专利名称：草本提取物的化学和药理学标准化方法
技术领域：
本发明涉及一种使提取过程具有可靠重现性的方法。本发明还涉及一种可再现性地从生物来源，特别是植物原料中提取化学组分的药理活性混合物的方法。此外，本发明涉及一种从具有高效药理活性的生物来源中获得药理活性物质的混合物的方法。
背景技术：
除了在烹饪中普遍使用草本之外，草本已在人类开始耕种后不久就被用于草药治疗和草药剂中。草本还可以作为饲料添加剂应用于某些饲养动物以促进日间活动。在上述治疗中所采用的草本以及作为饲料添加剂的草本通常以冷浸剂或茶剂方式摄入，或作为泥敷剂外用。在这些应用中，所用草本常常是多种化学化合物的混合物。一般地，适当使用被普遍接受的草药治疗不会在患者中引起有害的副作用。虽然那些已在治疗中使用了数个世纪的培养物业已确立了草药治疗的有效性，但它仍未被西方科学界的“合法化”。
西药通常采用单一化合物或较少化合物的混合物单独地或更优选地与可药用载体一起给药。强大的科学发明和临床观察使对单一化合物作为药物的研究和开发成为主流。不幸的是，这些药物中的许多具有较短的用药史，而且多种药物已经显现出严重的副作用。
尽管是在一定程度上，西药法被认为是治疗的科学，而传统草本药物被认为是治疗的技术。如今，草本药物虽然在西方社会得到一定承认，但仍然面临着一些特殊的挑战。首先，在偏向于高技术和科学的当今社会中，许多高度训练有素的行医者持有的观点是草本药物缺乏足够的科学证明数据。其次，他们关心的是草药剂中的哪些组分具有药学效果。此外，对草药剂中药学有效组分的浓度或剂量提出质疑。简单来说，传统行医者缺乏对草本药物的定量和定性标准。缺乏标准化被认为是有碍于此类非传统药物或草本药物的处方和剂量调整。缺乏标准还导致管理机构不愿意进一步调查和接受这些非传统药物。
虽然不符合一些西方传统药物的标准，但已知草本组合物在多种疾病的治疗中相当有效且具有很低或没有副作用。在许多情况中，药学活性不但归因于存在具有特定生物活性的化合物，而且还在于草本混合物所含的两种或多种化学化合物的相互组合而具有的协同作用。
由于被称作草药剂和生物强化草本组合物的草药治疗剂衍生自植物，所以草药治疗剂的化学组合物根据多种因素而变化，而不单单取决于遗传组成和植物生长的生长条件、收获条件以及植物活性组分的分离。因此，特定的植物生物变种通常被认为能够使在植物中所发现的具体化学组分的数量产生某些变化。同样地，甚至就植物的相同生物变种而言，土壤、湿度和其它生长条件的不同也可以显著影响植物生产特定化学组分的数量。
最后，处理植物的方式也严重影响从植物得到特定化学组分的相对比例和总量。所以，收获、储存、粒度减小、液体组分的压榨和提取都会决定化学组分的比例和含量，由此影响被分离产物的药学活性。
鉴于有许多因素影响草本组合物的组成和药学活性，人们期望应用能够使草本组合物在其化学组成以及化学混合物的药学活性两方面中都得以标准化的方法。此外，尽管不可能令大规模种植的植物生长条件标准化，但希望能够使加工条件标准化，以便获得标准化的草本组合物。而且，应能够精确测定和比较生物混合物，特别是植物或草本混合物的组成，由此应对加工条件进行控制以获得高效药理活性。若这样的方法能被科学界采用时，不但医师能够有信心对草本组合物的具体剂量进行处方，而且草本组合物的“制造商”将从混合物获得更高的药学活性、提高质量控制并且能够区分出不同来源的草本组合物。发明公开本发明提供一种获得具有高度药学活性的标准化生物组合物的方法和一种获得标准化加工过程的方法。本发明还能够通过特殊加工(如提取)分离出具有高或最高药理活性的生物组合物，特别是草本组合物。此处的“生物组合物”是指从生物源得到的组分的混合物。所述生物源是动物或植物。预计本发明可最广泛地应用于植物或植物原料。此处的术语“组合物”是指不同组分的混合物。此处所用的术语“组分”是指化学化合物、此类化合物的盐、复合物以及自然界中发现的其它分子或离子。此处所用的术语“草本”及其变化形式是指可食用植物或植物物质或材料。
本发明的用于标准化得自于生物源(优选植物)且具有生物或药理活性的化学组分的混合物的方法包括首先，对许多得自于相同生物源，优选植物源的样本进行多种不同的加工，从而得到多种产物。随后，对分离的产物进行药理学实验并选出在实验中被证实具有最高药理学活性的产物。此后，重复进行用于制备被选产物的特殊加工过程以制得试验产物。此后，同时对被选产物和试验产物进行物理和/或化学试验，以获得与产物的化学组分有关的定性信息，并且在多数情况下还可以获得定量信息。开始时应用于多种产物的药理学实验随后只针对试验产物反复进行。比较被选产物和试验产物彼此之间的定性和定量信息(有时也称作“化学指纹图谱”)以及药理学活性。在某些情况中，当试验产物中的一种或多种化学组分的含量与同一化学组分在被选产物中的含量的差别不超过约±10％，同时试验产物的药理学活性与被选产物的相应药理学活性之间的差别不超过±10％时，用于制备被选产物的方法则被选择作为制备药理活性混合物的标准方法。此外，如果发现了最高的药理学活性，那些经药理学实验(或“药理学指纹图谱”)测定具有最高药理活性且得到物理和/或化学实验(或“化学指纹图谱”)鉴别的混合物亦可被选择作为优选的药理活性混合物。
通常所用的加工方法都相似或基本相同。例如，当化学组分的混合物来源于植物原料时，例如是草本药物或组合物中所用的混合物时，加工方法一般可以包括收获方法、储存方法、液体组分的压榨法以及适合提取化学组分且首选提取具有药理学活性的化学组分的方法。具体加工时须对方法进行选择并且可加以改变，如果可能的话，一次可以获得多种方法产物。在提取法中，优选的被选产物和试验产物分别是被选植物提取物(得自于多种植物提取物)和试验植物提取物。
对加工产物，特别是植物提取物所进行的药理学实验可以是体外和/或体内形式的药理学实验。在本发明中，优选进行至少两种体外和至少两种体内的药理学实验。这些实验一般与改变生命体的生物状态有关。所采取的形式既可以是加强机体体质，也可以是有效治疗患者临床状况。增强体质的例子是作为具有加强孱弱体态、镇静作用等的刺激剂。
应该选择那些表现出最佳或最高药理学活性的产物，当采用草本原料时，应优选植物提取物。这对应于最大程度地促进生物状态的改善或使患者产生最理想的临床情况。
