专利名称：三氧化二砷制剂生产法及用三氧化二砷或米拉索普治癌法的制作方法
1．发明领域本发明涉及治疗白血病、淋巴瘤以及某些其它癌症的方法和组合物。
更具体地说，本发明涉及新颖地应用三氧化二砷和有机砷的化合物来治疗急慢性白血病。
2．发明背景2．1．癌癌的特征主要是从给定正常组织衍生出来的反常细胞的数量增长、这些反常细胞侵入附近组织、以及由淋巴液或血液携带扩散到区域内淋巴结和远方部位(转移)。临床资料和分子生物学研究指出，癌是一个多阶段的过程，它一开始是少量的肿瘤前变化，在一定条件下这些变化会行进到肿瘤形成。
在肿瘤损害形成前，先有恶性前反常细胞的生长，例如增生、变形和发育异常(回顾这样的反常生长情况，请参阅Robbins和Angell著《基础病理学》一书1976年第二版68～79页，该书由费城W．B．Saunders公司出版)。肿瘤损害可克隆生长成硬质肿瘤(Solidtumor)，并开发出日益增大的容量供其侵入、生长、转移和异质化，特别是在肿瘤细胞逃过宿主免疫监视的条件下是如此(Roitt，I．，Brostoff，J．和Kale，D．，免疫学，1993年第3版17．1～17．12页，Mosby，St．Louis)。
白血病是指造血组织的恶性肿瘤。转变成恶性典型地是在单细胞中通过两个或更多步骤发生，随后则增生并克隆扩增。在一些白血病中，已经由一贯的(consistent)白血病细胞形态和特殊的临床特征辨识出了特异的染色体易位(例如，慢性髓细胞白血病的易位数为9和22，而急性前髓细胞白血病的易位数为15和17)。急性白血病占优势的是未分化的细胞群体，而慢性白血病占优势的是更成熟的细胞形态。
急性白血病可分为成淋巴细胞型(ALL)和非成淋巴细胞型(ANLL)。急性白血病还可根据法-美-英(FAB)分类法或根据其类型和分化程度按照它们的形态和细胞化学表象来进一步细分。使用特异性的B-和T-细胞和骨髓抗原单克隆抗体来进行分类是最有帮助的。ALL大多数是儿童期发病，借助于化验发现和骨髓检查来确立。ANLL也称为急性成髓细胞白血病(AML)，在所有年龄段均可发病，是成年人较普通的急性白血病，该病常以扩散为起因。
慢性白血病被描述为淋巴细胞性(CLL)或髓细胞性(CML)的白血病。CLL的特征是在血液、骨髓和淋巴系统器官中出现成熟的淋巴细胞。CLL的标志是持续的、绝对的淋巴细胞增多(＞5000/μL)以及在骨髓中淋巴细胞增多。多数CLL患者还具有淋巴细胞的B-细胞克隆扩增的特征。CLL是老年人的疾病。CML的特征是所有分化阶段的粒性白细胞在血液、骨髓、肝、肾和其它器官中占优势。在根据症状诊断出的病人中，WBC的总计数常约为200，000/μL，还可高达1，000，000/μL。CML由于存在有费城染色体，因而是比较容易诊断的。
造血性癌的性质本身使得采用全身化学疗法作为主要治疗形式成为必要。根据特定白血病的敏感性而选用的药物通常是复合剂。放射疗法可作为辅助手段用来处理局部集聚的白血病细胞。外科手术很少需要作为主要的治疗方式，但可用来对付某些并发症。从HLA适配的同胞兄弟姐妹作骨髓移值有时是需要的。
2．2．砷及其药用长久以来，在西方和中国的医药实践中部把砷看作既是毒物又是药物。在十九世纪晚期，西方常试用砷来治疗血液病。在1878年曾有报告说，用福勒溶液(一种含有亚砷酸钾的+5价溶液)治疗白血病患者可明显减少白血细胞计数(见Cutler和Bradford，美国医药科学杂志，1878年1月号，81～84页)。更有兴趣的是1931年由Forkner和Scott所描述的用福勒溶液作为姑息剂来治疗慢性骨髓性白血病(CML)(美国医药协会杂志，1931，ⅲ，97页)，稍后在1936年又被Stephens和Lawrence所证实(国际医药年会，9，1488～1502页)。但是，福勒溶液的活性化学组分尚未确定，它的毒性是被广泛承认的。福勒溶液严格地作为口服组合物给药，并以溶液的形式给白血病患者服用，直到白血细胞的水平被压低到可接受的水平或者直到毒性(例如皮肤角化和色素沉着过多)发作，使患者享受或长或短的缓解期。在六十年代，偶然仍有试用福勒溶液治疗CML的，但多数CML患者都是被用另外的化学治疗剂来治疗，例如用白血福恩和/或放疗(见Monfardini等着，癌，1973，31492-501页)。
自相矛盾地，长期以来认识到，暴露于环境中的或药物中的砷的效应之一是皮肤癌(Hutchinson，1888，伦敦病理学会会报(Trans．Path．Soc．Lond．)，39352页；Neubauer，1947，Br．J．癌，1192页)。甚至有流行病资料称，长期服用福勒溶液会导致体内部位癌症发病率提高(Cuzick等著，Br．J．癌，1982，45904～911页；Kaspar等，美国医药协会杂志，1984，2523407～3408页)。从此，砷的致癌力已被下面的事实展现出来它能诱导染色体畸变、基因增殖、组妹染色单体变化和细胞变形(见例如Lee等著1988版科学一书，24179～81页；以及Germolec等著毒理学应用药理学一书，1996年141308～318页)。由于砷有众所周知的致癌作用，现在在西方医药中砷对人的仅有治疗应用是用来治疗热带病如非洲锥虫病(有机砷剂、米拉索普；见Goodman和Gilman著治疗学的药理基础一书第9版，第66章，1659～1662页，1997)。
在传统中药中，亚砷酸或三氧化二砷糊剂已被用来治疗牙髓病、牛皮癣、梅毒和风温病(Chen等，1995，载临床药物手册，中国上海，上海科技学院，P．830)。在中国，在七十年代曾试验性地用三氧化二砷来治疗急性前髓细胞白血病(APL)(由Mervis在1996年的科学一书作过评注，273578页)。三氧化二砷对顽固性APL的临床效验最近被重新研究，在15个患有此病的14人中作了试验，使用10mg/d的静脉内剂量4-9周后，结果是在不伴用骨髓抑制的情况下取得完全形态学缓解(Chen等，1997，血液，893354～3360页)。研究还显示出，三氧化二砷在体外会诱发NB4细胞即APL细胞系的凋亡(细胞按计划死亡)，以及凋亡明显地与bc1-2致肿瘤基因的下调(downregulation)和嵌合体的PML/RARα蛋白在细胞内的重新分配有联系，这种蛋白是APL细胞所独有的(Chen等，1996，血液，881052～1061页；Andre等，1996，实验性细胞研究(Exp．Cell Res．)229253～260页)。已有报告说，砷的生物学活性是由于砷能把PML的核质部分导入核使之降解(Zhu等，1997，国家科学院会议录(proc．Natl．Acad．Sci)，943978～3983)。
虽然众所周知砷既是毒物又是致癌剂，但已有很多关于用砷作药物治疗的报告。另外，从上述讨论中应能清楚，白血病有多种不同的类型，其中每种类型都要求一个独特的治疗方案，该方案需根据预计有治疗失败危险的征候出现而进行改进。因此，开发出一种可单独使用或与其它现有药物结合使用的抗白血病药是极其需要的。
3．发明概述虽然在本技术领域中关于给患者服用砷的益处和危险有着互相抵触的报告，但是本申请人却发现，三氧化二砷、有机砷剂和米拉索普在治疗各种类型的白血病、淋巴瘤和硬质肿瘤方面有着广泛的适用性。
在此所描述的本发明涵盖治疗白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤的方法，包括给予需要这种治疗的人以治疗有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普。如上所述，本发明还涵盖用结合疗法来治疗白血病，特别是抗拒其它治疗方式的那些白血病。
本发明还涵盖生产含有三氧化二砷的药用组合物的方法。
按照本发明，三氧化二砷或米拉索普化合物可单独地或与其它已知的治疗方剂(包括化学治疗剂、放射防护药和放射疗法)或技术结合起来，用来或是改善病人的生活质量、或是治疗白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤。在服用一种或一种以上化学治疗剂、包括抗癌剂以前、正在服用或服用以后，均可使用砷化物。此外，在放射治疗前、治疗中或治疗后，均可使用砷化物。
