者会出现肌肉痛，但即使以最大给药量1μg/kg给药也不会有危及生命的严重副作用(Ann.Neurol.，第36卷，第244-246页(1994))。另外，将NGF5mg/kg(s.c.)投给大鼠，每周3次，给药14周，研究其对知觉神经障碍的影响(Brain research，第634卷，第7-12页(1994))，发现1天的用量在mg/kg等级不会达到大鼠的致死量。
CTNF对于肌肉萎缩性侧索硬化症(ALSAmyotrophic lateralscleorosis)患者皮下注射，1天0.5～30μg/kg，每周3次，给药12周后，发现30μg/kg的用量会引起发热、干咳、疲劳感(ClinicalNeuropharmacology，第18卷，第515-532页(1995))，但是并没有报告说明该用量具有致死作用。另外，对于相同的患者连日皮下给药2～100μg/kg进行研究，结果发现有既往病史的患者以高用量(10μg以上)投给CNT后会出现疱疹口炎、食欲减退、体重减少、咳嗽等(Neurology，第47卷，第1329-1331页(1996))。
NT-3、NT-4、GDNF和HGF确认这些神经营养因子都与BDNF相同，没有危及生命的副作用、毒性。
以下，结合实施例说明本发明。
制剂例在本发明的神经营养因子制剂中，代表性的BDNF皮下给药用水溶制剂或冷冻干燥制剂，可以按照以下的方法制备。
(1)相对于纯化重组BDNF 1mg，加入甘氨酸0.34mg、甘露醇9mg、非离子表面活性剂聚山梨醇酯80 0.2mg，溶解于磷酸缓冲溶液1ml(pH7.4，5mM)，将上述溶液冷冻干燥。
(2)用含有150mM氯化钠、0.01％Tween80的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)将BDNF调节为5mg/ml，得到BDNF水溶液。
(3)用含有150mM氯化钠、0.01％Tween80的10mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)将BDNF调节为5mg/ml。然后加入甘露醇使之达到10mg/ml，得到BDNF水溶液。填充到无菌的小瓶中，冷冻干燥，得到BDNF冷冻干燥制剂。在小瓶中封入氮气，封口。
实施例1药理试验对db/db小鼠的血糖调节作用让非胰岛素依赖性糖尿病小鼠“db/db小鼠”(雌性，10周龄，每组10只)自由摄食，投给BDNF 20mg/kg，1日1次，1周5日，共给药8周(皮下给药)。给药前以及给药后4和8周后由尾静脉取血，使用Tide血糖测定试剂盒(己糖激酶法，拜耳·三共)测定血中的葡萄糖浓度。给药前的取血在自由摄食的条件下进行，给药第4和8周的取血在断食24小时后进行，以PBS(磷酸缓冲生理盐水)给药组作为对照组。
使用BDNF得到的结果如表1所示。通过Student’s t-检验检定BDNF给药组与对照组的血糖值之间的显著差别。
表1

**p＜0.01*p＜0.05如表1所示，BDNF给药组与对照组相比，血中葡萄糖浓度大幅度减少，血糖值接近正常小鼠的血糖值。而且，对该db/db小鼠的降血糖作用不会降低到正常小鼠(db/m小鼠)的血糖值以下，具有特异性。而已知的口服降血糖药往往会导致低血糖，与此相比这可以说是一个优良的特性。另外，由于BDNF给药组的摄食量也有所减少，即使将对照组的饲料量调节到与BDNF给药组相同的量(Pair feeding)进行试验，仍可以见到同样的血糖值差。可以认为BDNF调节血糖值的作用并不仅仅是由于摄食量的减少而造成的。
实施例2药理试验BDNF对db/db小鼠的血中脂类调节作用让高血糖以及高脂血症自然发病的db/db类小鼠(雌性，7周龄，每组9-10只)自由摄食，投给PBS(磷酸缓冲生理盐水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每周7日，皮下给药2周。最后一次给药约24小时后，在自由摄食的条件下由尾静脉取血，测定血浆中脂类浓度。使用和光纯药的甘油三酯测定试剂盒“甘油三酯G-Test wako-”测定血中甘油三酯的浓度，使用和光纯药的总胆固醇测定试剂盒“胆固醇E-Test Wako-”测定血中总胆固醇浓度。另外，以未患有高脂血症的db/m小鼠的血中脂类浓度作为健康正常动物血中脂类的标准值。
试验结果如图1所示。投给PBS的db/db小鼠的血中脂类为甘油三酯达到约180mg/dl，总胆固醇达到150mg/dl，与db/m小鼠相比分别增加到2.5倍、1.7倍。另一方面，BDNF给药组显著抑制了血中脂类浓度的增加，特别是甘油三酯浓度的增加，甘油三酯显著降低到约75mg/dl(经Student’s t-检验检定)。总胆固醇也有降低到138mg/dl的趋势。
实施例3药理试验BDNF对db/db小鼠的抗肥胖作用让高血糖以及肥胖症自然发病的db/db系小鼠(雌性，7周龄，每组9-10只)自由摄食，投给PBS(磷酸缓冲生理盐水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每天皮下给药，共给药4周。7天、14天、28天后于BDNF给药前测量体重。