在获取试验产物的过程中，例如在对提取方法进行试验时获得的试验提取物，应重复采用与获取被选产物如被选植物提取物所用的相同的条件。实施本发明的方式本发明所述的方法在鉴别、改进和获得草本加工技术(具体地讲，是从植物源中获得药理学活性混合物的提取技术)的重现性或标准化以及获得高药理学活性的植物提取物方面具有最广泛的应用。本发明的重现性和标准化方法涉及将药理学指纹分析法和化学指纹分析法联合应用于被分离的产物(一般得自于提取过程)。化学指纹图谱化学指纹分析法是一种方法，通过这种方法可以对单一化合物或化合物的混合物如草药混合物进行试验，从而获得定性信息，而且在许多情况下也可以获得定量信息，这些信息是所含化学化合物的特征。以适当和特定含量存在的特征组分具有化学唯一性，这种唯一性与该组分的药理学性质有关。在对样本进行化学指纹分析之前或在分析过程中，在对得自于植物源的原料进行指纹分析时所述样本通常是提取物，需对样品进行分离，分离方法包括层析法或电泳法，之后是分析在分离法中洗脱出的化学组分。为了获得被洗脱化学组分的真实化学指纹图谱，可以采用多种检测方法。最适合从草药组合物中分离出化学组分的分离方法是高效液体色谱(HPLC)，并且对被洗脱化合物的特征分析是通过一系列紫外吸收检测法和电喷质谱法进行的。对于化学组分的复杂混合物，如那些在草药制剂中发现的混合物，该分析方法提供了最明确的特征。由指纹分析法获取的数据不但提供了有关草药制剂中化学组分的化学特征信息，而且提供了与样品组合物的真实性、纯度和稠度有关的信息。
对复杂化学混合物(如草药产物)的化学指纹分析法包括使化学混合物的组分溶解，常常包括制备草药产物的可溶性提取物。随后，将溶液或提取液进行分离加工，由此将混合物分离成多组组分，或更优选分离成单一组分。当与化学分析法结合时，这种分离方法能够鉴别且常常是明确鉴别出产物中常见的并且是特征性的重要化学组分。
所用分离方法优选是色谱法，例如高效液体色谱(HPLC)、(凝胶或毛细管)电泳、薄层层析(TLC)和气相色谱法(GC)。为了获得随后可进行药理学评估的样品，优选采用HPLC。在HPLC中，优选的检测系统包括吸收光谱和荧光光谱、折射率、电化学分析法、蒸发光散射法、电喷质谱或它们的混合法。在GC中，经常采用的是电子俘获检测器、钠-磷检测器或质谱检测器。当采用TLC和电泳分离法时，可以采用不同的量热和/或质谱检测法。对于草药产物，采用HPLC与紫外吸收度检测和电喷质谱相结合的方法可以得到吸收度指纹图谱，并且可以给许多吸光性组分的分子量赋值。将柱的洗脱曲线、吸收特性和分子量特征加以综合，可以定性和定量鉴别出草本产物中的各化学成分。
化学指纹分析法通常是将HPLC与吸收度和电喷质谱检测法联合应用。下面将描述对CVT-E001的指纹分析。
简单而言，用适当溶剂提取有关草本产物，常常选用水、醇、乙腈、乙酸乙酯或这些溶剂的混合液作为溶剂(酊剂常常无需进一步加工即可用于分析)。随后过滤提取液以除去所有的颗粒物，干燥除去干扰性溶剂。将提取液冷冻储存直至用于分析试验。分析时将提取物溶解在适当的溶剂中。通常采用含有0.05％三氟乙酸(TFA)的20％乙腈，但这可以根据被测提取物的溶解性而改变。随后将已知量的提取物进样到HPLC仪中(一般测定溶于100ml溶剂的等于或小于1mg的提取物)。HPLC仪可以是多种市售型号中的任意一种，其具有0.01ml-5ml/分钟或更高的流速，而且尽管可以采用等度洗脱系统，但HPLC仪应有能力提供溶剂梯度。通常，利用水、乙腈和TFA的梯度洗脱来分离出草本产物的化学成分。溶剂A是由水或含有少量乙腈(2％-5％)的水和0.05％TFA组成。溶剂B由高浓度的乙腈(70％-95％)和0.05％TFA组成。流速一般为1ml/分钟(也可以采用0.5ml-1.5ml/分钟或其它流速)。采用从少量溶剂A到大量溶剂B的洗脱梯度。为了分离出被选的化学组分，可以改变该梯度。梯度洗脱可例如溶剂A(5％乙腈，0.05％TFA)，溶剂B(70％乙腈，0.05％TFA)；流速1ml/分钟；当时间＝0分钟时，流动相由100％溶剂A组成，当时间＝30分钟时，流动相由100％溶剂B组成。在0-30分钟内所述梯度呈线性变化。在第30-35分钟内，流动相由100％溶剂B组成。在第35-40分钟内，流动相溶剂重新恢复到100％溶剂A，并且在对下一样品分析之前使分离体系重新达到平衡。
虽然HPLC是化学指纹分析的优选试验，但还可以采用TLC、蛋白测定法、碳水化合物测定法、有机提取或其它化学分析法，这些方法是所属领域技术人员所熟知的。
样品分离是在分析高效液相色谱柱(一般内径为4.6mm，长度为25cm)上进行，但也可以采用其它尺寸的色谱柱(例如1mm×25cm)。色谱柱含有任意一种用于分离化学品的填料(反相材料、硅胶、亲水性相互作用材料等)。通常采用含有C8反相材料的反相色谱柱。
对化学物质的检测包括选用上述适当检测器。通常将紫外吸收法和电喷质谱相结合。当含有有关化合物的溶剂从HPLC柱中洗脱出来后，立刻通过紫外吸收检测仪并记录下吸收度，由此获得典型的吸收度分布图(根据有关化学物的吸收特性在多个波长下监测)。经过紫外吸收检测器后，含有有关化合物的溶剂立刻连续进入到电喷质谱检测器中。在分析色谱柱中，一定量的流动溶剂被分流，这是因为电喷装置只能容纳小流量的溶剂(至多50-100ml/分钟)。对于较小的色谱柱，所有流动相可以被允许进入到电喷装置中。在分析色谱柱中，分流过程通常只使10％或更少的流动相进入到电喷装置内，而剩余的90％或更多的流动相则作为含有特殊化合物的馏分被收集并用于后继的药理学评估。进入电喷质谱仪中的化学物如果获取一个质子，它们将成为适合于进行正电式分析的带正电离子(例如某些胺、甾类或黄酮)。这些化学物将能够提供有关其精确化学质量的信息，还可以通过碎裂过程图进行化学鉴别。必须以略微不同的方式测定那些在碱性环境中不是获取而是失去质子的化学物(糖、某些酚和羧酸)。对于没有获取电荷的化学物中，从色谱柱洗脱并通过适当的检测器(例如紫外吸收或折射率检测器)之后收集各馏分。此后将各个馏分干燥并再溶于适当的溶剂(例如含有50％乙腈的水溶液与10％氢氧化铵的混合物)中，直接注射到电喷装置中，该电喷装置以负电方式操作。再次获得有关精确化学质量的信息，并且碎裂过程图提供了进一步的化学鉴别。
综合分析洗脱图形、紫外吸收特性、化学质量和碎裂过程图，可以获得草本产物中所发现的各特征化合物的大量鉴定信息。这些信息告知研究人员样品的特殊化学特征是否可信，而且当与含有已知量被选化合物的标准物质相比时，可以定量估计出被选化合物的含量。如果在分析中存在外来化合物时，还可以获得有关掺杂物的信息。所得信息将提示研究人员所用原料是否含有所需物质、其含量是多少(即质量控制)以及是否可能存在掺杂物。这将能够了解购买的原材料，并且在生产和向用户销售材料时提供质量一致性的证据。化学指纹分析对草本提取物的应用例CVT-E001是一种西洋参(花旗参)的特征提取物。已知它富含多种特殊皂甙和脂肪酸。表1列出了西洋参和其它人参品种中多种皂甙的特征。据说CVT-E001具有刺激胆碱摄取和提高动物模型学习和记忆能力的性质。取两个批次的CVT-E001进行试验且利用连接有紫外吸收检测仪和电喷质谱仪的高效液体色谱(HPLC)获得化学指纹图谱。
表1.西洋参和其它人参品种的皂甙特征
将各10mg的第3批和第4批CVT-E001产物分别溶解在不同的瓶中，瓶内装有1.0ml的含有5％乙腈和0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液。
