专利名称：幽门螺杆菌抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种得自幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)的抗原。也提供了这种抗原作为免疫原、以及包含它的药物组合物，尤其是疫苗的用途，同样地也提供了编码这种抗原的重组核酸分子、包含这种核酸分子的载体和携带这种载体的宿主。
幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其一直与慢性活动性胃炎和消化性溃疡有很强的牵连(Marshall等人，澳大利亚医药杂志(Medical Journalof Australia)，142439-444(1985)；Buck，G.E.，临床微生物杂志(Journalof Clinical Microbiology)，31-12(1990))。幽门螺杆菌抗原领域最初的研究焦点是为了诊断的目的。但是，兴趣也集中在提供对抗这种常见生物体有效的疫苗的需要上。许多提交的专利编档已公布了用于这种疫苗的候选抗原，包括WO96/25430，WO98/32768和UK专利申请第9806039.5号。
但是，始终有提供进一步抗原的需要，以确保任一疫苗对全部的菌株具有最完全的可能的效力、特异性和防护。现在我们已经分离和鉴定了一种对幽门螺杆菌感染显示较好的保护性质的抗原。
因此，本发明首先提供了一种幽门螺杆菌抗原蛋白质，其在还原性或非还原性条件下经SDS-PAGE测量的分子量为35kDa，并且具有如下氨基酸序列MAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVELIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKPLIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYAVFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK.
本发明的蛋白质可以以基本上纯的形式提供。例如，其可以以基本上不含其它蛋白质的形式提供。
如此处所述，本发明的蛋白质作为抗原物质是有用的。这种材料可是“抗原的”和/或“免疫原性的”。一般，“抗原的”是指这种蛋白质能够被用来提高抗体或在受试者中真正地能够诱导抗体应答。“免疫原性的”是指这种蛋白质能够在受试者中引起保护性的免疫应答。因此，在后一种情况下，这种蛋白质可能不仅是能产生抗体应答，另外，也能产生非基于抗体的免疫应答。
本领域技术人员将领会本发明蛋白质的同源物或衍生物在本发明的上下文中同样地有用，即作为抗原的/免疫原性的物质。因此，例如包括一个或多个添加、缺失、替代等等的蛋白质包含在本发明之中。另外，也可能以另一个相似“类型”的氨基酸替代一个氨基酸。例如用其它的氨基酸替代一个疏水的氨基酸。
可以使用程序如CLUSTAL程序来比较氨基酸序列。这种程序比较氨基酸序列并通过以适当的方式在两个序列中的任一个插入一个间隔来发现最理想的排列比较。能够计算最理想排列比较的氨基酸的同一性或相似性(同一性加氨基酸型的保守)。象BLASTx这样的程序将排列比较相似序列的最长延伸，并且分配适合的分值。因此可能获得在其中发现了每个都具有不同分值的几个相似性区域的比较结果。两种类型的同一性分析都在本发明的考虑之列。
就同源物和衍生物来说，同源物或衍生物应保有的最初蛋白质的抗原性或免疫原性比此处描述的蛋白质的同一性程度显得更为重要。但是，适当地，提供了与此处描述的蛋白质或多肽具有至少60％相似性(如上讨论)的同源物或衍生物。优选地，提供至少具有70％相似性的同源物或衍生物，更优选地至少具有80％相似性。更优选地，提供至少具有90％或甚至95％相似性的同源物或衍生物。
另一种可供选择的方法，同源物或衍生物可以是融合蛋白，整合部分使得纯化更容易，例如通过有效地给想要的蛋白质或多肽加标签。可能需要去除“标签”或者是融合蛋白质本身保有足够的有用的抗原性。
在本发明的附加方面提供了的本发明蛋白质的抗原/免疫原性的片段，或其同源物或衍生物的片段。