本发明的药用组合物是适用于静脉内注射或输注的消毒溶液。在另一实施方案中，本发明涵盖一种适于口服的组合物；其中含有三氧化二砷或米拉索普以及在药用上可接受的赋形剂或载体。在另一实施方案中，本发明还包括适于皮肤表面或透过皮肤用的组合物，透过皮肤的方法包括但不限于离子电渗疗法。本发明还提供出特效的治疗方案、药用组合物和成套药包。
下面将在各章节描述本发明的特种组合物及其应用。
4．发明详述这里描述的是治疗白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤的方法和组合物。本发明提供出治疗人的急性或慢性白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤的方法，它包括给予需要这种冶疗的人以治疗有效而非致死量的一种或一种以上的砷化物、如三氧化二砷或米拉索普。
本发明还包括治疗抗拒其它治疗方式的人的白血病的方法，它包括给予此人结合有其它化学治疗剂如全反维生素A酸(ATRA)的三氧化二砷或米拉索普。
本发明还涉及制造含有三氧化二砷的药用组合物的方法。本发明的药用组合物优选是表达出毒性较低、功效改善、贮藏和使用稳定性改善的组合剂，而且该组合物具有生理上能接受的pH值。
4．1．砷化物在此“砷化物”一词是指三氧化二砷(As2O3)或米拉索普在药用上可接受的形式。米拉索普是一种有机砷化物，它可由氧化蜜胺胂与二巯基丙醇复合的办法来合成，也可从市场购得(Arsobal_由Rh_nePoulenc Rorer提供，宾夕法尼亚州Colle-geville)。由于本发明的非药用制剂的原料是大家熟知的，这些原料可用本技术领域大家熟知的化学技术来制备(例如可见Kitk-Othmer，化学工艺技术百科全书，第4版，卷3，第633～655页，John Wiley ＆ Sons)。
在此，名词“治疗剂”、“治疗方案”、“放射防护药”、“化学治疗”是指用来治疗癌症、病毒感染和恶性肿瘤的本领域技术人员熟知的普通药物和药物疗法，包括疫苗。“放射治疗”剂是本领域人员所熟知的。
按照本发明，三氧化二砷或米拉索普化合物可单独地或与其它已知的治疗剂(包括化学治疗、放射防护药和放射治疗)或技术结合使用以便或是改善患者的生活质量，或是治疗白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤。例如，砷化物可在一种或一种以上抗癌剂使用前、使用中或使用后加以使用，抗癌剂包括但不限于下列各种芥子化合物，氮芥，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，环磷酰胺，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟漂呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，5-氟脱氧尿苷，氨甲喋呤，长春花新碱，长春花碱，紫杉酚，依托泊苷，太米泊苷(temiposide)，放线菌素D，道诺霉素，阿霉素，争光霉素，自力霉素，顺铂，卡铂，雌莫斯汀，磷酸盐，羟基脲，BCNU，甲基苄肼，VM-26，干扰素，以及全反维生素A酸(ATRA)或其它的类维生素A(例如见医师日用手册，1997)。此外，砷化物在放射治疗前、治疗中和治疗后均可使用。
在一个特效实施方案中，本发明的砷化物和ATRA可以作为混合剂给药。优选的情况是，用本结合剂治疗的人的白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤是抗拒普通治疗方法的，或者是复发的白血病。
按照本发明，可用任何适当的给药模式，它包括但不限于肠胃外给药如静脉内、皮下、肌肉内、鞘内给药；口服和鼻内给药，以及吸入。给药模式可根据癌的类型和病人情况而异。
所用药用组合物的形式可以是消毒的水溶液或有机溶液、胶体悬浮液、药盒(caplets)、药片和胶囊。
4．2．治疗方法术语“治疗白血病的方法”意指该疾病的病症和伴随病症的症状能被缓和、被减轻、被治愈或被置于缓解状态的方法。例如，本发明的治疗方法能使被治疗的病人降低白血细胞计数或减少其淋巴细胞增多。
术语“治疗淋巴瘤的方法”意指该疾病的病症和伴随病症的症状能被缓和、被减轻、被治愈或被置于缓和状态的方法。
术语“治疗硬质肿瘤的方法”意指该疾病的病症和伴随硬质肿瘤的症状能被缓和、被减轻、被治愈或被置于缓解状态的方法。
此外，术语“治疗白血病浸润的方法”意指白血病细胞浸润离开循环系统而进入其它器官和系统，而伴随浸润的症状能被缓解、减轻、治愈或被置于缓解状态的方法。
术语“顽固性”意指该种白血病总体而言是抗拒治疗或治愈的。
术语“肿瘤前”细胞是指从正常形态向肿瘤形态转变中的细胞；或者不能正常分化的细胞；以及借助于分子生物学研究所日益支持的形态学证据表明正在通过多个步骤进展的肿瘤前细胞。
在一个实施方案中，本发明提供出一种治疗人的白血病的方法，它包括给予病人治疗有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普药剂。本发明还提供出迄今未公开过的以体重为基础的药剂方案，使病人使用这些剧毒化合物时获得最大的安全。
三氧化二砷(As2O3)能抑制并诱导NB4急性前髓细胞白血病细胞凋亡。急性前髓细胞白血病伴有t(15；17)易位，这种易位会在PML和RARα之间产生PML/RARα融合蛋白。PML是一种集中在伴有基质的核粒上的生长抑制基因；RARα是维生素A酸(RA)的核受体。PML/RARα被推荐通过抑制核受体响应来阻滞骨髓的分化作用，就象优势阴性RARα变异(dominant negative RARR mutant)所起的作用那样。此外，在APL细胞内，PML/RARα把PML和其它核粒(NB)抗原移置到核小斑上，其结果也是类似地使PML和/或NB丧失其功能。有人提出，高浓度的三氧化二砷会促进调亡，而低浓度则会诱发NB4细胞以及从APL患者取得的细胞的部分分化。有人假定说，As2O3是通过它能特异性地使APL细胞中的PML-RARα重新定位到核粒上以便使之降解的能力而发挥作用的。(Zhu等，1997，美国国家科学院会议录，943978～3983页)。但是，这些发现倾向于限制白血病亚型使用三氧化二砷。参见Konig等，1997，血液，90562～57页。
出乎意料的是，本发明人已发现，As2O3和米拉索普都能在PML和PML-RARα独立无碍状态下抑制细胞生长，并诱发多种骨髓白血病细胞系凋亡。由此，本发明已发现出，与早先的发现相反，三氧化二砷和米拉索普对广泛范围的白血病都能有效，而不管引起白血病的幕后分子机制如何。砷化物对若干种白血病细胞系的效果的工作实例示于5．1和5．2节。
据此，本发明的砷化物可用来针对各种各样的白血病，它们包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)急性淋巴B-细胞白血病急性淋巴T-细胞白血病急性成髓细胞(原始粒细胞)白血病(AML)急性前髓细胞白血病(APL)急性成单核细胞白血病急性红白血病急性成巨核细胞白血病急性粒-单核细胞白血病急性未分化细胞白血病慢性髓细胞白血病(CML)慢性淋巴细胞白血病(CLL)熟练的技术人员会承认，其它的白血病也是可能按照本发明来治疗的。
在另一实施方案中，本发明提供出一种治疗人的淋巴瘤的方法，它包括给予病人治疗有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普药剂。可用本发明的方法治疗的淋巴瘤包括但不限于高等级(highgrade)淋巴瘤、中等级淋巴瘤、低等级淋巴瘤，以及各种各样的亚型分类。
在又一个实施方案中，本发明提供出一种治疗人的硬质肿瘤包括肿瘤转移的方法，它包括给予病人治疗有效而非致死量的三氧化二砷或米拉索普药剂。可用本发明的方法治疗的硬质肿瘤包括但不限于消化道癌；食管癌、肝癌、胃癌和结肠癌；皮肤癌；脑癌；骨癌；乳房癌；肺癌；以及软组织癌；包括但不限于各种内瘤，并优选前列腺癌。
