专利名称：光叶合欢抗癌药物及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物，特别是涉及一种含有植物光叶合欢提取物的抗癌药物组合物及其制备。
迄今临床使用的抗癌药物有环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、喜树碱、长春新碱、紫杉醇等。但在癌症治疗中，固型癌(实体瘤)对各种抗癌药物特别容易产生耐药性。因此，对可治疗固型癌(实体瘤)的新型抗癌药物需求极为迫切。
光叶合欢系豆科含羞草亚科合欢属植物，学名Albiza lucidior Nielsen(中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志，科学出版社，1988年，北京，第39卷，第56～70页)。中药合欢皮系同属植物合欢Albizia julibrissin Durazz的干燥树皮，具有解郁、和血、宁心、消痈肿的功用，合欢的花和花蕾具有与合欢皮类似的功用[江苏新医学院，中药大辞典，上海人民出版杜，1977年，上册，第937～938页]。合欢及其同属植物大叶合欢、亮叶合欢、驱虫合欢、铁锈合欢、托叶合欢、香须树、南洋楹、白格等多种植物的活性成分及其生物活性已有很多报道(邹坤等，国外医药植物药分册，1997年第12卷第5期，200～206页)。但作为同属植物的光叶合欢却一直未作药用，也未见任何有关研究报道。
本发明的目的是发掘光叶合欢抗癌尤其抗固型癌的用途，研制一类含有光叶合欢的抗癌药物以及细胞凋亡诱导剂和细胞周期抑制剂。
本发明首次发现光叶合欢具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制细胞周期等抗癌作用，可将光叶合欢提取物与可药用载体和/或赋形剂组合，制成一类新的抗癌药物以及细胞凋亡诱导剂和细胞周期抑制剂。尤其本发明首次发现的光叶合欢对固型癌细胞的细胞凋亡诱导作用，可使其被制成治疗实体瘤有效的抗癌新药。
以下详细说明本发明将光叶合欢用不同极性的有机溶剂或水提取。将提取液过滤，浓缩，得到各种提取物。有机溶剂可以是甲醇，乙醇，丙醇，丁醇等醇类，也可以是二氯甲烷，氯仿等卤代烷类，乙酸乙酯，乙酸丁酯等酯类或丙酮等。
生物活性试验试验采用人慢性骨髓性白血病细胞K562细胞株、人组织淋巴瘤细胞U937细胞株、人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞株、人大肠癌细胞HCT-15细胞(固型癌细胞)株以及小鼠乳腺癌温敏细胞tsFT210细胞株。各种细胞均用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(每毫升含100微克青霉素和100微克链霉素)传代，在通入5％二氧化碳的动物细胞培养箱中培养，K562、U937、HL-60及HCT-15等人癌细胞在37℃下，tsFT210细胞则在32℃下培养。
活性试验采用四甲基偶氮唑盐(略称MTT)法、细胞及其核内染色体的形态学特征检测法、细胞颗粒粒度分布检测法、DNA梯状带的凝胶电泳检测法以及流式细胞术等分子细胞生物学手段，检测药物对癌细胞的增殖及细胞周期的直接影响和诱导癌细胞凋亡的作用。为了解药物对癌细胞诱导凋亡的作用机理，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及细胞微生理感应检测法(Cytosensor Microphysiometry)，探讨了药物对凋亡相关基因bcl-2转录信号系统的影响以及癌细胞在完整活细胞状态下对药物的反应特点。阳性药物使用目前临床治疗固型癌效果最佳的顺铂。
生物活性试验测得的有关数据采用组间t检验法进行统计学处理。
生物活性试验结果表明，光叶合欢的各提取物对受试癌细胞均有明显的增殖抑制作用，诱导癌细胞凋亡作用以及对细胞周期的选择性阻断作用，各提取物的最低有效终浓度在6.25～25微克/毫升之内。有关诱导凋亡机理的初步研究结果表明，光叶合欢诱导癌细胞凋亡的机理与顺铂不同，凋亡相关基因bcl-2转录信号系统不介导光叶合欢诱发的癌细胞凋亡过程，提示光叶合欢可能通过作用于细胞膜上的死亡受体或通过影响细胞代谢的某一环节诱发癌细胞凋亡。