对于此处描述的蛋白质或多肽的片段，或其同源物或衍生物的片段，情况稍有不同。众所周知有可能筛选一个抗原蛋白质或多肽来鉴定表位区域，即负责蛋白质或多肽的抗原性或免疫原性的那些区域。进行这种筛选的方法为本领域所熟知。因此，本发明的片段应包括一个或多个这样的表位区域或与保有它们的抗原/免疫原性特性的这种区域足够相似。因此，对于按照本发明的片段，同一性的程度可能是不相干的，因为它们对于如此处所描述的蛋白质或多肽、同源物或衍生物的特定部位可能是100％的相同。再一次地，关键问题是片段保有抗原/免疫原性的特性。
因此，对于同源物、衍生物和片段来说重要的是它们至少具有它们所衍生自的蛋白质或多肽的一些抗原性/免疫原性。
使用本发明的蛋白质的N-末端序列来筛选TIGR数据库。发现了一个匹配序列，命名为HP0310。蛋白质的功能是(并且事实上仍旧是)未知的，并且当然数据库没有提供关于它的抗原性/免疫原性的信息。
可以使用基因克隆技术来以基本上纯的方式提供本发明的蛋白质。例如，这些技术公布在J.Sambrook等人的分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社(1989)。因此，第三方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含或由如下组成(i)序列ATGGCAAAAGAAATTTTAGTGGCTTATGGTGTGGATATTGATGCGGTGGCTGGTTGGTTAGGGAGCTATGGTGGGGAGGATTCGCCTGATGATATTTCGCGCGGGCTTTTTGCGGGTGAAGTGGGGATCCCACGGCTTTTGAAATTGTTTAAAAAATACCATCTCCCGGCGACTTGGTTTTCGCCGGGGCATTCTATTGAAACTTTCTCTGAACAAATGAAAATGATCGTGGATGCAGGGCATGAAGTGGGCGCGCATGGGTATTCGCATGAAAACCCTATCGCTATGACGGCCAAGCAAGAAGAAGACGTTTTGTTAAAAAGCGTTGAGTTGATTAAAGATCTCACCGGCAAAG
CCCCCACAGGCTATGTGGCGCCGTGGTGGGAGTTTTCTAATATCACTAATGAATTGCTTTTAAAACACGGCTTCAAATACGACCACTCGCTCATGCACAATGATTTCACGCCCTATTATGTGCGCGTGGGGGATAGTTGGAGCAAGATTGATTATAGTTTGGAAGCTAAGGATTGGATGAAGCCTTTAATCCGTGGGGTGGAAACCGATCTGGTGGAAATCCCTGCGAACTGGTATTTGGACGATTTACCGCCGATGATGTTCATCAAAAAGTCCCCCAATAGTTTTGGTTTTGTAAGTCCGCACGATATAGGGCAAATGTGGATCGATCAATTTGATTGGGTTTATCGTGAGATGGATTATGCGGTGTTTAGCATGACAATCCACCCTGATGTGAGCGCCCGTCCGCAAGTGTTGCTCATGCATGAAAAAATCATTGAGCATATCAACAAGCACGAGGGCGTGCGTTGGGTAACATTCAATGAAATCGCTGATGATTTCTTAAAACGAAACCCTAGAAAAAAA.；(ii)与(i)中序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)的那些序列编码相同的蛋白质的序列；(iv)与(i)、(ii)或(iii)的任一个具有基本上同一性的序列；(v)编码如此处所描述的蛋白质的同源物、衍生物或片段的序列。
本发明的核酸分子可以包括多种这样的序列和/或片段。本领域技术人员将领会本发明能包括在此处作为例子的那些特定的新核酸分子的新变异体。这种变异体包括在本发明中。这些可以自然地发生，例如，因为菌株变异。例如，包括了添加、替代和/或缺失。另外，并且特别地当使用微生物表达系统时，人们可能希望通过使用已知在特定生物体中用于表达的偏好密码子来设计核酸序列。因此，合成的或非自然发生的变异体同样地包括在本发明的范围之内。