在很多实例中，白血病或肿瘤的细胞正在渗入病人的其它器官和系统中，例如渗入中枢神经系统。本发明的方法也可适用来使肿瘤前细胞异常增加的病人减少其肿瘤前细胞的数量。
在一个特定的实施方案中，本发明提供出一种治疗人的急性前髓细胞白血病(APL)的方法，它包括给予病人治疗有效但非致死量的米拉索普药剂。本发明人发现，就象在5．2节中所描述的那样，在体外能毒害细胞的米拉索普浓度，也能方便地在活体内达到。
在一个特定的实施方案中，本发明提供出一种治疗人的慢性骨髓性白血病(CML)的方法，它包括给予病人治疗有效但非致死量的三氧化二砷药剂。本发明人发现，就象在5．3节中所描述的那样，三氧化二砷也能诱发CML细胞系的凋亡。本发明的含有三氧化二砷的药用组合物的治疗好处要远胜于通常配制成福勒溶液的亚砷酸钾。
在另一个特定实施方案中，本发明提供出一种治疗人的急性前髓细胞白血病(APL)的方法(其中APL伴有把染色体17上的RARα位置移置到染色体11上)，它包括给予病人治疗有效但非致死量的三氧化二砷或米拉索普药剂。在绝大多数APL病例中，在染色体17上的RARα都易了位并与位于染色体15上的PML基因融合，这就是t(15；17)。在少数病例中，RARα易位到染色体11上，并在那里融入PLZF基因。隐匿着t(15；17)的病人对用全反维生素A酸(ATRA)的治疗无比敏感，能得到75％至95％的完全缓解率。伴有t(11；17)(PLZF-RARα)的APL独特地显示出预后不良，它对化学疗法的响应很差，对用ATRA的治疗几乎没有响应或全无响应，被定义为新的APL综合症。本发明所提供的那种三氧化二砷或米拉索普，可以用来治疗这种APL病例。用本发明的砷化物试验过其治疗好处和剂量的、伴有t(15；17)和t(11；17)的APL转基因动物模型将在下面的5．4节内描述。
患白血病的人有时会由于经历过抗白血病治疗(例如化学疗法)而抗拒普通的治疗方法。因此，本发明提供出一种治疗对普通治疗方法不起反应的人的白血病的方法，它包括给予病人治疗有效但非致死量的砷化物和其它化学治疗剂的结合药剂，这类其它化学治疗剂包括但不限于全反维生素A酸(ATRA)或其它的类维生素A。该砷化物可以或是三氧化二砷、或是米拉索普、或是它们在药物治疗上可以接受的盐。本发明也涵盖用砷化物治疗对类维生素A有抗药性的患者。
在上述特定实施方案中，本发明的砷化物和化学治疗剂可以作为混合物给药，也可以顺序地给药。在顺序给药时，砷化物可以在化学治疗剂之前或之后给药，只要在第一次给的药剂仍在人体内发挥抗白血病作用时就给第二种药剂即可。在此描述的任一种给药模式都可用来分送该结合剂。用本结合剂治疗的白血病人优选是对普通治疗方法抗拒或是复发的白血病人。
4．3．生产三氧化二砷消毒溶液的方法本发明的砷化物可按方配制成消毒的药用制剂以便向病人给药用来治疗白血病、淋巴瘤和硬质肿瘤。与相容的药用载体制剂并含有本发明的化合物的组合物可制备、包装起来并贴上治疗所指定的白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤的标签，以用来治疗这些疾病。
一方面，本发明提供出一种含有治疗有效而非致死量三氧化二砷(As2O3)的药用组合物的制造方法。三氧化二砷(原料)是一种可从商店购得的非常纯净的无机化合物。但As2O3很难溶于水溶液中。另外，本发明人并不知道有任何出版物教人如何把As2O3配制成适于给人直接注射的药用组合物。砷在溶液中是以+5价状态(五价)或+3价状态(三价)存在。例如，亚砷酸钾(KAsO2；它存在于福勒溶液中)和亚砷酸的盐含有五价砷。大家知道，砷的有一种形式要比其它形式更毒(见Goodman ＆ Gilman著治疗学的药理基础一书第9版，第66章，1660页，1997)。含有三价状态的砷的三氧化二砷新鲜溶液如果长时间暴露在空气中会逐渐被氧化成五价状态，而五价砷集聚的结果是，As2O3溶液的相对毒性在一定时间后会变化。(皮内(Id．))另外还观察到，在一定时间后溶液中砷的总量会减少。这一物质损失是由溶液中的砷进行性地转变为胂(AsH3)而引起的，胂在室温下是气态化合物。这在药物用途中是特别成问题的，如果注射物中的有效成分的浓度不受控制的话。任凭胂从溶液中逸出进入大气也是不希望有的，因为胂也是有毒的。
本发明通过试验成功地开发出了配制三氧化二砷的方法，该法克服了上述的溶解性和稳定性问题。该法包括将高纯度的固态As2O3溶解在高pH值为pH大于12的水溶液中。例如，可使用5摩尔的氢氧化钠溶液。为帮助溶解并获得清澈均匀的溶液，可使用机械搅拌和/或温和加热。隔夜溶解固态化合物也可获得As2O3的溶液。典型的情况是，1摩尔的As2O3溶液不用这个办法获得。但是，这个溶液的碱性太大，不能用作药用组合物。
为调节该As2O3溶液的pH值，首先把它在水中稀释，例如以浓度为约1mg/ml，pH12。然后将此As2O3溶液用酸、如盐酸(1摩尔至5摩尔HCl)在不断搅拌下进行回滴定，直到pH值达到约8～8.5为止。高浓度HCl会引起As2O3溶液中产生沉淀，因此不宜使用。被部分中和了的As2O3溶液随后即可例如用过滤法(例如通过0.22μm的过滤器)进行灭菌并储藏在消毒小瓶中。
为制出可直接给对象注射的药用组合物，该组合物必须是无菌的，可采用消毒技术人员所熟知的标准技术。见例如Remington著药物科学一书。被部分中和了的As2O3溶液的pH值可进一步用药用载体、例如5％葡萄糖溶液稀释(10～100倍)到接近生理pH值。例如，10ml部分中和的As2O3溶液可加到500ml的5％葡萄糖溶液中，以配出最终的pH值为约6.5～7.5。本发明的方法可减轻砷在溶液中的氧化作用。用本发明的方法制出的含有三氧化二砷的药用组合物表达出具有改进的稳定性和很长的货架寿命。
4．4．药用组合物和给药模式按照本发明，砷化物及其生理上能接受的溶合物可配制来作口服或胃肠外给药。
用作口服时，药物可制备成液体形式，如溶液、糖浆或悬浮液，或者可以做成在使用前兑水或兑其它适当载剂(vehicle)的药物产品。这样的液体制品可用普通工具用下列在药用上可以接受的添加剂来制备悬浮剂(例如梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如杏仁油、油状酯、或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。药用组合物的形式，例如可以是用普通工具用药用上能接受的赋形剂做成片或胶囊。这种赋形剂有例如粘结剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或甘醇酸淀粉钠酯)；或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可用本领域熟知的方法包衣。
吸入给药时，按照本发明使用的化学物可方便地以气溶胶喷射的形式从压力包装或喷雾器喷出而送入，其中要用到适当的助推剂如二氯二氟甲烷、三氯-氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可加装一个阀来确定，以送入可计量的量。可用例如明胶做的胶囊和药管、内装化合物和适当的粉末基料(如乳糖或淀粉)所配的粉末混合物来用于吸入器。
该化合物可配制成供静脉内注射、如浓缩药团注射或连续输注的药剂。注射制剂可做成单元剂量的方式如装在安瓿中或多剂量容器中，内中加有防腐剂。该组合物可采用这些形式，如在由性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳胶液，并可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等制剂用料剂。另一种可替代的办法是，活性组分可以粉末形式，在使用前再与适当的载体如无菌无热源的水(Sterile pyrogen-freewater)配制。