将含有1mg原料的100ml上述储备液分别安放到HPLC仪上。该色谱系统是由装配有自动进样器和紫外吸收检测器的Hewlett Packard1050梯度HPLC系统构成。色谱柱是Zorbax 300SB-C8反相色谱柱(4.6mm×25cm)。
利用由水、乙腈和TFA组成的梯度洗脱剂实现分离。流动相A是含5％乙腈的水溶液和0.05％TFA作为抗衡离子。流动相B是含70％乙腈的水溶液和0.05％三氟乙酸作为抗衡离子。流速为1.0ml/分钟。当时间＝0分钟时，流动相由100％溶剂A组成，当时间＝30分钟时，流动相由100％溶剂B组成。在0-30分钟内洗脱剂梯度呈线性变化。在第30-35分钟内，流动相由100％溶剂B组成。在第35-40分钟内流动相从100％溶剂B恢复为100％溶剂A。在下一次注射进样前，最少用100％溶剂A洗脱10分钟。在203nm检测紫外吸收度。
采用Fisons Instruments VG的Quatro仪完成电喷质谱。在从紫外吸收检测器中洗脱出来之后，来自HPLC仪的流体被分流并且有2％(20ml/分钟)的流量进入到电喷装置内。对从HPLC仪中洗脱出的化学物以正电性方式对分子量介于200-1200的物质进行检测。多种化学物给出了此产物的质谱特征。
图24和25分别表示第3批和第4批CVT-E001的紫外吸收特征(uv ANOLOG)和总离子数(TIC)。
两个批次几乎具有相同的紫外吸收色谱图，其突出特征是在13.7-13.9分钟之间有一个特征峰，在17.6-19.4分钟之间有5个特征峰，在31.7分钟时有一个特征峰，在33.6分钟处有一个特征峰。许多较低的峰也较明显。7个最相似的峰被标记为1-7。
作为从一个检测仪流至另一检测器的流动相，在紫外信号和质谱信号之间存在约1分钟的延迟。其结果是，第14.90分钟时的总离子计数结果相当于第13.71分钟时的紫外吸收度。下列图谱(附图3-13)表示得自于多个离子计数结果的质谱，它们是在CVT-E001中所发现的化学物的特征。各离子活动是由光谱左上角的数字确定。例如，在图2中，D791 175(14.900)Cm(170∶179)是指色谱展开号D791，其中该光谱的中心位于第14.90分钟时的扫描号175并且得自170-179的混合扫描。
下面列出了与7个主峰的各个峰有关且可以作为鉴别这些峰的质量数。M+H是指分子量加一个质子。
峰1M+H 801，碎片423、440、587、767。被鉴定为人参皂甙Rg1 MW＝800。同时存在的是人参皂甙Re M+H948MW＝947。这些化合物共同用色谱分析且得出混合光谱；峰2M+H 1110，碎片767、486、667、947，被鉴定为人参皂甙Rb1MW＝1109；峰3M+H 1180，碎片899、456、637。被鉴定为人参皂甙RcMW＝1079；峰4无法分辨的质量，其信号被其它组成遮蔽；峰5无法分辨的质量，其信号被其它组成遮蔽；峰6M+H 1151，碎片767、424、529、323。被鉴定为西洋参皂甙R1。它是在美国人参中发现但未在其它西洋参品种中报导的Rb1的乙酰化形式。其结构如下所示。作为西洋参提取物的特征，西洋参皂甙R1的化学结构是
峰7M+H 266。未鉴定。
第33.6分钟处的小峰被鉴定为亚油酸。
为与那些得自于不同CVT-E001样品的光谱分别比较(图14和15)，还提供了纯的人参皂甙Rb1和Rg1的光谱。
当以上述方式分离时，第3批和第4批的CVT-E001各自产生一个特征紫外吸收色谱。电喷质谱明确鉴定了多种通过HPLC分离出的化学物并提供了CVT-E001的特征。从西洋参中得到了两种样品并将其进行化学对比。药理学指纹分析法药理学指纹分析法包括试验一种或多种化合物的样品以测定所用材料是否具有药理学活性。样品的药理学性质或药理学活性取决于所用的具体生物或药理学模型。这些模型应适合测试对个体生态的生物学增强作用或对患者临床病症的有效治疗。所述患者适宜是人体，但也可以是另一种动物如狗、猫、马等。所以，上述药理学试验或指纹分析法包括体内和/或体外生物模型。通常，样品在试验时是作为纯净化合物存在于适当的药学载体和/或溶剂中。在本发明的一个优选实施方案中，样品为草本提取物或草本提取物的色谱馏分。
本发明所用的药理学指纹分析法包括，取原始提取物和得自于上述化学指纹分析法的色谱法且含有有关被分离化学物的被选色谱馏分，对在这些馏分中发现的化学物进行标准化药理学评估。尽管可以进行多不同的药理学评估，但所用评估实验通常局限在那些能够说明被估测化学组分或草本原料预期作用的提示性方法。在本发明中，最优选用至少两种体内和两种体外生物模型进行评估以判断出样品或提取物的生物活性。还优选在各个体外实验中包括至少三种剂量的提取物给药组和一个溶剂对照组。还优选在至少两个模型中，应证明样品溶液或提取液与对照组相比具有明显不同的药理学作用。
所用的生物学或药理学模型很大程度取决于提取物的组分。例如，可以对含有低聚糖的人参提取物进行是否能够刺激免疫系统的评估。两种体外模型包括小鼠或大鼠脾脏的总淋巴细胞生产和抗体产生。两种体内模型包括血清总抗体水平和免疫球蛋白G的水平。对于据称具有抗抑郁活性的产物来说，可以评估其单胺氧化酶A和B的体外抑制能力以及在接受行为试验(accepted behavioral test)(例如小鼠强制游泳试验和自发活动试验)中的抗抑郁作用。采取测量大鼠进食时的体内血压或采取静脉内注射有关提取物并测量体内血管和心脏的收缩力等方法来评估抗高血压模型；对于神经保护剂，可以利用参与氧化应激和神经保护试验的体外或体内酶及底物进行评估。对于抗抑郁药，可以通过其单胺氧化酶抑制程度、对脑内去甲肾上腺素和5-羟色胺水平的提高、对脑内5-羟基吲哚醋酸水平的降低以及在小鼠强制游泳试验和黑白箱试验中的抗抑郁样和抗焦虑样作用进行评估。
在一些模型中，将提取物的活性与一种或多种衍生自该提取物的纯净化合物进行比较。分析所得的结果，以便证实提取物中的混合化合物具有协同作用。由此在增加功效和降低副作用方面，提供所用提取物好于单一化合物的优越性。药理学指纹分析法对草本提取物，CVT-E001的应用实例对具有上述特征化学指纹的化学标准化草本提取物CVT-E001是否在提高记忆力方面具有药理学性质进行评估。对生物模型的选择是基于如下发现(a)在阿耳茨海默氏病(AD)中，中枢神经系统明显缺乏胆碱能体系；(b)已有报导称，在老化大鼠和痴呆患者等中，单胺氧化酶B(MAO-B)的活性有所增高。在生物模型中进行下列实验并获取CVT-E001的药理学指纹结果。在各试验中显示出的阳性结果表明CVT-E001可有效治疗认知和记忆损伤性病症如阿耳茨海默氏病。(1)CVT-E001对大鼠离体脑突触体中胆碱摄取的作用基本原理已证实人参皂甙Rb1能够增加胆碱摄取(Benishin，1992)。神经递质乙酰胆碱生产的降低与记忆丧失和阿耳茨海默氏病有关。已证明Rb1可以增加神经元摄入胆碱并且有可能提高乙酰胆碱的生产，由此减轻记忆损伤。为了确定CVT-E001具有缓减记忆丧失的性能，必须证实CVT-E001能够增强神经组织标本对胆碱摄取。