当为了确定同源性或同一性的程度的目的而比较核酸序列时可使用例如BESTFIT和GAP(两个都是来自威斯康星遗传学计算机组(GCG)软件包)的程序。例如，BESTFIT比较两个序列并且产生最相似部分的最理想的排列比较。GAP使得序列沿着它们的整个长度排列比较并通过以适当的方式在两个序列任一个各插入一个间隔来找到最理想的排列比较。适当地，在本发明的上下文中当讨论核酸序列的同一性时，通过沿着它们整个长度的序列比较的排列来进行比较。
优选地，具有基本上同一性的序列与上述序列至少具有50％的序列同一性，较合意地至少具有75％的序列同一性和更为合意地至少90或至少95％的序列同一性。在某些情况下序列同一性可以是99％或更高。
较合意地，术语“基本上同一性”指上述序列与此处描述的序列相比，比与现有技术领域的核酸序列相比具有更大程度的同一性。
但是应当指出，本发明在它的范围内包括编码此处描述的新的基因产物，或其新的部分的所有可能的序列。
核酸分子可以是分离的或重组的形式。可以将其整合到载体上，并且可以将载体导入到宿主中。这样的载体和适宜的宿主已经形成了本发明的另一方面。
于是，例如，通过使用以此处提供的核酸分子为基础的探针可以鉴定在幽门螺杆菌中的基因。然后可以用限制酶切割所述基因并克隆到载体中。可以将载体导入到适宜的宿主中用于表达。
本发明的核酸分子可以通过使用互补于核酸分子部分序列的适当的探针从幽门螺杆菌中获得。可以用限制酶或超声生处理技术来获得用作探针的适当大小的片段。
可供选择地，可以使用PCR技术来扩增想要的核酸序列。因此可以用此处提供的序列数据来设计用于PCR的引物，以便可以靶定包括其整个的基因或片段的想要的序列，并扩增到较高程度。
一般地引物至少有15-25个核苷酸长。
作为进一步供替代的选择，可以使用化学合成。这可以是自动化的。相对短的序列可以化学合成并连接到一起以提供一段较长的序列。
然而在另一方面，本发明提供了包含本发明的蛋白质、或其同源物或衍生物、和/或任何这些的片段的免疫原性/抗原组合物。在优选的实施方案中，免疫原性/抗原组合物是一种疫苗或是为在诊断测定中使用。
就疫苗而言，可以包含适宜的附加的赋型剂、稀释剂、佐剂等等。很多的这样的例子在本领域中是众所周知的。
也可能利用此处描述的核酸序列制备所谓的DNA疫苗。因此，本发明也提供了包含一种或多种如此处所定义的核酸序列的疫苗组合物。在本领域中描述了DNA疫苗(见例如，Donnelly等人，免疫学年度综述(Ann.Rev.Immunol.)，15617-648(1997))并且技术人员可以使用这种领域描述的技术按照本发明来生产和使用DNA疫苗。
另外，此处描述的蛋白质、其同源物或衍生物，和/或任何这些片段均可以在检测/诊断幽门螺杆菌的方法中使用。这种方法可以基于可能存在于受试者中的针对这类蛋白质的抗体的检测。因此本发明提供了用于幽门螺杆菌检测和诊断的方法，其包括使如此处所描述的蛋白质、或同源物、衍生物或其片段与要被测试的样品接触的步骤。适合地，样品是生物学样品，例如从将要被测试的受试者中得到的组织样品或血液或唾液样品。
作为一种可选择的方法，可以使用此处描述的蛋白、或同源物、衍生物和/或其片段来制备抗体，其反过来可以用于检测抗原，并且因此检测幽门螺杆菌。这样的抗体形成了本发明的另一个方面。在本发明范围之内的抗体可以是单克隆的或多克隆的。
当将如此处所描述的蛋白质、或同源物、衍生物或其片段注射到动物中时通过刺激多克隆抗体在适宜的动物宿主(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊或猴)中的生产能制备多克隆抗体。如果需要，可以将佐剂与蛋白质一起施用。众所周知的佐剂包括费氏佐剂(完全的和不完全的)和氢氧化铝。然后抗体可以通过它们结合于如此处所描述的蛋白质的优点来得到纯化。
单克隆抗体可以从杂交瘤中得到生产。这可以通过为了形成无限增殖细胞系而融合骨髓瘤细胞和产生所希望的抗体的脾细胞来形成。因此可以使用众所周知的Kohler和Milstein的技术(自然(Nature)256(1975))或后来的根据这种技术的变化。
用于产生结合于特定多肽/蛋白质的单克隆和多克隆抗体的技术目前在本领域已经成熟。它们在标准的免疫学教科书中进行了讨论，例如Roitt等人，免疫学第二版(Immunology second edition)(1989)，ChruchillLivingstone，London。