实施例光叶合欢提取物的制备取光叶合欢的干燥茎皮100克，用1000ml溶剂反复提取三次，合并提取液，过滤后，减压蒸馏浓缩，得光叶合欢提取物。所用溶剂和产物重量如下
以上提取物分别用于下述有关生物活性试验。
1.对人癌细胞株K562、U937、HL-60细胞增殖的抑制活性试验样品均用80％甲醇配制成10mg/ml的母液，存于-20℃冰箱中，临试验时用80％甲醇稀释成2mg/ml浓度或所需不同浓度的溶液供用。阳性对照药顺铂(cisplatin，简称cDDP；Sigma公司产品)用二甲基亚砜(以下简称DMSO)配制成2mg/ml的母液，存于-20℃冰箱中，在每次试验前临时用无菌双蒸水稀释成1mg/ml的溶液，供试验使用。MTT(Signma公司产品)用磷酸缓冲生理盐水(Phosphate-Buffered Saline，以下简称PBS)溶液配成5mg/ml浓度的溶液，存于-20℃冰箱中备用。
取对数生长期细胞，用新鲜RPMI-1640培养液稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，将此细胞液接种到96孔板中，每孔分注100μl，置于5％CO2培养箱中，37℃培养4小时，每孔加入受试样品液或阳性对照顺铂溶液各5μl，每种样品或顺铂均设两个复孔，同时设复孔空白对照，于二氧化碳培养箱中37℃培养24小时。每孔加入5mg/ml的MTT液10μl，于二氧化碳培养箱中37℃培养4小时，4℃、2000rpm离心5分钟，吸去上清后，每孔加入100μl DMSO，37℃孵育约10分钟，待结晶溶解完全后，用定时微量振荡器振荡约1分钟，利用酶标仪测定各孔于570nm处的光密度(以下称OD)值。
取每一种样品复孔OD值的平均值，按如下公式计算细胞增殖抑制率抑制率＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％结果见表1及表2。表1 光叶合欢三种提取物(终浓度100μg/ml)对癌细胞增殖的抑制活性
表2 光叶合欢提取物ALN对K562细胞的细胞增殖抑制活性<
>***组间t检验统计学处理结果，与空白组比较有显著性差异(P＜0.001)
表1和表2中所示结果表明，光叶合欢的各提取物对受试的K562、U937、HL-60等人癌细胞均有很好的抗癌活性，而且，ALN对K562细胞的作用呈良好的量效关系，用NDST软件计算结果，ALN对K562细胞的半数抑制增值浓度(IC50)为29.04±12.67μg/ml。
2.光叶合欢提取物ALN诱导K562细胞凋亡的形态学特征光叶合欢的含水醇提取物ALN和阳性对照药物cDDP，分别用80％甲醇和DMSO配制成10mg/ml的溶液备用。荧光试剂Hoechst 33258(从Sigma公司购入)用PBS溶液配制成5μg/ml浓度的溶液，冰箱中避光保存备用。
取对数生长期的K562细胞，用新鲜的RPMI-1640培养液(含10％灭活小牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，将细胞液接种于12孔板中，每孔分注1毫升，于5％二氧化碳培养箱中37℃培养4小时后，随机分组加样，每孔加入5μl样品液，平行设阳性对照cDDP和空白对照，于5％二氧化碳培养箱中37℃培养所需时间。
相差光学显微镜下的细胞形态学特征检测从二氧化碳培养箱中取出用药物处理不同时间后的细胞，直接置于显微镜下，目镜×物镜(10×20)条件下观察细胞形态学特征变化。
荧光显微镜下的细胞形态学特征检测将药物处理不同时间的K562细胞从12孔板中分别移至Eppendorf离心管中，4℃、2000rpm离心5分钟，收集细胞，加入0.5％KCl溶液500μl，室温静置15分钟后，4℃、2000rpm离心5分钟，吸去上清，加入甲醇-乙酸(3∶1)的固定液100μl，4℃固定10分钟，同法离心，吸去部分上清，将细胞滴于载玻片上，待稍干燥后，滴加一滴Hoechst 33258溶液，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，照相。