在Rb1、CVT-E001和HC3的存在下测试从全脑和海马得到的突触体标本的胆碱摄取作用。Rb1是阳性对照物，此前已经证实Rb1能够增加突触体摄入胆碱，而HC3是阴性对照物，已知HC3抑制胆碱摄取。
图1表示不同剂量的Rb1和HC3对大鼠脑突触体胆碱摄取作用的影响。这个初始实验表明，我们采用的突触体标本是可行的，因Rb1促进胆碱摄取而HC3抑制胆碱摄取。这些作用的大小与以前的研究一致。
对于采用Rb1和CVT-E001的实验表明，两种材料均可以使得自于大鼠海马的突触体增加对胆碱的摄入(表2)。当CVT-E001的浓度约为1×10-6M皂苷(分子量为900)时，其在促进胆碱摄取中始终有效。更高的剂量(1×10-5M)并不一定总有效。这种观察结果出乎意料，因为许多药物化合物具有一个最佳的剂量范围，且更多或更少的材料将产生较小的生物活性。表2Rb1和CVT-E001对得自于大鼠海马的突触体摄入胆碱的作用
表中数值是放射性胆碱摄取提高的平均百分比*与对照组存在显著性差异，p＜0.05(ANOVA，Student/Newman/Kuels)表3证明了CVT-E001、总人参皂甙(TS)和Rb1对大鼠脑突触体中胆碱摄取的影响。由于CVT-E001只含有8.1％Rb1、32.4％TS，所以CVT-E001的效价明显高于Rb1或TS的。
表3Rb1、100％总人参皂甙(皂苷，TS)和CVT-E001对大鼠脑突触体中胆碱摄取作用的比较(％对照)Rb1一种从美国人参中分离出的人参皂甙。纯度＞98％。Rb1-52、Rb1-53和Rb1-54代表了Rb1的3个批次TS从美国人参中分离出的总人参皂甙的提取物，其中含有25％Rb1、19.4％Rc1和21.6％Rg1+ReCVT-E001分离自美国人参的提取物，含有8.1％Rb1、32.4％总人参皂甙
>表中数值代表平均值±SE，n＝4，*P＜0.05，**P＜0.01，Student T检验，与对照组比较效能CVT-E001＞TS＞Rb1结果表明，CVT-E001和Rb1明显促进胆碱摄取。虽然CVT-E001只含有8.1％的Rb1，但它仍然表现出相同于或高于相同重量浓度Rb1所具有的有效作用。这表示CVT-E001中的其它物质对Rb1产生协同作用。
(2)3批CVT-E001对鼠脑中MAO-A和MAO-B体外活性的影响表4若干种人参提取物对单胺氧化酶A(MAO-A)和单胺氧化酶B(MAO-B)体外活性的影响
上述数值是平均值±标准误差，它们基于对5个(MAO-A)和4个(MAO-B)的测定。在所有情况中测出显著的剂量依赖型作用。
GLP＝总精油，是在HPLC-UV吸收光谱中在第24-35分钟之间的含有CVT-E001的物质部分。
(3)CVT-E001在Morris水迷宫试验和东茛菪碱诱发性记忆缺失模型中对学习能力的影响原理已证实含有Rb1和Rg1的人参皂甙能够增强学习能力和记忆力。由于CVT-E001是人参皂甙的混合物，所以其可能具有不同于纯皂甙的性质。为了确定CVT-E001是否可以增强学习能力和记忆力，必须证明这种产物能够对科学界接受的学习范例中的任务习得和/或任务记忆产生可测量的增强作用。Morris水迷宫是测试空间学习和记忆的科学证明方式。在该测试中大鼠需要学习寻找昏暗泳池中隐匿平台所在的位置。如果经CVT-E001处理大鼠比未经CVT-E001处理大鼠能更快地找到隐匿平台的位置，那么证明CVT-E001可以增强学习力。CVT-E001对记忆力的作用还可以通过东茛菪碱诱发性痴呆(东茛菪碱干扰胆碱能神经递质体系并妨碍学习和记忆)试验进行验证。如果CVT-E001能够增强学习力和/或记忆力，它应该能够使经东茛菪碱处理的动物提高任务习得和/或保护记忆不受损伤。试验设计本试验设计为，将CVT-E001作为试验化合物利用Morris水迷宫和东茛菪碱诱发性痴呆测定空间学习和记忆能力。该试验的具体目标是测试CVT-E001在东茛菪碱诱发的痴呆条件下是否对新任务习得和/或记忆保留产生影响。试验开始时将大鼠(S/D系雄性大鼠，体重200-250g，约8周龄)分为两组并且在试验期间给予水(0.5ml)或CVT-E001(200mg/kg/天的水溶液，管饲法)。当开始CVT-E001给药后8天时，令大鼠接受学习寻找隐匿在阴暗水池中的平台位置的任务。将大鼠每天在水池中放置4次共5天并且记录下发现平台所花费的时间(最长时间为5分钟)。随着大鼠学会了该任务，所需时间逐渐变短。在第14天时，将两组大鼠进一步分为4组。从开始的两组中各选6只大鼠接受盐水注射，而各起始组中剩余的6只大鼠接受东茛菪碱(2mg/kg)给药，之后要求大鼠发现已移动到新位置的平台(尝试3次，在接受盐水或东茛菪碱注射后的30分钟内最长所需的时间为3分钟)。在第15天时，重复进行第14天的过程，但平台仍然位于第14天所在的位置。第16天，重复第14天的过程，但平台被移动到水池中的相反位置。在第17天时重复第14天的过程，但平台仍然位于第16天所在的位置。在各种情况中记录下找到平台所花费的时间。
该试验每次用24只大鼠且重复2次。综合两个试验中所得的数据。一只CVT-E001处理大鼠死于CVT-E001给药至肺内的事故。一只对照大鼠在学习曲线的最后5天无法发现平台。尽管对结果无显著影响，但将此数据排除在外。一只管饲CVT-E001并注射东茛菪碱的大鼠在最后1天时无法发现平台，也作为异常值被排除。
通过对log换算数据的方差分析来进行统计学分析。根据Newman-Keuls试验进行显著性的后验试验。
在不同的天数内获取各单个试验和混合材料的数据。结果和讨论大鼠很容易习得平台定位的任务，因找到平台所需时间从首次尝试的约200秒缩短至第20次尝试的约8秒(图15)。当所有动物在第14次尝试均已习得任务时，曲线变得平稳。在第5、9和13次尝试(第2、3和4天中的首次尝试)中出现轻微的反弹效果，这表明经夜会使记忆的信息有所丧失。
当大鼠需要在东茛菪碱和CVT-E001存在或不存在的条件下学习寻找平台的新位置时(图16)，所有处理组在开始时均需花费同样长的时间来找到平台(图16，开始的2次尝试)。由于这是新的体验，所以应观察不到差别。在第3次尝试时，只有接受CVT-E001和盐水的动物能够完成习得，而接受东茛菪碱但无CVT-E001给药的动物则无法完成。当综合这天所获得的数据时，没有证据显示有治疗作用(图17)。这提示了在上述环境(对于东茛菪碱诱发的适度记忆损伤，开始短时间习得)下，CVT-E001不对信息的习得产生影响。
当要求大鼠在以后的每天完成相同任务(即，测试动物是否记住了头天所学的任务)时，大鼠在全部尝试中接受东茛菪碱但无CVT-E001给药(图18)。在第2次尝试时，所有处理组任务完成得比接受东茛菪碱而无CVT-E001给药组的动物完成得要好。当将这天的所有尝试进行综合后(图19)，接受东茛菪碱但没接受CVT-E001的动物比其它组的动物具有明显长的潜伏期，这表明东茛菪碱诱发性记忆缺损被CVT-E001的存在所弥补。由于此试验中出现对头天记忆的恢复情况，由此表明CVT-E001可以防止长期记忆整合的缺损而不是短期信息的习得。