除完整抗体之外，本发明包括完整抗体的衍生物，其能够结合于如此处所描述的蛋白质等。因此，本发明包括抗体片段和合成的构建体。抗体片段和合成构建体的例子由Dougall等人在Tibtech 12 372-379(9月1994)中给出。
例如，抗体片段包括Fab、F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(这些在Roitt等人[如上述]中进行了讨论)。可以修饰Fv片段以产生被认为是单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这包括共价连接Vh和Vl区域的一个肽接头，其有助于分子的稳定性。可以使用的其它合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成的肽。也可以使用肽模拟物。这些分子通常是构象上受限制的有机环，其模拟CDR环的结构并且其包括抗原相互作用的侧链。
合成构建体包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或灵长类源化)抗体或其衍生物在本发明的范围之内。人源化抗体的例子是具有人构架区，但是啮齿类动物高变区的的抗体。例如Morrison等人在PNAS，81，6851-6855(1984)中和Takeda等人在自然(Nature).314，452-454(1985)中讨论了生产嵌合抗体的方法。
合成构建体也包括带有为分子提供了抗原结合以外的一些期望性质的附加部分的分子。例如所述部分可以是一个标记(例如荧光或放射性标记)。可供选择地，其可以是药学活性剂。
抗体或其衍生物在幽门螺杆菌的检测/诊断中有用。因此，在另一方面本发明提供了用于幽门螺杆菌检测/诊断的方法，其包括使能够结合于此处所描述的蛋白质、或其同源物、衍生物和/或片段的抗体与被测试的样品接触的步骤。
另外，可以使用所谓的“亲和抗体(Affibody)”。这些是从α-螺旋细菌受体结构域的组合文库中筛选的结合蛋白质(Nord等人，)。因此，能够特异地结合于不同靶蛋白质的小的蛋白质的结构域能使用组合方法筛选。
同样地清楚此处描述的核酸序列可用于检测/诊断幽门螺杆菌。因此，在更进一方面，本发明提供了幽门螺杆菌的检测/诊断的方法，其包括使至少一种此处描述的核酸序列与被测试的样品接触的步骤。较合适地，此样品是生物样品，例如，从受试者获得的组织样品或血液或唾液样品。这种样品在本发明的方法中使用之前可经预处理。因此，例如，样品可被处理来提取DNA。然后，基于此处描述的核酸序列的DNA探针(即一般为这种序列的片段)可用于检测来自幽门螺杆菌的核酸。
在附加方面，本发明提供了(a)一种给受试者接种抗幽门螺杆菌疫苗的方法，其包括给受试者施用本发明的蛋白质或其衍生物、同源物或其一个或多个片段，或本发明免疫原性组合物的步骤；(b)一种给受试者接种抗幽门螺杆菌疫苗的方法，其包括给受试者施用如此处所定义的核酸分子的步骤；(c)一种用于幽门螺杆菌感染的预防或治疗的方法，其包括给受试者施用本发明的蛋白质或其衍生物、同源物或其一个或多个片段，或本发明免疫原性组合物的步骤；(d)一种用于幽门螺杆菌感染的预防或治疗的方法，其包括给受试者施用如此处所定义的核酸分子；(e)一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其包含本发明的蛋白质、或同源物、衍生物或其一个或多个片段，或本发明的抗原组合物；和(f)一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其包括如此处所定义的的一个或多个核酸分子；(g)一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其包括一个或多个如此处所定义的一个或多个抗体；(h)一种本发明的蛋白质或其衍生物、同源物或其一个或多个片段，或本发明的抗原组合物在用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗的药物生产中的用途。