本发明还提供出实现本发明治疗方案的成套药包。这种药包内装有一个或几个容器，容器内以药用可接受的方式装有治疗有效而非致死量的砷化物。在本发明的成套药包小瓶中的砷化物可以是药用上可接受的溶液形式，例如与无菌的盐水、葡萄糖溶液、或缓冲溶液、或其它在药用上可接受的无菌流体结合在一起的溶液。另外的办法是，该复合剂可以是冻干品或干制品；在这种情况下，成套药包的容器内还应进一步装有在药用上可接受的溶液(例如盐水、葡萄糖溶液等)，优选是灭菌溶液，以便将此复合剂重新配制成注射用溶液。
在另一实施方案中，本发明的成套药包还配有优选装入消毒包装的针和注射器，和/或酒精棉。可任选包括有对临床医师或病人使用砷化物的用药指导。
在急性或慢性白血病治疗中，砷化物治疗剂的量应随着所处理病情的严重性和用药途径而变化。剂量或剂量频数还应根据各个病人的年龄、体重、病情和反应而有所不同。总的来说，对于已描述过的病情来说，一天的三氧化二砷剂量范围通常为每公斤体重约从0.05至5mg，分几次通过胃肠外或口服或皮肤表面局部给药。优选的每日总剂量为约从2.5至40mg三氧化二砷。本发明的三氧化二砷制剂优选最多连给60天或者直到缓解为止，然后再跟进二至十个附加周期，每个周期用25天。例如，根据急性前髓细胞白血病人的体重，每天给予的三氧化二砷剂量大于或少于10mg是可以的。替代的办法是，遵循按体重给药的治疗方案，每天给予三氧化二砷的剂量少于10mg就可取得治疗效果。
对治疗硬质肿瘤来说，优选的剂量方案是每公斤体重每天静脉输注约0.1-5mg，共输5天。每月再重复一次这样的5天治疗方案，直到肿瘤生长被抑制或肿瘤显示出消退迹象为止。
至于米拉索普的每天总剂量范围，对于已描述过的病情来说通常为每公斤体重约0.1～5mg，分几次通过胃肠外或口服或皮肤表面局部给药。优选的米拉索普每天总剂量为每公斤体重约从0.5至4mg。
三氧化二砷或米拉索普对癌的发育和进展的治疗效果，可借助于本领域熟知的任何方法来监视，这些方法包括但不限于测定肿瘤的特异性抗原和推断用的生物标记物如癌胚抗原(CEA)、α-胎蛋白等的水平；以及用计算机辅助的X线体层照相巡检和/或声图描记来测定形态学和/或大小的变化。
要求的血液中的药物浓度可借助于不断输注砷化物来保持，以查验出的血浆中的药物浓度(plasma level)来确定。应当指出，参与治疗的医师应当知道，如何、以及何时需要结束、中止或调整治疗方法来减少剂量，在每性大或骨髓、肝脏或肾脏机能障碍时即应调整。相反地，如果临床的反应不足(排除掉毒性副作用)，则参与治疗的医师也应当知道如何、以及何时须把治疗调整到较高的水平。
再者，为给患者提供有效剂量的砷化物，可采用任何适当的给药途径。例如可采用口服的、经皮的、离子电渗的、肠胃外的(皮下的、肌肉的、鞘肉的等等)途径。药剂形式包括片、锭、扁形胶囊、分散剂、悬浮剂、溶液、胶囊、膏药等(见Remington著药物科学一书)。
本发明的药用组合物中含有作为活性组分的砷化物和它们的在药用上可接受的盐，还可含有药用上可接受的载体(carrier)，并可任选含有其它治疗组分如全反维生素A酸。术语“药用上可接受的盐类”指的是用药用上可接受的无毒的酸和碱、包括无机和有机的酸和碱制备出的盐。
本药用组合物包括适于口服、粘膜途径的、经皮的、离子电渗的、肠胃外的(包括皮下的、肌内的、鞘内的和静脉内的)给药的组合物，但是，在任何指定案例中最适宜的用药途径要取决于被处理的病情的性质和严重性。
在采用静脉内注射或输注用组合物的情况下，适当的使用剂量例如可以是每天的总量为从约1至40mg的三氧化二砷；每公斤体重每天的总量为约0.001至10mg的三氧化二砷；或者每公斤体重每天的总量为约0.1至10mg的米拉索普。
此外，砷的载体可通过带电的和不带电的基质而把药物分送出去，这种起药物分送器作用的物质如乙酸纤维素膜；还可通过目标分送系统如附着在抗体或特效抗原上的梭茵基因脂质体来分送。
在实际使用中，砷化物可作为活性组分按照普通的药物混合技术与药用载体紧密地掺合在一起。视用药(例如口服或胃肠外给药)所要求的制备方式的不同，载体可采取多种形式(包括片、胶囊、粉末、静脉注射或输注)。在制备口服剂量形式的组合物时，可采用任何一种常用的药用介质(media)，例如在配制口服液体制剂、如悬浮液、溶液、酏剂、脂质体和气溶胶时可采用水、乙二醇、油、酒精、调味剂、防腐剂、着色剂等；在配制口服固体制剂、如粉剂、胶囊和片剂时，可采用淀粉、蔗糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。在制备胃肠外剂量形式的组合物、如静脉内注射或输注的组合物时，可采用类似的药用介质、如水、乙二醇、油、缓冲剂、蔗糖、防腐剂等，这些都是本领域技术人员所熟知的。这样的胃肠外剂量的例子包括、但不限于葡萄糖5％w/v，生理盐水或其它溶液。砷化物的总剂量可用例如约2ml至2000ml范围的静脉内流体小瓶来给药。稀释流体的容积将随着总的给药剂量而变。例如，以10ml浓度为1mg/ml水溶液给药的三氧化二砷是在10至500ml、5％的葡萄糖溶液中进行稀释，并用作静脉内输注约10分钟至4小时的时间。
白血病、淋巴瘤或硬质癌病人的示例性治疗过程包括每天通过静脉内输注三氧化二砷水溶液，一天的给药剂量为每公斤病人体重0.01mg至1mg。优选每公斤体重使用0.15mg三氧化二砷。治疗过程可继续到观察到骨髓缓解为止，或者发现副作用变得严重时即停止。该治疗过程在大约10个月中可重复最多10次，在两次过程之间停休约3～6周。缓解后治疗过程包括每天每公斤病人体重输注约0.15mg三氧化二砷，每日输注或只在工作日输注，累计25天。
5．实施例下面将描述用本砷化物治疗各种类型白血病的使用实例。通过这些和其它的试验，发现本发明的三氧化二砷制剂对人来说是很能耐受的。例如，有三个APL患者被给予了10mg本发明的三氧化二砷制剂，每天一次(单调剂量(flat dose)静脉输注。
5．1．三氧化二砷和米拉索普诱发骨髓性白血病细胞系凋亡已经查明了As2O3和米拉索普对骨髓性白血病细胞系、包括APL细胞系NB4-306(一种从NB4衍生出来的抗维生素A酸细胞系，它已不再表达完整的PML-RARα融合蛋白)、HL-60、KG-1和骨髓单核细胞系U937的活性。为了考察PML调解砷活性的作用，本发明人还用鼠胚成纤维细胞(MEFs)和骨髓(BM)前期细胞(其中的PML基因已用同源重组的方法灭活)来试验这些药剂。结果出乎意料地发现，两种化合物都能对所有被试的细胞系抑制其生长并诱发其凋亡。在10-7至10-3mol/l范围内的等摩尔浓度下，米拉索普显示出更加有力。As2O3则把PML和PML-RARα移位到核粒上，核粒的NB4以及HL60和U937细胞系随后即被PML降解。虽则米拉索普在抑制生长和诱发凋亡方面更加有力，但它对PML和/或PML-RARα的核定位不发生影响。此外，As2O3和米拉索普两者都能类似地抑制PML+/+和PML-/-MEF的生长并诱发其凋亡，并且在PML+/+和PML-/-前期细胞的BM培养物中，抑制群落形成单位红细胞系(CFU-E)和CFU粒性白细胞-单核细胞的形成。关于这些方法、材料和这些试验的结果在Wang等著血液，1998，921497～1504页中已作了详细描述。
试验的结果显示，两种砷剂在这些细胞系中的毒害效应都不受依赖于PML或PML-RARα表达的机制的调解。在大多数细胞系中，米拉索普在抑制生长和诱发凋亡方面，比As2O3要更有力一些，而两种药剂的效应都是依赖于剂量的。如前所述，已经确认，As2O3能把PML蛋白移置到核粒上，并在NB4细胞中诱发PML和PML-RARα降解，同时触发凋亡。但是在并不隐匿PML-RARα融合基因的HL60和U937细胞中，也观察到了类似的效应。加之，在所有被试的细胞系中，米拉索普都诱发凋亡而不改变PML和/或PML-RARα。
As2O3和米拉索普在体外的分化作用显得微不足道，而且并显得不依赖于PML和/或PML-RARα任一方的表达和/或调整。事实上，本发明人在长时间(长达2周)培养物中所观察到的微小效应，对两种化合物在所有被试细胞系中都是相类似的。