当大鼠再次被要求学习寻找新的平台位置时，处理组之间不存在初始差异(图20，第1次尝试)。然而，直至第3次尝试，经东茛菪碱处理动物被证实出现东茛菪碱诱发性学习缺损。当综合由这天开始的每次尝试所得的数据时，各处理组之间没有显著性差异(图21)，这再次表明CVT-E001和适度东茛菪碱诱发性痴呆在短时间内作用很小。
随后，当大鼠在试验的最后一天被要求记住平台的最终位置时，东茛菪碱诱发性缺损立刻变得很明显(图22)。在当天的首次尝试中，接受东茛菪碱但无CVT-E001给药的动物的能力明显减弱，这表明丧失了长期记忆。这种痴呆在同时接受CVT-E001和东茛菪碱给药的动物中则完全没有出现，并且这些动物与未接受东茛菪碱的动物一样能够完成任务。当综合从这天开始的每次尝试所得的数据时(图23)，证明接受东茛菪碱但未受CVT-E001预处理的动物出现学习缺损。接受CVT-E001和东茛菪碱的动物与空白对照没有差别，这表明CVT-E001彻底消除了东茛菪碱诱发的学习缺损。当与未接受东茛菪碱或CVT-E001给药的动物相比时，接受CVT-001但无东茛菪碱给药的动物未显示出有益效果。
CVT-E001是人参皂甙的混合物，当它作为食品强化剂提供给大鼠时，可以预防东茛菪碱诱发性记忆缺损。这种作用只有在记忆损伤动物中才存在，也就是CVT-E001似乎无法提高无记忆缺损动物的学习力和记忆力。CVT-E001的作用似乎不包括信息习得和短期记忆，但包括长期记忆整合，这是因为已证实当要求动物回忆起24小时前所学任务时，CVT-E001具有最大作用。由于已知东茛菪碱可以损伤胆碱能体系，上述研究表示CVT-E001有益于一些病症，例如胆碱能体系被损伤且空间记忆力缺失的阿耳茨海默氏病。
(4)CVT-E001(记忆-FX)在人类个体中的记忆试验方法采用记忆商数测定表。共进行5项测试。
A直接记忆在告知24个单词后，要求受试者按照类别重复单词，例如蔬菜类。
B配对联想记忆在告知受试者12对单词后，重复出每对的第一个单词，受试者被要求说出剩下的配对单词。一些配对单词彼此相关，例如上-下和太阳-月亮。一些配对单词完全无关，例如马-灯等等。
C图画的自由回忆在展示15张图画后，要求受试者回忆其所看过的图画。
D识别无意义的图形首先将20张无意义的曲线图形展示给受试者，随后展示另外的20张且其中半数是先前展示过的图形。随后要求受试者指出那张是先前曾看过的图形。
E回忆肖像的关系给受试者展示6幅肖像，每幅肖像注有人物的姓氏、职业和嗜好，例如，姓张，教师，爱好看电视。片刻后，以不同的顺序重新展示肖像。要求受试者回忆每幅肖像。
对各试验评分并计算出各受试者的得分之和作为记忆力商数。每位受试者接受2次测试，并且分别是在给予“记忆-FX”或空白对照食物之前和之后进行测试。对各受试者进行体检，分别在给予“记忆-FX”或空白对照食物之前和之后各1次。进行体检是为了确保“记忆-FX”给药无副作用。
年轻组10名大学生，5男5女，20-24岁之间，每天给予两个胶囊(200mg/胶囊)的“记忆-FX”共13天。年轻对照组是由12人组成(9男3女)。老年组，46-64岁，每天给予两个胶囊(200mg/胶囊)的“记忆-FX”共14天。老年对照组是由5人组成(3男2女)，年龄40-65岁。
统计学
T-试验组用来比较对照组和试验组。
结果对各试验评分且计算出各受试者得分值之和作为MQ(记忆力商数)。每名受试者接受2次测试，分别在给予空白对照食物或“记忆-FX”之前和之后各1次。
表5年轻组和老年组摄取“记忆-FX”前后的MO年轻组 老年组给药前给药后给药前给药后1113.5 138 91982130 138 105 103.53127 135 97.5 1294124 131 931135118 131.5 96906119 135 951097116 130 107 1158118 133 105 1309106 124 123 13610 114 127 114 109MQ是由评分值按照一个公式计算的且被划分为7个级别。MQ＞130是第1级—优秀以上；129-120是第2级-优秀；119-110，良好 109-90，中等89-80，一般；79-70，不良69-60，低下。
表6年轻人的MQ差别对照组 记忆-FX给药组人数 12 10试验A3.8±3.23.9±3.1试验B1.9±4.74.2±3.8试验C3.2±5.53.8±5.1试验D-3.0±5.6 3.2±3.3**试验E-0.7±4.1 1.7±2.9加和 5.3±11.4 18.8±7.4**MQ 3.7±8.113.7±5.3**平均SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比。试验A-E中的数值代表摄取“记忆-FX”前后之间的分数差别表7老年组的MQ差异对照组 记忆-FX给药组人数 510试验A2.6±2.4 6.4±5.0试验B-0.3±2.15.2±3.6**试验C2.8±2.4 -1.3±5.0试验D-7.3±4.93.2±3.7**试验E-4.8±6.4-2.2±5.9加和 -6.6±9.712.6±15.3*MQ -5.6±8.410.5±12.8*平均SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比。
试验A-E中的数值代表摄取“记忆-FX”前后之间的分数差别结论(1)表5显示，除了第2人之外，其它9名受试者的MQ均有提高。第5名受试者提高了2个级别。在老龄组中，5人(第3、4、7、8和9名)显示出MQ级别的提高。其中1人(第8名)提高了2级。但有1人(第10名)的MQ降了一级，其它4人(1、2、5和6名)维持原有级别(虽然有轻微改变)。
(2)表6和表7表明，两个试验组的MQ与对照组相比具有显著性差异。在年轻组的试验D中存在差异，在老年组的试验B和试验D中存在差异。试验B是一种测试语言能力的试验，语言能力是受大脑左半球支配。而试验D是绘图试验，不是描述能力试验，绘图能力是由大脑的右半球支配。结果表明，“记忆-FX”能够主要影响大脑的左半球，但它在老年组中影响整个大脑。
试验A和B测试的是大脑的言语(左)半球，但试验D测试的是非语言的右半球。试验C和E测试大脑的左、右两个半球。
图15每天(第8-13天)饲喂水(0.5ml)或CVT-E001(200mg/kg，0.5ml溶液)的大鼠的学习曲线。在5天内大鼠需学习确定位于水池中心的隐匿平台的位置。大鼠每天进行4次尝试。所得数值是基于35或36次尝试时的平均值±平均值的标准误差。经证实没有显著的治疗作用。