(i)如此处所定义的一个或多个核酸分子，或其一个或多个片段在用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗的药物生产中的用途。
仅在现在将参考下面的实施例来描述本发明，其不应以任何本发明范围限制的方式来构建。实施例涉及的图如下
图1a显示了从浓缩的幽门螺杆菌超声处理物的Mono Q阴离子交换色谱得到的典型的连续流动紫外吸收图。图中的竖条代表供进一步加工而收集的级分(级分11-14)；图1b显示了从幽门螺杆菌超声处理物的Mono Q分级分离收集的组分的典型的脲酶活性图。按照标准方法来确定酶活性。数据已经通过减去对照吸收值得到校正。
图1c显示了从Mono Q柱收集的级分11-14的SDS-PAGE分析。箭头指示了包含35kDa抗原的目的蛋白质的位置(级分11-13，下划线)。蛋白质标准从上到下是94kDa、67kDa、43kDa、30kDa、20.1kDa；图2a显示了从如图1所鉴定的选定Mono Q组分的Superose 6FPLC体积排阻色谱得到的典型的连续流动紫外吸收图。竖条代表供进一步加工而收集的级分(组分19-21)；图2b显示了在来自Mono Q柱的级分11-13中收集的蛋白质经Superose 6 FPLC分级分离后收集的级分中典型的脲酶活性图。
图2c显示了经Superose 6 FPLC后收集的级分的SDS-PAGE分析。35kDa的蛋白质存在于下划线和箭头所指示的级分18-21中。分子量标准从上到下为94kDa、67kDa、43kDa、30kDa、20.1kDa；图3显示了来自幽门螺杆菌的最终经过纯化的35kDa蛋白质的SDS-PAGE分析。分子量标准如所标记的那样；图4显示了每组用HP0310IPP免疫接种过的或未免疫接种过的小鼠之回收的活菌(平均值)；图5显示了HP0310基因PCR扩增和寡核苷酸序列的克隆；图6显示了RT-PCR扩增方案；图7显示了HP0310基因PCR产物(B)和在克隆载体pCR2.1中的克隆片段(C)的琼脂糖凝胶(电泳)；和图8显示了重组HP0310蛋白质表达的12％SDS-PAGE。(A)对照大肠杆菌蛋白质图，(B)表达HP0310抗原的重组大肠杆菌，(C)经过纯化的重组HP0310，和(D)经过纯化的天然HP0310。注意在重组HP0310中的大小的差异是由于组氨酸标签的存在。分子量标记如所指示的那样。
实施例1来自幽门螺杆菌的HP0310抗原的鉴定和分离1.1.方法细菌细胞培养幽门螺杆菌菌株NCTC11637在巧克力琼脂平板上培养，然后收获、洗和重悬于pbs缓冲液中(pH7.2)。
蛋白质纯化使用具有9.5mm探头的Sanyo Soniprep 150超声粉碎机对幽门螺杆菌细胞悬浮液进行超声处理。声幅水平设定在6μ米，并且机器使用25个由MSE程序计时器控制的30秒开和60秒关的循环运行。将用超声处理的制品在10,000g离心10分钟并且上清液通过0.45和0.22μm的滤器过滤。使用0.05M Tris缓冲液(pH8.2)和包含0.24M NaCl和1.0M NaCl的Tris缓冲液的两步梯度通过在Mono Q HR10/10柱(PharmaciaBiotech Ltd，Uppsala，瑞典)上的阳离子交换FPLC部分纯化超声处理的上清液。将包含50/52kDa的蛋白质级分合并、浓缩，且在Superose 6柱(Pharmacia Biotech Ltd，Uppsala，瑞典)上进行凝胶过滤FPLC。用0.05M Tris缓冲液(pH7.2)洗脱。将包含50/52kDa的蛋白质级分合并，并通过在DEAE-Sepharose CL6B(Pharmacia Biotech Ltd，Uppsala，瑞典)，和羟基磷灰石(Biorad Laboratories，Sydney，澳大利亚)上的低压液相色谱获得进一步纯化。