结果相差光学显微镜下观察，50μg/ml ALN及50μg/ml顺铂处理的K562细胞，细胞形态随药物处理的时间发生明显的变化，初始细胞有胞体邹缩、“出芽(blebbing)”现象，随着作用时间的加长，观测到细胞呈胞膜裹着的许多雪花状小泡，最终形成许多散在的凋亡小体。药物处理24小时后，ALN组中细胞产生的凋亡小体占绝对多数，视野中的正常细胞明显减少。Hoechst33258染色后荧光显微镜下检测也给出平行结果，ALN及顺铂处理组细胞中可观测到许多凋亡细胞特征性的散在的细胞核DNA荧光斑点。用50μg/mlALN及50μg/ml顺铂处理24小时的K562细胞经Hoechst 33258染色后荧光显微镜下检测的结果，与对照组相比，顺铂及ALN处理组细胞中可见许多凋亡细胞DNA的特征性荧光斑点，而且，ALN组几乎所有细胞都已发生了凋亡。
3.光叶合欢提取物ALN诱导K562细胞凋亡作用的颗粒粒度分布法检测将用药物处理不同时间后的K562细胞从12孔板中分别移至Eppendorf离心管中，4℃、2000rpm离心5分钟，收集细胞，各组细胞分别用生理盐水稀释相同倍数，用Coulter Multisizer II型全自动颗粒粒度分析仪(美国Coulter公司产品)，检测细胞体积大小分布；检测采用相同虹吸体积的检测方法，每次检测的细胞液体积为500微升。
结果用库尔特全自动颗粒粒度分析仪，对粒径分布进行分析，能有效地检测细胞凋亡情况，当细胞凋亡时，细胞体积开始缩小，后期形成小的细胞碎片即凋亡小体，使细胞大小分布移向小颗粒一端。本实验中，正常K562细胞群多数分布在10～20μm区间内，而药物处理后的细胞，由于发生凋亡，形成了凋亡小体，小于8μm的小颗粒的分布明显增多，此区间小颗粒占总体颗粒数的比值可用于考察凋亡小体的生成率。
本实验中，K562细胞经光叶合欢提取物ALN及顺铂分别处理不同时间后，10～20μm区间内正常细胞计数占总颗粒计数的百分数及小于8μm的凋亡小体颗粒计数占总颗粒计数的百分数分别归纳如表3和表4所示。表3药物处理不同时间后的K562细胞中正常细胞占总颗粒计数的百分数<
>星号表示与对照组比较有显著性差异**P＜0.001***P＜0.001表4 药物处理不同时间后的K562细胞中凋亡小体占总颗粒计数的百分数
星号表示与对照组比较有显著性差异**P＜0.01***P＜0.001表3和表4的结果表明，光叶合欢提取物ALN 50μg/ml处理6～24小时均能明显地诱导K562细胞发生凋亡，处理12小时诱导凋亡达高峰，而且，ALN的诱导凋亡作用比同剂量的顺铂还要强而迅速。
4.光叶合欢提取物ALN诱导癌细胞凋亡作用的琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡时发生一系列生化学变化，其中DNA发生规律性降解并在琼脂糖凝胶电泳中呈梯状带，是凋亡所特有的现象，也是细胞凋亡生化学检测的重要指标之一。因此，用DNA琼脂糖凝胶电泳法，考察了光叶合欢含水醇提取物ALN作用于K562细胞及固型癌HCT-15人大肠癌细胞时引起的DNA规律性降解的情况。
细胞培养和药物处理固型癌HCT-15细胞为贴壁细胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(内含100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)传代，在5％CO2培养箱中37℃培养。取对数生长期的HCT-15细胞，用胰酶(GIBCO公司产品)消化后，再用新鲜的RPMI-1640培养液稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，并接种于6孔板中，每孔分注3ml，在二氧化碳培养箱中37℃培养4小时后，随机分组加样，每孔分别加入样品液或阳性对照药物顺铂溶液各15μl，在5％CO2培养相中37℃培养24小时。另外，K562细胞的培养及药物处理过程，除不用胰酶消化外基本与HCT-15细胞相同。
细胞处理及琼脂糖凝胶电泳分别收集药物处理后的HCT-15及K562细胞，加入细胞裂解液[100mM Tris-HCl(pH8.5)，5mM EDTA，0.2M NaCl，0.2％SDS含终浓度为0.2mg/ml的蛋白酶K]，37℃静置过夜，加入5M NaCl溶液至NaCl的终浓度1.5M，4℃下12000rpm离心15分钟，去除蛋白质等大分子沉淀，取上清液，加入无水乙醇至乙醇终浓度75％，于4℃静置4小时，4℃、12000rpm离心15分钟，吸去上清，取沉淀即DNA，加入适量TE[Tris-HCl和EDTA(乙二胺四乙酸)]缓冲液溶解，加入1mg/ml的RNAase使终浓度达200μg/ml，37℃静置2小时，加入适量DNA电泳加样缓冲液[10mMEDTA(pH8.0)，1％(w/v)琼脂糖，0.25％溴酚蓝，40％蔗糖]，点样于2％琼脂糖凝胶中，70V电泳1小时。用5μg/ml溴化乙啶液染色10分钟后，在紫外透射反射仪下检测，并利用电泳凝胶自动成像系统拍照。