图16大鼠学习确定第1个新的隐匿平台位置(第14天)的潜伏期。大鼠被分为4组。第1组(C/Scop)只接受水作为食物强化剂并在尝试前15分钟时注射东茛菪碱(2mg/kg)。第2组(HT/Scop)接受CVT-E001(200mg/kg/天)作为食物强化剂并在尝试前15分钟时注射东茛菪碱(2mg/kg)。第3组(C/Sal)只接受水作为食物强化剂并在尝试前15分钟时注射盐水(0.2ml)。第4组(HT/Sal)只接受CVT-E001作为食物强化剂并在尝试前15分钟时注射盐水(0.2ml)。*与C/Sop相比存在显著性差异，p＜0.05。
图17三次尝试中的大鼠学习确定隐匿平台第1个新位置的潜伏期(第14天)的综合数据。处理过程与图16的相同。所得数值是基于33或36次尝试时的平均值±平均值的标准误差。经证实没有显著的治疗作用。
图18大鼠记忆隐匿平台第1个新位置的潜伏期(第1 5天)。处理过程与图16的相同。所得数值是基于11或12次尝试时的平均值±平均值的标准误差。*与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.05。**与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.01。
图19三次尝试中的大鼠记忆隐匿平台第1个新位置的潜伏期(第15天)的综合数据。处理过程与图16的相同。所得数值是基于33或36次尝试时的平均值±平均值的标准误差。*与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.05。**与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.01。***存在显著性差异，与C/Sop相比p＜0.05并且与HT/Scop相比p＜0.05。
图20大鼠学习寻找隐匿平台第2个新位置的潜伏期(第16天)。处理过程与图16的相同。所得数值是基于11或12次尝试时的平均值±平均值的标准误差。*存在显著性差异，与C/Sop和HT/Scop相比p＜0.05。
图21三次尝试中的大鼠学习寻找隐匿平台第2个新位置的潜伏期(第16天)的综合数据。处理过程与图16的相同。所得数值是基于33或36次尝试时的平均值±平均值的标准误差。经证实无显著性差异。
图22大鼠记忆隐匿平台第2个新位置的潜伏期(第17天)。处理过程与图16的相同。所得数值是基于11或12次尝试时的平均值±平均值的标准误差。*与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.05。
图23三次尝试中的大鼠记忆隐匿平台第2个新位置的潜伏期(第17天)的综合数据。处理过程与图16的相同。所得数值是基于33或36次尝试时的平均值±平均值的标准误差。*与C/Sop相比存在显著性差异p＜0.01。
HT-1001对体外PC12培养物和成神经细胞瘤N1E-115细胞系中的轴突突起(Neurite outgrowth)的刺激作用。介绍我们已经发现了HT-1001的新作用机理，该机理是HT-1001刺激PC12(嗜铬细胞瘤)细胞系中的轴突突起。结果表明，HT-1001不但起缓解综合征的作用，而且还起改变神经变性疾病的进程的作用。HT-1001的有益(预防/治疗)作用适用于退化性疾病如老年性痴呆、帕金森氏病、多发性梗塞痴呆等。
有报导称人参皂甙对中枢神经系统具有多种作用。其中包括CNS兴奋或抑制作用、抗惊厥活性、抗精神病作用、镇痛作用、抗疲劳和抗紧张作用以及改善多种记忆功能的性能(Takagi K.等人，《日本药理学杂志》(Japan.J.Pharmacol.)，22339(1972)；Satio H.andNabata H.，《日本药理学杂志》，22245(1972)；Saita H.等人，《日本药理学杂志》，2343(1973)；Takagi等人，《日本药理学杂志》，2441(1974)；Saito等人；《日本药理学杂志》，24119(1974)；Saito H.等人；《日本药理学杂志》，27509(1977)；Hong S.A.，《韩国药理学杂志》101(1974))。已知纯人参皂甙Rb1和Rg1可以提高试验动物的记忆力(Saito H.，“中草药原料研究的进展”，Chang H.M.等人编辑，World Sci.Publ.新加坡，1985，P509；Saito H.，“人参研究的最新进展”，Shibata S.编辑，HirokawaPubl.Col，东京，1990，P99；Benishin C.G.等人，《药理学》(Pharmacology)42223(1991))并且其作用机理被确定是作用于脑内胆碱能神经递质。除公开了Rb/Rg1的行为作用之外，还发现人参皂甙Rb1和Rd(另一种人参皂甙)通过神经生长因子(NGF)增强背侧和交感神经节的轴突突起(Saito H.，“中草药原料研究的进展”，Chang H.M.等人编辑，World Sci.Publ.新加坡，1985，P509)，但对生长因子本身没有影响。迄今为止，很少有关于这种增强作用的细胞机理的信息。至今，仍然没有公开过Rb1或其它任何皂甙对轴突突起作用的研究。最新报导已证实人参的“亲脂性”提取物还具有神经营养作用(Mohri T.等人《植物医学》(Planta Med.)58321(1992))，但是，该提取物的活性成分仍有待阐明。
NGF是在二十世纪五十年代被首次发现的，它是一种原型神经营养蛋白。NGF具有许多与神经通路的发育和维持有关的作用。而且，业已有人对上述生物作用作了回顾(Levi-Montalcini R.《科学》(Science)，2371154(1987)，Levi A.and Alema S.《药理学、毒理学研究纪事》(Ann.Re.Pharmacol.Toxicol.)31205(1991))。外周NGF是肾上腺素能交感神经元和初级感觉神经元在发育过程中存活所必需的。它影响着体感纤维在发育期间(Hefti F.等人，《神经生物学和老化》(Neurobiol.Aging)1075(1989))和成年受到损伤后(Raivich G andKreutzberg G.W.，《国际神经科学进展杂志》(Int.J.Devel.Neurosci.)11311，1993)的生长和神经元回路。在脑中，NGF促进颅底前脑胆碱能神经元的存活(Martin等人，《细胞生物学杂志》(J.CellBiol.)106829(1988)；Mobley W.C.等人，Mol.Brain.Res.153(1986))，并且防止在后继损伤中失去此类神经元(Hagg.T等人，《脑研究》(BrainRes.)50529(1989)；Tuszynski M.H.等人，《神经病学纪事》(Ann Neurol.)30625(1991))。也有报导称NGF可以促进神经元前体细胞的分化(Hartikka J.and Hefti F.J.，《神经学研究》(Neurosci.Res.)21352(1988))。PC12细胞通过轴突突起和电兴奋性(Green L.A.等人，《细胞学和神经生物学进展》(Adv.Cell.Neurobiol.)3373(1982))以及其它性质对NGF的处理产生反应。现在，对用于治疗多种退化性疾病的神经营养因子的设计和开发正在活跃地进行着(Hefti F.J.，《神经生物学》(Neurobiol.)251418(1994)；Tonnaer JADM and Dekker AJAM，发表在《抗痴呆药物学会》上(1994)，第139页)。