扼要地，将合并的Superose 6级分上样至用50mM Tris缓冲液(pH7.4)平衡的DEAE-Sepharose CL6B的小(2.5ml)柱上，用此缓冲液彻底冲洗，然后用包含补加有25，50和75mM NaCl的50mM Tris(pH7.4)的梯度按顺序洗脱。将最后一步的梯度洗脱物上样至用5mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)平衡的羟基磷灰石的小(2.5ml)柱上。在从这个柱的最初流出液中收集35kDa的亚单位蛋白质。在280nm连续监测所有使用的色谱柱上的蛋白质级分，并且测定了收集级分的脲酶活性。并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行了分析。将包含纯化的35kDa的亚单位蛋白质级分合并，用PBS缓冲液(pH7.2)彻底透析并贮存在-70℃以备后用。
蛋白质鉴定。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，II，美国)来确定总蛋白质的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。通过不连续SDS-PAGE(5％堆积胶，12％分离胶)，在还原性或者非还原性的条件下，或通过自然PAGE(8-25％梯度)的分析来评估级分或纯化的35kDa的亚单位蛋白质纯度。
氨基酸测序。将纯化的35kDa的亚单位蛋白质转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(BioRad，悉尼，澳大利亚)；这种过程中使用的所有的缓冲液都补充有0.1mM的巯基乙酸(Sigma，St Louis，MO，美国)，用酰胺黑(Sigma，St Louis，MO，美国)将转移的膜染色，然后脱色并随后将亚单位蛋白条带切下。在新城蛋白质测序设备(新城蛋白，新城大学)上进行N-末端氨基酸测序。1.2结果1.3本研究描述了来自病原体幽门螺杆菌的具有35kDa分子量的亚单位蛋白质的成功纯化。根据用于已经成功地发展为在患者中检测幽门螺杆菌感染的治疗点(point-of-care)免疫诊断试剂盒的粗反应抗原级分制备的方案的改进，已经将这种蛋白质纯化。从Mono Q和Superose 6 FPLC柱收集的级分的典型的蛋白质洗脱、脲酶活性和还原型SDS-PAGE图分别示于图1(a-c)和图2(a-c)中。在经过Superose 6凝胶过滤后收集和合并的级分被认为含有脲酶的成分，其先前已经显示了在小鼠实验模型中引起免疫保护反应和病原体的有效根除。接下来的通过DEAE-Sepharose CL6B阴离子交换色谱分级分离，用75mM NaCl洗脱，有效地去除了在合并的蛋白质中的脲酶，如通过SDS-PAGE分析和脲酶活性测定(数据没有给出)所确定的。曾上样于羟基磷灰石的合并蛋白质的洗脱，将35kDa亚单位蛋白质从存在于单步分离中的其它污染蛋白质中分开。使用标准测定法在这些组分中没有检测到脲酶活性，在延长孵育至24小时后也没有检测到(数据没有给出)。在用PBS缓冲液(pH7.2)对35kDa亚单位蛋白质彻底透析和用结晶聚乙二醇(PEG)浓缩后获得了完全相同的结果。在运用经过Centricon-30(Amicon，Beverly，MA，美国)离心法进一步浓缩后的35kDa亚单位蛋白质制品经SDS-PAGE的银染色，未显示任一脲酶亚单位成分的存在。
经过纯化的35kDa亚单位蛋白质在还原性和非还原性条件下的变性PAGE上已经得到了进一步的评定。通过变性的PAGE分析显示，这种蛋白质在还原和非还原的条件下都作为离散的35kDa亚单位蛋白质存在(图3)。
在新城蛋白质设备上的N-末端测序之后，经过纯化的35kDa亚单位蛋白质得到鉴定。所获得的相应于在还原性SDS-PAGE上观察到的纯化35kDa亚单位条带之前12个氨基酸残基的序列数据是AKEILVAYGVDI。通过使用Swiss-Prot在线数据库和在T.L.G.R的幽门螺杆菌菌株26696基因组数据库的这种序列的BLAST(Basic Local Alignment Sequence Tool)分析，获得了此蛋白质初步的鉴定。这些组合分析表明，这种蛋白质相当于命名为HP0310的预测的保守的假想蛋白质。然而关于此蛋白质的蛋白质的功能是未知的，由于(i)在其它的实验室其从来没有得到过纯化，和(ii)比较序列分析表明同源蛋白质具有不同的功能。