结果用50μg/ml ALN处理K562细胞及HCT-15细胞24小时，提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳，均检测到细胞发生凋亡时由于DNA的规律性降解而形成的梯状带。结果表明，光叶合欢不仅能诱导K562细胞发生凋亡，而且也能诱导固型癌HCT-15细胞发生凋亡。
5.光叶合欢提取物ALN诱导癌细胞凋亡及对细胞周期抑制作用的流式细胞术分析在细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，使DNA发生有规律的广泛降解、断裂，DNA的结构发生剧变，最终形成含有不同大小的DNA断片的凋亡小体，流式细胞术(FCM)可以检测细胞体DNA的这种变化。另外细胞凋亡与细胞周期的关系非常密切，细胞凋亡往往发生在细胞周期中的某一环节。FCM法可以同时检测凋亡以及细胞周期的变化情况，所以利用FCM法探讨了光叶合欢含水醇提取物ALN作用后的癌细胞的变化情况。(1)ALN对K562细胞的诱导凋亡及细胞周期抑制作用材料和仪器碘化丙啶(Propidium Iodide略称PI，Sigma公司产品)；库尔特EPICS XL型四色流式细胞仪(美国Coulter公司产品)。
样品液的配制受试药物ALN样品用80％甲醇配制成20mg/ml、10mg/ml及5mg/ml的溶液，阳性药物顺铂用DMSO配制成10mg/ml溶液备用。
方法和结果细胞培养和药物处理取对数生长期的K562细胞，用新鲜RPMI-1640培养液(含20％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，接种于12孔板中，每孔分注2ml，于通入5％CO2的培养箱中37℃培养4小时，随机分组加样，每孔分别加入不同浓度的样品液或阳性对照药物顺铂溶液各10μl，CO2培养箱中培养所需不同时间。
细胞处理和流式细胞术分析将12孔板中的细胞液转移至Eppendorf离心管中，离心收集药物处理后的K562细胞，PBS洗后，用70％乙醇固定过夜，4℃、7000rpm离心15分钟，吸去上清，加入1mg/ml的RNA酶A溶液200μl，37℃消化30分钟，PBS洗涤，离心5分钟，吸去上清，加入5mg/ml的碘化丙啶试液200μl，4℃染色30分钟，用PBS适量稀释后，用流式细胞仪在汞激光激发波长488nm下进行分析，每份标本至少检测三万个细胞。
结果用ALN处理细胞的实验结果见表5。终浓度为25、50及100μg/ml的ALN均能明显地诱发K562细胞发生凋亡，作用12及24小时后，K562细胞的凋亡百分率与相应时间的空白组相比均有统计学意义，存在明显的时间依赖性和剂量依赖性(参见表5)，而且，ALN(25μg/ml，24小时)诱导K562细胞发生凋亡的作用比阳性对照药物顺铂(50μg/ml，24小时)还要强。另外，ALN对K562细胞的细胞周期也有一定的影响，低剂量(25μg/ml作用6及12小时)及短时间作用(50及100μg/ml作用6小时)，使G2/M期细胞增多，但随着作用时间加长，主要呈现诱导细胞凋亡的作用。
表5 ALN处理K562细胞引起细胞凋亡的流式细胞术分析结果
星号表示与对照组比较有显著性差异**P＜0.001***P＜0.001(2)对tsFT210细胞的凋亡诱导及细胞周期抑制作用样品液的配制ALN样品用80％的甲醇配制成10mg/ml的溶液，阳性药物紫杉醇用甲醇配制成1.5mg/ml溶液备用。
细胞培养和药物处理取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，接种于12孔板中，每孔分注1ml。每孔细胞液中分别加入样品液或阳性对照药物紫杉醇溶液各10μl，于5％CO2培养相中32℃培养17时间。