阿耳茨海默氏病(AD)与胆碱能神经束的退化有关，其中包括从颅底前脑突起到皮层和海马的神经束。PC12细胞系(Greene L.A.andTischlerA.S.，《细胞学和神经病学进展》(Ad.CellNeurol.)3373(1982))是一种研究上述神经束机能的模型。该细胞系是原型嗜铬细胞系，但可以被诱发来表达肾上腺素能神经递质(Greene L.A.and Tischler A.S.《美国国家科学院院报》(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA)732424(1976)；Aloe L and Levi-Montalicini R.，《美国国家科学院院报》761246(1979))，和胆碱能标识物(Greene L.A.and Relin G.，《脑研究》(Brain Res.)138521(1977)；Ritchie A.K.，《生理学杂志》(J.Physiol)(伦敦)286541(1979)；Schubert D.等人，《美国国家科学院院报》(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA)742579(1977)；Jumblatt J.E.and Tischler A.S.，《自然》(Nature)297152(1982))。该模型的优点在于(Shibata S.等人，《经济型和治疗性植物的研究》(Economic and Medicinal Plant Res.)1；217(1985))它是不灭化细胞系(Saito H.《中草药原料研究的进展》ChangH.M.等人编辑，World Sci.Publ.新加坡，1985，509页)，该细胞系的存活对于NGF敏感但不依赖于NGF(Saito H.，公开在《人参研究的最新进展》，Shibata S.编辑，Hirokawa Publ.Co.Tokyo 1990，P99)，这种细胞系有许多与颅底前脑的中枢胆碱能神经元相同的性质。已发现，PC12细胞并不对所有中枢胆碱能神经元反应性营养因子敏感，但中枢胆碱能神经元却对所有PC12细胞反应性营养因子产生反应。因此，PC12细胞系可以被认为是理想的模型系统，该系统似乎不会产生假的阳性结果，但可能会出现假的阴性结果，即，它可能会遗漏对中枢胆碱能神经元起作用的营养因子。
已报导PC12细胞通过多种途径对NGF产生应答，其中包括但不限于以下途径膜兴奋性的发展，细胞骨架结构的合成、装配和稳定化，提高细胞粘着性，过度生长和提高合成作用；减少DNA合成和细胞增殖(Werrback-Perez K.等人，《脑研究进展》(Prog.Brain Res.)86183(1990))；选择性诱导的抗氧剂(例如过氧化氢酶)和能量代谢酶(Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.，《修复神经病学的最新成果》(Recent Achievements in Restorative Neurology)30321(1985)；Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.《神经的发育和再生》(NeuralDevelopment and Regeneration)；Sringer-Verlag，Heidelberg，339(1987)；Perez-Polo J.R.and Werback-Perez K.《神经系统的再生》(Nervous System regeneration)，Alan Liss，New York，201(1988))；刺激胆碱能神经递质的代谢(例如CHAT活性)(Greene L.A.and Rein G.，《脑研究》(Brain Res.)138521(1977)；Ritchie A.K.《生理学杂志》(伦敦)286541(1979)；Schubert D.等人，《美国国家科学院院报》742579(1977)；Jumblatt J.E.and Tischier A.S.，《自然》(Nature)297152(1982))；改变基因表达(Szebereni J.and Erhardt P.，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1222187(1994)；增加轴突突起(Greene L.A.and Tischler A.S.《美国国家科学院院报》732424(1976)；提高表面膜受体的表达(Greene LA and Tischler AS，《细胞神经病学进展》(Adv.Cell Neurol.)3；373(1982)；提高APP-695的表达(这对阿耳茨海默氏病的病因很重要)(Schubert D.等人，《神经元》(Neuron)3689(1989))；提高ω-CgTx敏感Ca2+通道的表达(UsowiczM.M.等人，《生理学杂志》(伦敦)42695(1990))；提高ζ-PKC的表达并且向下调节其它同种型PKC以增强轴突突起(Coleman E.S.andWooten M.W.，《分子神经学杂志》(J.Mol.Neurosci.)539(1994))。由于PC12细胞对NGF产生不同的反应，它们是研究其它物质的NGF样性质的适当候选物。它支持了认为这些细胞是颅底前脑中枢胆碱能神经元的良好模型的看法。
成神经细胞瘤N1E-115是未分化的鼠成神经细胞瘤，它可用于研究神经营养活性。材料和方法将PC12细胞接种并保存于100cm2组织培养皿内的37℃RRMI1640中，其中，水中含有1％抗生素、10％热灭活马血清和5％胎牛血清并被95％空气和5％ CO2饱和。N1E-115细胞被保存在含有90％ DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基，Gibco，Grand Island，NYUSA)和10％FBS和抗生素PNS(青霉素、新霉素、链霉素)的烧瓶中。将培养平板保存在温控(37℃)加湿气氛(由95％空气和5％CO2组成)下。为了试验，用Pasteur移液管通过有力吸入细胞使其机械性移位并置于35mm的以胶原涂敷的组织培养皿中，皿内含有共2.0ml完全培养基，密度为1×104细胞/ml。每周更换3次培养基。