我们还发现，过去曾把它与As2O3对APL的抗白血病效应相联系的bcl-2下调(downregulation)，也是不依赖于PML-RARα蛋白的表达的，因为bcl下调是发生在NB4亚克隆306内，而在BN4亚克隆306内，未受损伤的蛋白是测不出来的。最后，为试验PML表达对砷剂的抗白血病效应是否重要，两种药剂都在鼠胚胎的成纤维细胞和动物的BM细胞中作过试验，其中的野生型(wild-type)PML已被同源重组所消灭。在这些细胞中全都缺乏PML表达，As2O3和米拉索普在抑制生长和诱发凋亡方面都同样有效，而且两者对正常CFU-E和CFU-GM群落形成都有相似的效果。此外，在野生型和PML-/-细胞之间没有发现有区别。同时，不受任何理论的约束，这些资料强烈地支持着这样的理论，即这些砷剂的抗白血病效应是独立于PML和PML-RARα两者的表达而发生的。这些结果与砷剂对不以改变PML蛋白为特征的疾病，为慢性髓细胞白血病的药用历史相符。
这些结果表明，As2O3和米拉索普作为抗白血病药剂都对骨髓的和淋巴的两类疾病具有广泛的效果。结论是，这些资料表明，毒害细胞的活性是不受PML蛋白调解的，因而也不限于与PML表达变化有关的疾病。因此，本发明的砷化物具有潜在的更广泛的不受限于APL的治疗作用。
5．2．对晚期白血病患者进行的米拉索普临床研究米拉索普是一种有机砷剂，它由氧化蜜胺胂与二巯基丙醇复合而成，它最早用于治疗非洲锥虫病。对米拉索普对以慢性B-细胞淋巴组织增生病为代表的细胞系诱发凋亡的效应已经作了研究，其结果如下所述。
米拉索普(商品名为Arsobal(硫砷蜜胺)(36mg/ml)，由宾夕法尼亚州Collegeville的Rhone Poulenc Rorer销售)在丙二醇中被稀释成基本原料浓度为10-4mol/L并在室温下贮存。As2O3(Sigma公司，St．Louis，密苏里州)被溶解在1.65mol/L的氢氧化钠(NaOH)中，基本原料浓度为10-3mol/L。在RPMI 1640的介质中进行连续稀释(10-6至10-9mol/l)。把Epstein-Barr病毒(EBV)转化的B-前淋巴细胞系(JVM-2)、EVB转化的B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞系(I83 CLL)和一种非EBV转化的B-CLL细胞系(WSU-CLL)用作靶子。米拉索普的剂量响应试验(10-～10-mol/L)进行了96小时。
出乎意料的是，本发明人发现，米拉索普在所有三种细胞系中都能引起随剂量和时间而改变的对成活和生长的抑制。与此相反，As2O3在相似的浓度下对生活力或生长都不起作用。24小时后，所有三种用米拉索普(10-7mol/l)处理的细胞系都呈现出凋亡的形态学特征。在WSU-CLL、183CLL和JVM-2细胞暴露于米拉索普24小时后，观察到了bcl-2 mRNA的下调显著地随浓度而变。在所有三种细胞纱中也观察到了bcl-2蛋白表达的减少，而As2O3对此项参数不起作用。
在已知上述体外资料已出乎意料地显示，米拉索普一般在浓度比As2O3为低的情况下对骨髓和淋巴细胞两者都具有广泛的抗白血病活性的情况下，又开始了一项研究，以便估量米拉索普对复发的或顽固性白血病患者的药物动力学、安全性和潜在效率。
对适宜的病人进行了治疗试验，采用简单的一日注射四次，连注三日，每周重复一次，延续三周，对有响应的病人再外加三周的治疗过程。最初的剂量是第1日mg/kg，第2日2mg/kg，第3日3.6mg/kg，以后各天均为此剂量。平行进行的体外研究包括新鲜白血病细胞对米拉索普和As2O3两者的培养物敏感性，同时对表面抗原表达、调亡、以及bcl-2表达进行连续流动血细胞计数(serial flowcytometric)的研究。三个AML患者和一个CML患者参与了此项研究。
用一台敏感度约为10mg/ml的高性能液体色谱仪进行测定，最初的药物动力学资料表明，血浆药物浓度的峰值Cmax范围为注射后立即测定的第1天的1.2ng/ml至第3天测定的2.4ng/ml。虽然初始的分配相很迅速，但延长的T12Y]]>却表明是从深的腔室中释放出来的。在浓度～时间曲线下的血浆面积(AUCs)是与给药剂量成正比的，其范围为第1天的0.48ng·h/ml至第3天的1.48ng·h/ml。可测量到的药剂浓度是在初始剂量给药1周后的血浆中发现的。药物较好地被耐受了。不利效应包括注射处的瞬时疼痛和温和的恶心。没有发现有“反射性脑病”(在治疗CNS锥虫病时偶有发现)的迹象。
这些研究的结果说明米拉索普可能具有比As2O3更广泛的活性；以及在体外能毒害白血病细胞的浓度，在治疗上也将方便地在活体内取得这一浓度。
5．3．三氧化二砷能诱发K562慢性髓细胞白血病(CML)细胞的凋亡费城染色体阳性CML细胞系K562被用来克定三氧化二砷(As2O3)是否能促进CML的凋亡。在对数期内的细胞悬浮培养物被暴露于1×10-6M、5×10-6M和1×10-5M、浓度的As2O3中。在72小时过程的多个时间点上分析了细胞的整除部分，以评估其生存能力和凋亡。生存能力用锥虫蓝排斥法来衡量；与此同时，凋亡则用形态学、流动血细胞计数法和DNA凝胶电泳法来测定。
浓度为10-6M的三氧化二砷对K562细胞的生长或生存能力不起作用。对细胞生长和存活有最大作用的是1×10-5M的As2O3。暴露于As2O372小时后K562细胞的生长和生存能力数据报告于下表1中表1细胞生长损害％存活％p值对照 0 92.1+0.95×10-6M As2O363.078.8±0.5 0.00011×10-5M As2O375.361.9+2.9 0.0223对这一由砷诱发的生存能力降低即是代表着凋亡的证据进行了分析。凋亡的形态学特征、包括膜发泡和核凝缩，在用10-5M As2O3孵育72小时的K562细胞的染色的细胞自旋(cytospins)中是清晰可见的。这一点与DNA核间体损失的证据相互关联，该损失证据可借助于从暴露于10-5M As2O3的K562细胞中萃取出来的DNA的凝胶电泳而看到。用隧道法测量所进行的对凋亡的定量评估展示出有75.6％±8.6(1×10-5M As2O3)的细胞在72小时时凋亡，而对照组只有6.3％±3.0的细胞凋亡。用10-5M As2O3处理K562细胞，用Northern分析法测定的结果是p21 mRNA上调，这说明细胞被阻于细胞循环的G1相内。这一资料指明，三氧化二砷是CML的治疗剂。
5．4．用维生素A酸和三氧化二砷(As2O3)对PML-RARα和PLZF-RARα转基因小鼠进行的治疗试验急性前髓细胞白血病(APL)伴有染色体的易位，它总是包括有染色体17上的维生素A酸受体α(RARα)部位转移到基因组内的其它部位上，例如在大多数APL情况下，PML基因位于染色体15上，而在少数情况下，PLZF基因则位于染色体11上。隐匿有t(15；17)的患者对用全反维生素A酸(ATRA)治疗是很敏感的，能产生出75％至95％的完全缓解率。与t(11；17)(PLZF-RARα)有关的APL显示出对ATRA反应很小。
为试验As2O3对治疗APL的效能，在转基因小鼠身上制造了两种疾病模型。用标准技术产生出转基因小鼠，其法是把PML-RARα或PLZF-RARα融合蛋白的表达置于骨髓-前髓细胞特异性人组织蛋白酶-G(hcG)小基因的控制之下。hcG-PML/RARα和hcG-PLZF-RARα两种转基因小鼠都发展成了骨髓性白血病，其APL特性类似于人的APL。
对这些白血病小鼠用下列方案进行了治疗试验1)ATRA，每天每克体重口服1.5μg；以及2)ATRA每天每克体重腹膜内给药6μg。小鼠每周取一次血样以评估其反应。