下面的数据使天然NCTC 11637菌株蛋白质的序列与这种蛋白质在菌株26695中的预测的序列和由本实验室中的Richard McCoy博士克隆的重组NCTC 11637蛋白质所确定的的序列进行排列比较。使用来自菌株26695的HP0310的预测的序列获得了BLAST分析只给出了显著的匹配(即P(N)＜0.001)。上面3个匹配的排列比较未产生关于纯化的35kDa蛋白质的功能同一性或重要性的理解，所述35kDa蛋白质具有相当于(i)来自集胞蓝细菌(Synechocystis.sp.)的属之假想的蛋白质、(ii)来自嗜热脂肪芽孢杆菌的节蛋白(nodB)，(iii)和在嗜热脂肪芽孢杆菌中的假想蛋白质的序列同源区。序列排比Native AKEILVAYGVDIRacomb AKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWF26695 NAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWF 60Racomb PGHSIETFPEQMKMIVDAGHESGKSIELIKDLTGKAP26695 SPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVELIKDLTGKAP 120Recomb QAMWRRGGKFSNITNELRLKHGFKYSLEAKDWMKP26695 TGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKP 180RecombIRGVDVAPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYA26695 LIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYA 240Recomb VFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK26695 VFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK 293BLAST分析Query＝MySequence(293字符)高概率序列产生高得分区段配对得分 P(N) Ngi|2313％06| (AE000549) 保守的假拟 15905.0e-212 1gnl|PID|d1018374 (D90907)假拟蛋白质 [Sy..1841.4e-161pir||B47692结瘤蛋白质nodB同源区-Ba…1322.4e-091sp|Q04729|YFU2_BACST 假拟 30.6 KD 1322.4e-091gi|2626811| (D83967)Yfjs[枯草芽孢杆菌 ]＞g...1252.3e-081gnl|PID|e325402 (Z97209)假拟蛋白质[Schiz… 961.3e-0729nl|PID|e1185261 (Z99112)其他基因名称 ymxI；.1121.5e-061sp|P50850|YLXY_BACSU 假拟 31.5 KD.. 1051.4e-051gi|2612882| (AF015825) NodB-样蛋白质 [Bacill…950.000341gnl|PID|e325211 (Y14082)假拟蛋白质[Bacil...780.000613gnl|PID|e1251975 (AL021897) 假拟蛋白质.930.000651序列同源区1.＞gnl|PID|d1018374(D90907)假拟蛋白质[集胞蓝细菌]长度＝335得分＝184(85.0bits)期望＝1.4e-16，P＝1.4e-16同一性＝39/104(37％)， 相似性＝58/104(55％)Query42 GIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQE 101G+PR+L L KY + TG ++E + ++ K IV GHE AHG+ +N MTA QEsbjct95 GVPRILDLLDKYKIKITSHMSGRTVEMYPDRAKEIVQRGHEAAAHGWDWDNEFNMTAPQE 154Query 102 EDVLLKSVELIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKY 145D + ++V++I +TG+ GY APS +L + GF YSbjct 155 RDFIQRNVDIILKVTGQRAVGYNAPGLRGSVNILTVLNELGFVY 1982.