通过对含有的PC12细胞数进行计数而测定出对神经生长因子(NGF)和样品的细胞反应。在处理后的第7天和第14天时拍摄细胞照片。在显影和印刷之前在某个培养皿中选择两个区域。
对细胞和轴突的评分如下将呈环状或球形且无轴突突起的细胞评为0分(S0)；将变长或具有短轴突突起的细胞评为S1；将胞体上具有两个以上的小轴突的细胞被评为S2；将具有一个或两个轴突且轴突的长度至少是胞体直径的两倍的细胞被评为S3；将具有两个以上的长轴突的细胞被评为S4；轴突指数计算如下轴突指数(In)＝总轴突评分(∑S)/总细胞数∑N)∑S＝S1*N+S2*N+S3*N+S4*N N是各细胞域内的细胞数。
试验结果1.NGF在处理7天后以剂量依赖方式增加PC12中的轴突突起(图26)。
2.HT-1001在处理7天后以剂量依赖方式增加PC12中的轴突突起(图27)。
3.HT-1001在处理7天后以剂量依赖方式增加N1E-115中的轴突突起(图28)。图29和图30分别是对照细胞和经处理细胞的原始照片。在对照组中观察到没有或很小的轴突突起，但在经处理细胞中发现明显的轴突突起。结论HT-1001在刺激PC12和N1E-115细胞系的轴突突起中诱发NGF样作用。这可能归因于其在治疗和预防神经变性疾病中的有益作用。
权利要求
1.一种获得作为从植物中提取化学组分的药理活性混合物的标准化过程的可再现提取过程的方法，该方法包括(a)以多种不同的提取方法从植物中提取出多种化学组分的药理学活性混合物，得到多种提取物；(b)对各个提取物进行至少两种体外的和至少两种体内的药理学试验，从而获得步骤(a)所得各提取物的药理学活性的生物指纹图谱，其中已知各试验与有效治疗患者临床病症有关；(c)从上述多种提取物中选择出在步骤(b)中显示出最佳药理学活性的提取物；(d)至少重复一次用于制备步骤(c)的被选提取物的提取过程，以制得至少一种试验提取物；(e)(1)通过辨别各提取物中的药理活性混合物中的化学组分的特征和相对含量，获得被选提取物和上述至少一种试验提取物的化学指纹图谱；和(2)对上述至少一种试验提取物重复所述的步骤(b)；和(f)比较被选提取物和上述至少一种试验提取物的化学指纹图谱和生物指纹图谱，其中当上述至少一种试验提取物中的化学组分的含量比被选提取物中的相同化学组分的含量至多多或少10％时，和当上述至少一种试验提取物的各药理学试验结果比被选提取物的相应药理学试验结果至多高或低10％时，选择用于制备被选提取物的提取过程作为由植物中制备化学组分的药理活性混合物的标准化方法。
2.一种从衍生自植物源的化学组分的药理学活性混合物获得可再现的和高度的药理学活性的方法，该方法包括(a)对来自相同植物源的多个样品实施多种不同的提取过程以制得多种植物提取物；(b)对各植物提取物进行至少一个与改变生命体的生物状态有关的药理学试验；(c)选择出在步骤(b)中显示出最高药理学活性的植物提取物；(d)重复进行用于制备步骤(c)的被选提取物的提取过程以制得试验提取物；(e)获得被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱，所述化学指纹图谱至少提供了有关被选提取物和试验提取物中的化学组分的定性信息；(f)对试验提取物重复步骤(b)的试验；和(g)比较被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱和药理学活性，这样当试验提取物中的一种或多种化学组分以一定量存在且该量与被选提取物的相应药理学试验活性的差别不超过约±10％时，那么用于制备被选提取物的提取过程被选择作为由植物源中制备化学组分的药理活性混合物的标准化提取方法。
3.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种药理学试验是至少一种体外和体内的药理学试验。
4.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种药理学试验是至少两种体外和至少两种体内药理学试验。
5.权利要求2所述的方法，其中所述改变生命体的生物状态是有效治疗患者的临床病症。
6.权利要求2所述的方法，其中所述至少提供定性信息包括提供定性和定量信息。
7.权利要求5所述的方法，其中所述患者是人。
8.一种获得化学组分的药理学活性混合物的方法，所述混合物具有衍生自植物源的高再现药理学活性，该方法包括(a)对得自相同植物源的多个样品进行多种不同的提取过程以制得多种植物提取物；(b)对各植物提取物进行至少两种体外和至少两种体内的药理学试验，已知所述药理学试验与有效治疗患者临床病症有关；(c)选择出在步骤(b)中显示出最高药理学活性的植物提取物；(d)重复进行用于制备步骤(c)的被选提取物所采用的提取过程，从而制得试验提取物；(e)获得被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱，这些化学图谱提供有关于被选提取物和试验提取物中化学组分的定性和定量信息中的至少一种；(f)对试验提取物重复步骤(b)的试验；和(g)比较被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱和生物学活性，这样当试验提取物中的一种或多种化学组分以一定量存在且该量与被选提取物的相应药理学活性的差别不超过约±10％时，那么用于制备被选提取物的提取过程被选择作为制备具有高再现药理学活性的化学组分的药理活性混合物的标准化提取方法。
9.一种衍生自植物源的化学组分的药理学活性混合物，该混合物具有可再现的和高度的药理学活性，该混合物由包括下列步骤的方法制备得到(a)对得自相同植物源的多个样品进行多种不同的提取过程以制得多种植物提取物；(b)对各植物提取物进行至少一种已知与改变生命体的生物状态有关的药理学试验；(c)选择出在步骤(b)中显示出最高药理学活性的植物提取物；(d)重复进行用于制备步骤(c)的被选提取物所采用的提取过程，从而制得试验提取物；(e)获得被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱，这些化学指纹图谱至少提供了有关被选提取物和试验提取物中化学组分的定性信息；(f)对试验提取物重复步骤(b)的试验；和(g)比较被选提取物和试验提取物的化学指纹图谱和药理学活性，这样当试验提取物中的一种或多种化学组分以一定量存在且该量与被选提取物的相应药理学试验活性的差别不超过约±10％时，那么用于制备被选提取物的提取过程被选择作为从植物源制备化学组分的药理活性混合物的标准化提取方法。
全文摘要
本发明涉及一种确保草本提取物的化学和药理学标准化的方法。
文档编号A61P25/28GK1268027SQ98808588
公开日2000年9月27日 申请日期1998年8月28日 优先权日1997年8月28日
发明者彼得·K·T·庞, 杰奎琳·J·单, 卡姆·W·丘 申请人:Cv技术公司