PML/RARα白血病对ATRA响应良好，缓解率很高(第1方案为80％)。令人惊喜的是，在试管中，ATRA能诱发分化并能抑制白血病细胞生长，同时还能对PML-RARα和PLZF-RARα两种白血病在骨髓和脾前期细胞中的白血病群落形成进行抑制。另外，在活体外的试验中，取自PLZF-RARα小鼠的白血病细胞，在用ATRA预孵育以后被移植到受体无胸腺小鼠后已失去了它的致肿瘤能力，而未经处理的细胞则能致肿瘤。但是，在活体内，PLZF-RARα白血病对ATRA(28％，用第1方案)响应很差，但较高剂量的ATRA(50％，用第2方案)则显示出较为有效。总之，PLZF-RARα变基因小鼠的白血病对ATRA治疗反应敏感，但可能要求用高剂量ATRA的治疗方案。这些发现在治疗隐匿有t(11；17)的APL患者中具有直接的影响。
在PML-RARα和PLZF-RARα两种白血病中，ATRA能延长存活时间，但白血病在短时缓解后会复发，并对进一步的ATRA治疗产生抗药性。该两种转基因小鼠模型还用来试验As2O3的效能和剂量，并对抗拒ATRA的APL患者和伴有t(11；17)的APL患者作了ATRA+As2O3结合治疗的试验。治疗方案是腹膜内给药每克体重每天6μg As2O3或6μg As2O3与1.5或6μg ATRA的结合剂。小鼠每周抽血样一次以便评估APL的缓解情况。
5．5．药用方剂的制造及其稳定性固态超纯三氧化二砷(As2O3)被溶解在5M的氢氧化钠(NaOH)溶液中。该悬浮液在室温下被搅拌5分钟，产生出清澈均匀的溶液。As2O3溶液(2ml，1.0M)被加入到500ml锥形瓶中的393.6ml水中，配出As2O3浓度为1mg/ml和pH值=12的溶液。在250ml锥形瓶中用HCl(49.26ml，37％wt/wt，10/15M)与H2O(50.74ml)配制出5M的HCl。该HCl溶液稍后用注射器转移到1000ml空的抽真空容器中。As2O3溶液用HCl(0.725ml，5.0M)回滴定到pH8.0。大约10ml的回滴定As2O3溶液被通过Millex-GS 0.22μm的过滤器进行过滤，并被加入到30个抽真空的消毒小瓶中。为制成能给病人作静脉内注射的药用组合物，从其中两个小瓶中抽出10ml这种溶液并加入到500ml 5％葡萄糖溶液中配成最终pH值为6.5。
本体超始材料的高纯度用原子吸收比色法确认(见表2)对四种中间步骤或最终步骤溶液的复制样品测定了总的砷含量。测定本体粉末确认了起始材料的超高纯度。中间的和最终的产品溶液中的砷含量资料列于下表2中。
下表的数据显示，溶液是稳定的，因为经过一段时间后没有出现任何砷的重量损失的迹象。
表2三氧化二砷中间制剂和最终产品溶液中的砷含量(ppm)
*样品代码的特性A-01最初溶解在NaOH中后的中间产品溶液。
A-02在HCl滴定前的中间产品溶液。
A-03在Millex过滤前的中间产品。
A-04制造后立即从10ml消毒小瓶中取出的最终产品。
A-05制造二个月后从加盖小瓶中取出的最终产品。
6．实施例对APL患者的临床试验在APL患者中对三氧化二砷进行评估，以确定该制剂是否诱发了细胞分化或诱发了凋亡。十二个经过多种治疗而复发的患者用三氧化二砷治疗，使用剂量为每天0.06至0.2mg/kg，直到骨髓缓解为止。借助于对免疫表型、现场杂交荧光(FISH)作流动血细胞计数；对凋亡伴随蛋白、Caspase 1、2和3的PML/RARα表达、西部吸印表达(Western blot expression)作逆向转录聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chain reaction(RT-PCR))测定，来对骨髓单核细胞作一系列的监视。结果显示，低剂量的三氧化二砷对APL复发病人有很高的诱导全面缓解的效应。临床响应伴随有不完全的细胞分化和通过白血病细胞被caspase激活诱发凋亡。
6．1．方法临床治疗方案适宜性要求包括对APL的诊断，借助于对t(15；17)易位作细胞遗传学分析或作现场杂交荧光(FISH)分析，或者对PML/RARα作逆向转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定来确认。病人必须是经过标准治疗、包括全反维生素A酸加上与毒害细胞的药剂相结合治疗而复发的。要求有对通知的签字同意，而且治疗方案要经过该中心建立的检查局的检查和批准。
三氧化二砷治疗三氧化二砷是以10ml的小瓶、药物浓度为1mg/ml的水溶液来供应的。该药再稀释到500ml 5％的葡萄糖溶液中并每天一次静脉输注2～4小时。与最初的同龄组病人接受10或15mg/d的单调剂量的同时，有两个孩子的治疗安排促使发明了直到现在还未听说的以体重为根据治疗方案(0.15mg/kg/d)。每天都给药，直到观察到骨髓缓解为止。得到完全缓解的病人适宜在前述疗程后再作3到6周的补充疗程。后续疗程一般给的剂量是0.15mg/kg/d，累计25天，可以每天给药，也可以只在工作日给药，在大约10个月中最多6个疗程。
研究期间的监视有凝血病的患者给以血小板和鲜冻血浆的输液，以使血小板计数和血纤维蛋白原分别保持在≥50，000细胞/mm3和≥100mg/d1的目标水平。连续地获取血液计数、凝血试验、血清化学分布、尿分析和心电图。按基准抽取骨髓和/或做活组织检查，并在此后定期进行，直到病案文件证明已经缓解。观察了普通的反应判断标准，包括骨髓恢复到≤5％未成熟细胞、末稍血白细胞≥3000细胞/mm3、血小板≥10，000细胞/mm3。
细胞免疫表型研究收集了肝素化的骨髓或血液样品，并用Ficoll-Hypaque离心法分离出了单核细胞。借助于直接免疫荧光染色法测定了表面膜抗原，染色是用isethiocynate荧光素(FITC)或结合有藻红蛋白的单克隆抗体CDl6(Leu 11a)、CDl1b、CD33(LeuM9)、HLA-DR、CD45和CD14进行，这些抗体可从Becton-Dickinson(Mountainview，加里福尼亚州)或Immunotech Immunology(Marseille，法国)购得。双色染色是借助于用两种单克隆抗体、包括CD33-PE/CDllb-FITC和CD33-PE/CD16-FITC同时对细胞进行孵育来实现的。使用不相干的同型单克隆免疫球蛋白做的阴性对照组也同时进行了分析。流动血细胞计数分析用一台配有488nm氩激光器的EPICS Profile Ⅱ型流动血细胞计数器(Coulter Electronics)来进行。分散到前面和侧面的细胞的参数系用CD45/CD14染色法分辨出感兴趣的种群并把单细胞排除出分析门(analysis gate)的办法来测定并合并的。使用了多参数资料收集和展示系统(MDADS，CoulterElectronics)来获取和分析资料。
现场杂交荧光(FISH)将选定的经受过CD33和CD11b免疫荧光染色的标本。对共同表达为两种抗原的细胞用FACStar Plus型细胞分类器(Becton-Dickinson)进行了分类。分离出来的细胞在培养介质中在37℃下孵育一小时，用低张溶液0.075M KCl处理5分钟，在甲醇∶乙酸的比例为3∶1的固定剂中作固定，并被在空气中干燥。使用一种特定的PML/RARα易位的双色探测剂(Vysis；Downer’sGrove，伊利诺斯州)进行了分裂间期的FISH。简单地说，取自分裂间期细胞的DNA用把载玻片浸入75℃的50％甲酰胺/2xSSC溶液中5分钟的办法使之变性；随后把载玻片用酒精脱水并在空气中干燥。涂敷了一层杂交混合物中的探测剂混合物(mixture of probe)，用盖片盖上，并用橡胶粘合剂封闭。杂交是在潮湿的室内，在37℃下进行了12至16小时。杂交后随即把载玻片在45℃下，放下50％甲酰胺/2xSSC溶液中清洗三次，每镒10分钟，随后再在45℃下放入2xSSC/0.1NP-40溶液中清洗5分钟，以除去未结合的探测剂。该载玻片然后被在空气中干燥并用4’，6-双脒基-2-苯基吲哚进行复染，并用玻璃盖片盖住。分裂间期细胞的荧光信号分析是用一台装在蔡司轴镜(axioscope)上的Photometrics Sensys照相机进行的。对每种样品至少研究300个细胞。