细胞处理和流式细胞术分析将12孔板中的细胞液转移至Eppendorf离心管中，4℃、3000rpm离心3分钟，收集药物处理后的细胞，每管加PBS液1毫升，振荡，4℃、3000rpm离心3分钟，吸去上清，加入5mg/ml的碘化丙啶试液(含浓度为1mg/ml的RNA酶A)300μl，4℃染色30分钟后，用流式细胞仪进行分析。
结果终浓度为100μg/ml的ALN使大部分tsFT210细胞被阻断在细胞周期的G2/M期上，同时也使少部分细胞发生凋亡。
6.光叶合欢提取物ALN对bcl-1基因mRNA转录水平的影响细胞凋亡是一个基因调控的过程，其间有P53，bcl-2，c-myc及bax等多种基因和蛋白的参与和表达，其中bcl-2基因编码一个26KD的细胞内膜蛋白，该蛋白定位于内质网、线粒体和核膜。多种放、化疗因素诱发肿瘤细胞凋亡都伴有bcl-2蛋白表达水平的下降，表明bcl-2基因表达系统与诱导癌细胞凋亡相关联。TR-PCR法可以通过检测基因转录的mRNA量的变化，间接反映相应蛋白表达量的变化，因此，利用TR-PCR法考察了ALN在诱发HCT-15细胞凋亡的过程中，对bcl-2基因转录mRNA水平的影响。(1)材料和仪器试剂30次反应包装的总RNA提取试剂盒(博大公司产品)，RT-PCR反应试剂盒(Promega公司产品)，bcl-2上下游引物(由军事医学科学院提供)仪器Gene Amp PCR system 9700型PCR仪(美国PE公司产品)，F200AX4 06CM型制冰机(Cole-Parmer公司)。
样品液的配制ALN样品用80％甲醇分别配制成20mg/ml和10mg/ml的溶液，阳性药物顺铂用DMSO配制成10μl/ml的溶液备用。(2)方法和结果细胞培养及药物处理取对数生长期HCT-15细胞，胰酶消化后，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(内含100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，接种于10cm培养皿中，每孔8ml，在二氧化碳培养箱中37℃培养4小时后，随机分组加样，每孔加入样品液40μl，同时设阳性对照顺铂和空白对照，在二氧化碳培养箱中37℃培养24小时。
总RNA的提取按试剂盒说明提取总RNA，具体操作如下收集药物处理后的HCT-15细胞，放入1.5ml Eppendorf离心管中，加入1ml Trizol(酸性异硫氰酸胍)试剂，用Vortex旋涡振荡器充分振荡混匀，冰浴静置5分钟，加入350μl氯仿，充分振荡，稍静置出现分层后，随即于4℃、12000rpm离心15分钟。将上清(水相)转移至另一支1.5ml Eppendorf管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇混匀，-20℃放置1小时，4℃、12500rpm离心20分钟，取沉淀即总RNA，加入0.25ml 75％乙醇洗涤一次，去乙醇，真空抽干，然后加入0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水40μl溶解沉淀，-20℃保存备用。
总RNA浓度测定及质量评价冰上解冻所提取的总RNA，取5μl用超纯水稀释一定倍数，以超纯水为背景blank，利用酶标仪检测260nm及280nm处的OD值。计算OD260/OD280值，来评价总RNA的质量及纯度，以OD260/OD280接近于2者为最好。另外，浓度为40mg/ml的总RNA溶液的OD260等于1，因此，可按公式[总RNA的浓度(mg/ml)＝OD260×40×稀释倍数]来计算总RNA的浓度，并由此计算每微升总RNA相当于多少微升总RNA溶液。
反转录PCR反应反应原料如下
反应原料中补加0.1％DEPC水至总体积45μl，分装为三管，每管15μl，每管分别加入1μg量的总RNA模板，再补加水至20μl，转移到PCR仪上反应，反应条件如下48℃ 45min，94℃ 2min，(94℃ 30sec，60℃ 1min，68℃ 2min)×40次循环，68℃ 7min，4℃(soak)
反应产物cDNA的检测取10μl反应产物，加入5μl 2×DNA电泳加样缓冲液[10mM EDTA(pH8.0)，1％(w/v)琼脂糖，0.25％溴酚蓝，40％蔗糖]，全部点样于2％琼脂糖凝胶上，70V电泳1.5小时，紫外透射反射仪检测并照相。