试验结果如图2所示。PBS给药组体重竟增加10g(27g→37g)，而BDNF给药组4周体重仅增加了1g，确认未出现肥胖(25g→26g)。
实施例4药理试验BDNF对db/db小鼠的胰岛素抵抗性改善作用让高血糖以及高胰岛素血症自然发病的db/db小鼠(雌性，7周龄，每组9-10只)自由摄食，投给PBS(磷酸缓冲生理盐水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每日皮下给药，共给药4周。最后一次给药约24小时后，在自由摄食的条件下由尾静脉取血，测定血浆中的胰岛素浓度。使用森永生科学研究所(株)的胰岛素测定试剂盒测定血中胰岛素浓度。另外，以未患有高胰岛素血症的db/m小鼠的血中胰岛素浓度作为健康正常动物的血中胰岛素浓度标准值。
试验结果如图3所示。投给PBS的db/db小鼠的血中胰岛素达到约17ng/ml，而BDNF给药组则显著抑制了血中胰岛素的增加，显著降低到约9ng/ml(经Student’s t-检验检定)。与对照组相比，BDNF给药组尽管降低了胰岛素浓度，也仍然降低了血糖值，说明对于BDNF给药组db/db小鼠的胰岛素抵抗性得到了改善。
实施例5药理试验神经营养因子对db/db小鼠的血糖调节作用让非胰岛素依赖性糖尿病小鼠“db/db小鼠”(雌性，7周龄，每组3-4只)自由摄食，将神经营养因子20mg/kg～100mg/kg皮下给药。给药前和给药后1，2，3，4，6小时后由尾静脉取血，使用アントセンスII(固定化酶膜/过氧化氢电极法，拜耳·三共)测定血中葡萄糖浓度。以PBS(磷酸缓冲生理盐水)给药组作为对照组。
结果如表2所示。通过t-检验或Welch检验检定给药前的值与给药后的值之间的显著差别。另外，各种神经营养因子使用以下各公司的产品。BDNF(リジエネロン社)、CNTF(リジエネロン社)、HGF(住友制药)、NT-3(ペプロテツク社)、GDNF(ペプロテツク社)、NGF(セロテツク社)。
表2

工业实用性如上所述，本发明的降血糖药除具有血糖调节作用之外，还具有调节血中脂类的作用、调节体内脂肪蓄积的作用、改善胰岛素抵抗性的作用，可以综合治疗同时患有高脂血症、肥胖症或高胰岛素血症的糖尿病。
权利要求
1.糖尿病或高脂血症治疗剂，以神经营养因子为有效成分。
2.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子选自神经营养蛋白家族。
3.如权利要求1所述的治疗剂，其特征在于神经营养因子为trk受体或p75受体的配体。
4.如权利要求1所述的治疗剂，其特征在于神经营养因子为trkB或trkC受体的配体。
5.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为来源于脑的神经营养因子(BDNF)。
6.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为NGF。
7.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为NT-3或NT-4/5。
8.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为CNTF。
9.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为GDNF。
10.如权利要求1所述的治疗剂，神经营养因子为HGF。
11.如权利要求1至10任一项所述的治疗剂，糖尿病为非胰岛素依赖性糖尿病(II型，NIDDM)。
12.如权利要求1至10任一项所述的治疗剂，其特征在于糖尿病为伴有高血糖、高胰岛素血症、高脂血症和/或肥胖的非胰岛素依赖性糖尿病。
13.如权利要求1至12任一项所述的治疗剂，其特征在于神经营养因子通过诱导的液体生理活性物质发挥药效。
14.高胰岛素血症的治疗剂，以神经营养因子为有效成分。
15.如权利要求14所述的治疗剂，其特征在于高胰岛素血症伴随着综合症X、死亡四重奏或内脏脂肪综合症。
16.如权利要求1至10任一项所述的高脂血症治疗剂，用于治疗伴随着糖尿病的高脂血症。
17.如权利要求1至10任一项所述的高脂血症治疗剂，用于治疗伴随着肥胖的高脂血症。
18.如权利要求1至10任一项所述的高脂血症治疗剂，高脂血症治疗剂是高甘油三酯血症的治疗剂。
全文摘要
提供一种以BDNF(来源于脑的神经营养因子)、trkB或trkC受体的配体、NGF、NT－3、NT－4/5、CNTF、GDNF、HGF等神经营养因子为有效成分的糖尿病或高脂血症治疗剂,特别是Ⅱ型糖尿病的治疗剂。提供一种新型糖尿病或高脂血症治疗剂,它与Ⅱ型糖尿病治疗剂的主流——口服降血糖药不同,除具有血糖调节作用以外还具有调节血中脂类的作用、调节体内脂肪蓄积的作用,单独使用即可改善伴有高脂血症或肥胖症的糖尿病的危险因素。
文档编号A61K38/18GK1250379SQ98803408
公开日2000年4月12日 申请日期1998年1月19日 优先权日1997年1月23日
发明者岸野道子, 中山智加男, 泰地睦夫, 市原准二, 野口浩 申请人:住友制药株式会社