西部吸印分析将细胞放入含有以下组分的缓冲液中溶解50mMTris-HCl、0.5mM亚乙基二醇[bis]-[氨酰基]四乙酸、170mM NaCl、1mM dithiothreitel、0.2％NP-40、0.01U/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽素、10μg/ml胃酶抑素，以及1μM苯基甲基磺酰基氟化物(全部购自Sigma)。在后，该溶胞产物用超声均浆器(417C系列，Cole Parmer仪器公司，芝加哥，伊利诺斯州)进行声处理，并在7500g(Sorvall仪器公司，Newtown，康涅狄格州)下进行离心分离。该溶胞产物的蛋白质含量余用BioRad蛋白质测定套件(Bio-Rad实验室，Hercules，加里福尼亚州)，在595nm下按照BSA标准进行测定。把在1倍积层缓冲液中含有10％甘油、0.4％SDS、0.3％溴酚蓝、0.2％焦宁染料(三基料(Trisbase)0.5M，0.8％SDS)的一种样品缓冲液，以及20％2-巯基乙醇，加入到细胞溶胞产物中，并在95℃下进行热变性3分钟。随后，15μg/道的蛋白质被装载在含有12.5％聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶上，并用电泳法按大小分级。蛋白质被电泳吸引到Tras-Blot转换媒介(Bio-Rad)上，并作为内部装载对照物用Ponceau-S进行染色，加入了兔子的抗人类(anti-human)单克隆抗体，包括caspase 1，caspase 2(两者购自Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，加里福尼亚州)和Caspase 3(PharMingen，San Diego，加里福尼亚州)，并用ECLTM化学发光测定系统(Amersham，Arlington Heights，伊利诺斯州)进行了测定。蛋白带(bands)被用计算机密度测定法作了定量。
PML/RARα的RT-PCR分析使用前述方法(见Miller等，1992，国立科学院会议录，892694-8；Miller等，1993，血液，821689-94)进行了RT-PCR分析。
6．2．结果患者治疗了12名复发的或顽固性的APL病人。所有病人都在过去接受过用类维生素A和毒害细胞药物的多方治疗(表3)。有两位病人是从同种骨髓移植后复发的，其中一位经供体T-细胞再输注后失败。有一位病人由于慢性肾衰竭而靠血液透析维持着。
临床效应在经过三氧化二砷治疗后，12个病人中的11个得到了完全缓解。作血液透析的那位病人在第1天遭遇了颅内出血，在第5天死亡。在有响应病人中，中等治疗延续时间为33天(范围为12至39日)，中等日给剂量为0.16mg/kg(范围为0.06至0.2mg/kg)，而诱导期间的中等累积剂量为360mg(范围为160至515mg)(表3)。自开始治疗起断标准取得完全缓解的中等时间为47天(范围为24至83天)。按骨髓标准的缓解-这是停止治疗的决定因素-是首先取得的，通常顺序地随之而来的是末梢血液白细胞和血小板的恢复。在此项研究所用剂量的范围内，在响应的效能或时间的差异上，没有一项是显著的。在经过两个疗程后，被试的11个病人中的8个的PML/RARα的RT-PCR测定都从阳性倒转为阴性。
11个完全缓解的病人都至少用三氧化二砷实行了一次后缓解疗程。有四个、两个和一个病人总共分别实施了三次、四次和五次疗程。中等缓解延续时间为5+个月(范围为1至9+个月)。但是，11个病人中的3个在第二次疗程中复发；他们中没有一人逆转了他们的RT-PCR测定，而每个人表达出很快有了抗药性。这三人中的两人从那以后就因进行性白血病而死亡。
不利事项该项研究中病人们的临床症状是非常多样的，这反映了他们过去经受过广泛的治疗。治疗方案不要求住院；有三个病人完全作为门诊病人完成了诱导治疗，仅有另外一个住院以放置静脉导管。但是，有8个病人住院是因为白血病并发症；其中5人要求调换到加强护理的单位、气管内插管和辅助式通气，并发症有肺出血、肾衰竭、脓毒病、宿主排异反应病(graft vs．host disease)、非特异性肺浸润、或低血压。一个病人在形成严重的代谢酸中毒、血钾过多、低血压和肾功能不全中发展成二度心传导阻滞后，要求插入永久性的起搏器。然而，虽然用进一步的三氧化二砷治疗，但心传导阻滞还是逆转了。在5个病人中，由于严重的过程中内科并发症而暂时停药，停药中位天数为2天(范围为1～5天)。有两个病人发展出类似于“维生素A酸综合症”的症状，按推测二人都用地塞米松治疗，得到了改善。只有两个病人一点也没有输注血小板；输注的血小板单位的中位数为61(范围为0～586单位)。
在接诊时，末梢血液白细胞总计数的中位数为4，700细胞/mm3(范围为500至144，000细胞/mm3)。6个病人发展成白细胞增多(即≥20，000细胞/mm3)其范围为20，800至144，200细胞/mm3。对这些病人没有再给额外的药物，在所有场合下，白细胞过多症都是在没有进一步干预的情况下得到消退的。
一般的不利反应包括在输注时头晕、乏力、肌肉骨骼痛，以及轻度的血糖过多。有三个病人触物感痛，推测是末梢神经有病。但是，其中二人曾在辅助式通气时长时间不能动，另一人有过早期神经病史。
免疫表型研究APL的特征是具有表达CD33的细胞，CD33是常伴有原始(primitive)骨髓细胞的抗原。三氧化二砷治疗诱导出了只表达CD33细胞的比例进行性地减少，同时使表达CD11b细胞的比例增加，CD11b是伴有成熟骨髓细胞的抗原。尽管这些变化可由任何诱导APL缓解的药剂得到预期，但是三氧化二砷还诱导出了同时表达两种抗原的细胞表达。在多数情况下，这些双表达细胞占了骨髓细胞群体的大多数，而且它们在按临床标准取得完全缓解后很长时期内还继续存在。
现场杂交荧光分析从完全早期缓解及较晚缓解的病人身上取出骨髓单核细胞，借助于流动血细胞计数选分出共同表达CD33和CD11b的抗原。使用现场杂交荧光(FISH)分析法，考察了早期缓解的300个细胞。与对照APL细胞相类似，这些细胞中的大多数产生出了杂种信号，这说明在PML和RAR-α基因之间发生了易位，并说明它们来源于肿瘤克隆。但是，从同一病人在缓解后期取出的细胞用相同参数再行选分时，却只测到了正常型的荧光信号，这说明它们是从造血前期细胞衍生出来的。
西部吸印分析对从骨髓单核细胞萃取而得的蛋白萃取物作了一系列的西部吸印分析。分析表明，在活体内caspase 2和caspase 3的前体形式在对三氧化二砷治疗作出响应中已被上调。再者，这一治疗还诱导出了caspase 1分裂碎片的表达，这表明酶的激活作用。还有一些指证说明，caspase 3的分裂形式的表达是增加了。在这些试验中使用的抗体不与caspase 2的分裂形式起反应。
6．3．讨论在这项研究中，被接纳参加试验的病人，除绝少例外，都是持续多次复发并抵抗普通化疗、类维生素A和骨髓移植的。在治疗开始时，参与此项研究的病人患有数不清的与白血病相联系的并发症，它们包括呼吸衰竭、弥散性水痘带状疱疹感染、腔曲霉病、慢性肾衰竭、以及宿主排异反应病。另外，12个病人中的5个要求允许进入加强护理的单位，以便进行辅助式通气和支持性护理，但是这些并发症并不是与三氧化二砷治疗直接有关的。
事实上，所有确诊为APL的病人都取得了缓解，而没有与类维生素A治疗相伴的早死。虽然与全反维生素A酸治疗相比所观察到的受白细胞增多侵袭的情况要少些，但三氧化二砷仍在若干病人身上诱导出了此病。在停止了其它的毒害细胞的药物后，随着病人取得缓解，白细胞增多也就消失。
尽管有3人早期复发，受试11个病人中的8人其PML/RAR-α(残余病症的分子标记)的RT-PCR测定已逆转为阴性，这是单独用全反维生素A酸治疗后不常见的现象。最后，三氧化二砷对APL的有效剂量至少有三倍之差，范围为0.06至0.20mg/kg。