试验结果总RNA的浓度测定及质量评价ALN实验中提取的总RNA稀释261倍后，利用酶标仪检测260nm及280nm处的OD值，OD260/OD280比值均在2附近(参见表6)，表明所提取的总RNA质量较好，可以进行下一步的RT-PCR反应。
表6总RNA浓度及质量测评结果
RT-PCR反应产物电泳后的实验结果用50μg/ml ALN处理HCT-15细胞的RT-PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后，在300bp处出现与空白组同样的条带(反转录PCR产物cDNA)，条带宽度基本相同，而cDDP 50μg/ml处理的HCT-15细胞未检测到300bp处的cDNA。
7.光叶合欢提取物ALN对细胞代谢的影响细胞每时每刻都在进行物质和能量代谢，代谢过程中产生H+。H+主要来源于糖酵解产生的乳酸及呼吸产生的二氧化碳。在体外培养条件下，糖酵解的碳源主要是葡萄糖，而呼吸过程中的碳源则主要是谷氨酸和丙酮酸盐。代谢产生的乳酸及二氧化碳由载体蛋白以离子的形式转运到细胞膜外或者被动扩散到细胞膜外，最终形成H+。微生理感应仪(Cytosensor Microphysiometer)通过Biosensor可直接检测H+浓度的变化情况即细胞外的酸化率ECAR，以此反映细胞代谢状况，提供活细胞即时动态反应信息。因此，为了确切地反映癌细胞在药物作用下的真实情况，用微生理感应仪在完整的活细胞状态下，直接检测了ALN对HCT-15大肠癌细胞的作用特点。(1)材料和仪器仪器Cytosensor Microphysiometer(美国molecular device公司)。
试剂RPMI-1640培养液，不含有碳酸氢钠和血清(低缓冲能力)。
样品液的配制受试样品ALN和阳性对照药物顺铂分别用80％甲醇和DMSO配制成10mg/ml的溶液备用。临试验时，用running buffer(低缓冲能力RPMI-1640培养液)稀释成终浓度为50μg/ml的样品缓冲液供用。(2)方法和结果方法取对数生长期K562细胞，用新鲜的RPMI-1640培养液(含20％小牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，每一个Capsule cup中加入1ml细胞液，于二氧化碳培养箱中37℃培养过夜，细胞贴壁后，轻轻放上spacer及insert，insert内加满runningbuffer(低缓冲能力RPMI-1640培养液)使之下沉，将此cell cup放入sensorchamber(预先加入1ml running buffer，37℃预热)内，开机检测，开始开启running buffer冲洗，待RATE DATA基线平稳后，切换成含药缓冲液冲洗，检测药物对细胞外酸化率的变化，酸化率以加药前的酸化率的百分数表示(即加药前为100％)。
结果实验结果表明，50μg/ml的ALN和顺铂均能降低HCT-15细胞的细胞外酸化率(ECAR)，即细胞代谢率。阳性药顺铂作用4.23小时后，ECAR降至最低值15.9％，而ALN则作用0.62小时后，ECAR即降至最低值3.0％，之后继续给药，二者的ECAR均保持平稳，不再变化。总之，ALN的作用要比顺铂即快又强，ALN(50μg/ml)＞cDDP(50μg/ml)。
权利要求
1.一种抗癌药物组合物，其特征是该组合物含有有效量的光叶合欢提取物及可药用载体和/或赋形剂。
2.权利要求1所述的药物组合物，其特征为所述光叶合欢提取物的制备方法是，用有机溶剂、含水有机溶剂或水提取光叶合欢的干燥茎皮，并将提取液过滤、浓缩而成。
3.权利要求2所述的药物组合物的制备方法中，所述有机溶剂是醇。
全文摘要
本发明涉及一种含有植物光叶合欢提取物的抗癌药物及其制备方法。本发明首次发现光叶合欢具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制细胞周期等抗癌作用,尤其对固型癌细胞的细胞凋亡诱导作用。将光叶合吹提取物与可药用载体和/或赋形剂组合,可以制成一类新的抗癌药物以及细胞凋亡诱导剂和细胞周期抑制剂。
文档编号A61P35/00GK1259377SQ99124998
公开日2000年7月12日 申请日期1999年12月27日 优先权日1999年12月27日
发明者蔡兵, 崔承彬, 张华凤, 李文欣, 曲戈霞, 姚新生, 吴春福 申请人:北京生物医药研究所