全反维生素A酸能诱发APL细胞的“终极”分化，但三氧化二砷的细胞分化效应表达出是不完全的。砷能诱发出同时表达成熟细胞和非成熟细胞表面抗原特性(亦即分别为CD11b和CD33)的细胞群体。在诱导早期，这些细胞保留着表征APL的t(15；17)易位。出乎意料的是，尽管临床上已完全缓解，但这些细胞在骨髓中仍继续存在；但是在缓解后期，双表达细胞虽能方便地测出，但在现场杂交中已不再是阳性。白血病细胞在治疗时的形态学外观也不象用全反维生素A酸治疗时观察到的那样清晰可辨。事实上，许多病人的白血病细胞在10天或10天以上很少显示出形态学变化，此后，白血病细胞的比例才进行性减少。
在“非终极”分化后，三氧化二砷接着就能诱发凋亡，同时发生表达增多以及半胱氨酸蛋白酶(术语称为caspases)由非活性的前体向激活的酶的转变。caspase途径只是最近才被表征为有计划的细胞死亡的重要途径。在一开始，被承认是因为c．elegans蛋白质ced-3和哺乳动物白细胞介素-1β转化酶(ICE)之间是同种，现在，caspase家族包括至少10种不同的蛋白，它们能分裂成很多种多肽。在白血病细胞系中，用多种毒害细胞的药剂都可诱导出caspase激活，包括用全反维生素A酸。由于这些酶能诱导出分布很广的蛋白分解作用，因此可以认为PML/RAR-α是caspase的底物。
三氧化二砷和全反维生素A酸最后一个相似之处，是在某些个人能迅速产生临床抗药性。从两个复发病人身上取出的白血病细胞，在试管中在浓度范围为10-4M至10-7M下保持着敏感性。由于细胞内输送降低而引起对砷剂的相对抗药性已通过与膜输送器的下调相联系被描述，而膜输送器是由细菌细胞内的ars操纵子来编码的。哺乳动物细胞内的抗药性还没有很好地加以定性，但是膜输送的变化或者出现流出物可能是重要的因素。
总之，三氧化二砷能诱导经过广泛治疗而复发的APL病人完全缓解。这种药物能引起白血病细胞局部的但是不完全的细胞分化，随后能使caspase激活并诱发凋亡。
表3急性前髓细胞白血病患者用三氧化二砷治疗的临床特征和诱导治疗结果
所有患者先前均接受过一次或多次全反维生素A酸，外加蒽环类抗生素加阿糖胞苷的疗程。*表示该个体已证实对类维生素A有抗药性(即在再诱导期间缺少反应或在保有类维生素A期间复发)；*表示病人已早期死亡。其它治疗amitoxantrone/依托泊苷；b同种异体的骨髓移值；c甲氨喋呤/长春新碱/6-巯嘌呤；d9-cis维生素A酸加M195(抗CD33单元隆抗体)。
7．实施例临床应用于淋巴瘤根据最初发现的三氧化二砷在试管中对B-细胞的抗肿瘤效应，本发明人治疗了一位经过各种形式的普通治疗、包括自体固有骨髓移植而复发的患有中度大细胞淋巴瘤的病人。尽管在开始三氧化二砷治疗前他的病进展很快，在用三氧化二砷治疗后，他的癌性淋巴结和脾的大小出现了较大的(＞50％)收缩，同时也伴随着他生活质量的较大改善。
8．实施例临床应用于非造血性癌(non-hematopoieticcancer)三氧化二砷也被用于治疗结肠癌。在初步试验中，有一名患结肠癌的病人接受了一次三氧化二砷治疗，显示出他的血清CEA(癌胚的抗原)水平有了很大降低。该病人接受了每公斤体重每天0.1～5mg三氧化二砷静脉内输注，每天一次共5天。观察到CEA水平由19，901ng/ml变到15，266ng/ml，减少了23％。众所周知血清CEA水平降低是与抗肿瘤反应相联系的。
临床资料确认，三氧化二砷也可用来治疗其它的非造血性癌、如结肠癌。
9．实施例药物动力学研究进行了几项确定剂量范围的研究，来考察As2O3在APL患者和其它血液病患者中的药物动力学(PK)和生物学效应。在APL病人中，借助于对免疫表型、现场杂交荧光(FISH)、与凋亡相伴的蛋白-caspase 1、2和3的西部吸印表达的流动细胞计数，来对骨髓单核细胞进行一系列的监视。共同表达CD11b和CD33的细胞和用FISH分析查明，带有t(15；17)易位的细胞在治疗期间进行性地增加，并且在完全缓解的早期继续存在。As2O3还在活体中诱导出了caspase 2和caspase 3的前酶的表达，并使caspase 1和caspase 3均激活。对血和尿进行的元素砷(As)PK分析显示，As在全血中既分布在血浆中、也分布在红血细胞部分中。平行消除曲线(parallelelimination curve)说明，这2个区室是可以自由交换的，并且从开始的半衰期约60分钟的峰值向下衰变。第1天的平均AUC约为400ng·h/ml。在第一个24小时内，大约20％的给药剂量在尿内被重新找到。
然后我们就开始对患有除APL以外的病症的病人进行确定剂量范围的研究，采用的剂量水平为每公斤体重每天0.1至0.15mg静脉输注，一个疗程累积日数为25日，每3～5周做一个疗程。至今已收治过10个病人，包括患有CLL(2人)、AML(3人)、淋巴瘤(4人)和CML(1人)的病人。5个病人在早期已被退出该项研究，因为他们的病情进展很快，而5个人完成了计划的25天疗程。在该剂量范围内，该药物被证明是能很好地耐受的，不利的效应包括皮疹、在输注时头晕、乏力、以及心电图上QTc延长。这项正在进行的研究显示出，临床应用As2O3能诱发APL的局部分化和凋亡，但是该药剂的治疗效应并不限于这一种病。
本发明并不限于已描述的特定实施方案的范围。的确，对本领域的技术人员来说，从以上描述中会很明白，在已描述的内容中可加进本发明的各种各样的改进。这样的改进应该归属于所附权利要求的范围之内。
说明书中提到过多种出版物，它们所公开的内容全文都以参考文献的形式引入。
权利要求
1．一种治疗人的急性骨髓性白血病的方法，它包括给予急性骨髓性白血病病人治疗有效量的三氧化二砷。
2．一种治疗人的慢性骨髓性白血病的方法，它包括给予慢性骨髓性白血病病人治疗有效量的三氧化二砷。
3．一种治疗人的硬质癌的方法，它包括给予硬质癌病人治疗有效量的三氧化二砷。
4．权利要求3的方法，其中硬质癌是指消化道癌、软组织癌、食管癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、脑癌、骨癌、乳腺癌、或前列腺癌。
5．一种治疗人的对类维生素A治疗有抗药性的白血病的方法，它包括给予需要的病人治疗有效量的三氧化二砷或米拉索普(melarsoprol)。
6．一种治疗人的白血病、淋巴瘤或硬质肿瘤的方法，它包括给予需要的病人治疗有效量的米拉索普。
7．权利要求1、2、3、4或5的方法，其中每天三氧化二砷的给予量为约2.5-4.5mg。
8．权利要求1、2、3、4或5的方法，其中每天的给药量为病人每公斤体重约0.15mg的三氧化二砷。
9．权利要求1、2、3、4或5的方法，其中三氧化二砷是用静脉内输注法给药。
10．权利要求1、2或5的方法，其中三氧化二砷是每天重复给药，直到观察出病人的骨髓缓解为止。
11．权利要求10的方法，它还包括在3至6周内重复暂停治疗一到十次的步骤，并恢复三氧化二砷每天给药每周五至七次，累积日数共25天。
12．权利要求1、2或5的方法，其中也给予病人全反维生素A酸。
13．权利要求3或4的方法，其中三氧化二砷每天重复给药共5天。
14．权利要求13的方法，该方法每月重复一次。
15．权利要求6的方法，其中每天米拉索普的给药量为病人每公斤体重约0.5至5mg。
16．一种制造适合人服用的、含有三氧化二砷的、无菌药用组合物的方法，它包括(a)将三氧化二砷溶解在pH值大于12的水溶液中；(b)用盐酸把该三氧化二砷溶液中和到pH值约为8.5；(c)将步骤(b)的三氧化二砷溶液在药用载体稀释，该载体使pH值稳定并降到约7；以及(d)将该药用组合物消毒；
17．一种适合于注入人体的无菌药用组合物，其中含有置于药用载体中的三氧化二砷和葡萄糖。
18．权利要求17的药用组合物，它含有1mg/ml的三氧化二砷。
全文摘要
本发明涉及用砷化物来治疗多种白血病、淋巴瘤和硬质肿瘤。另外,该砷化物也可与其它治疗剂如类维生素A结合使用。本发明还提供出生产三氧化二砷制剂的方法。
文档编号A61K31/53GK1285743SQ98813016
公开日2001年2月28日 申请日期1998年11月10日 优先权日1997年11月10日
发明者小R·P·瓦雷尔, P·P·潘多菲, J·L·加布里洛维 申请人:斯隆－凯特林纪念癌症中心