＞pir||B47692结瘤蛋白质nodB同源区-嗜热脂肪芽孢杆菌长度＝265得分＝132(61.0bits)， 期望＝2.4e-09，P＝2.4e-09同一性＝28/82(34％)， 相似性＝49/82(59％)QueRY45 RLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDV 104++L + KK+ + AT+F GH ++T + +K +V GH VG H +SH + ++A + +Sbjct84 KILDVLKKHDVHATFFVTGHYLKTAPDLVKRMVKEGHIVGNHSWSHPDMTTISADKIKKE 143Query 105 LLKSVELIKDLTGKAPTGYVAP 126L+ +K+LTG+ T YV PSbjct 144 LDAVSDKVKELTGQEGTVYVRP 1653.＞sp|Q04729|YFU2_BACST FUMA 3’区前体中假拟30.6KD蛋白质(ORF2)＞gi|551706|(L05611)[fumA(Bst)]基因产物[嗜热脂肪芽孢杆菌]长度＝265得分＝132(61.0bits)，期望＝2.4e-09，P＝2.4e-09同一性＝28/82(34％)，相似性＝49/82(59％)Query45 RLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDV 104++L + KK+ + AT+F GH ++T + +K +V GH VG H +SH + ++A + +sbjct84 KILDVLKKHDVHATFFVTGHYLKTAPDLVKRMVKEGHIVGNHSWSHPDMTTISADKIKKE 143Query 105 LLKSVELIKDLTGKAPTGYVAP 126L+ +K+LTG+ T YV PSbjct 144 LDAVSDKVKELTGQEGTVYVRP 1652.检验从NCTC菌株11637中分离的作为疫苗抗原的天然幽门螺杆菌蛋白质HP03102.1方法小鼠的免疫接种使用预防免疫接种法在小鼠的幽门螺杆菌感染模型中检验了此抗原。
雌性、不含特定病原体的C57BL/6小鼠从澳大利亚、NSW、新城大学的中心动物房获得。动物实验的进行获得了新城大学的动物照料与伦理委员会的批准，并且在有隔离器的笼子里每笼放5只。通过集合淋巴小结内途径(IPP)免疫小鼠来测试作为候选疫苗的抗原的效能，由于这种免疫途径已经显示了产生最大的肠免疫(1，2)，并且因而对于筛选具有作为口服疫苗抗原潜力的蛋白质是有用的。在等量的PBS和费氏不完全佐剂的匀浆中包含有抗原HP0310(0.5g蛋白质/ml)。对于IPP免疫法，每只小鼠通过腹膜内注射200μl的氯胺酮、噻拉嗪(Bayer)混合物(通过混合10ml氯胺酮(100μg/ml)和1ml噻拉嗪(100μg/ml)而制备)得到麻醉。腹部剃毛并用70％的乙醇擦洗，且在皮肤和肌肉层做中间线切口以暴露肠。可见的集合淋巴小于沿着肠的长度排列，直接注射约3μl的匀浆到每个集合淋巴小结的浆膜之下。缝合肌肉和皮肤层并且将小鼠保温直到其从麻醉状态苏醒。对于每个实验，免疫10只小鼠而另10只未经处理作为非免疫的对照组。用幽门螺杆菌感染小鼠在免疫后两周感染小鼠。幽门螺杆菌悉尼菌株1(SS1)从澳大利亚悉尼NSW大学A.Lee教授处获得。该幽门螺杆菌菌株已经显示了成功地定居于C57BL/6小鼠的胃(3)。幽门螺杆菌在微需氧37℃保温箱中的巧克力平板上生长3天，然后收获至PBS中。幽门螺杆菌的浓度由405nm读取的光密度，和使光密度与幽门螺杆菌浓度相关的回归曲线确定。用管饲法连续3天用约含108个幽门螺杆菌的100μl体积感染小鼠，并且在巧克力琼脂上培养连续10倍稀释的活幽门螺杆菌制品3天，来确定活的幽门螺杆菌的实际浓度。因此分别计算活的幽门螺杆菌的实际剂量。在连续的3天的剂量为2.0×108、5.0×108、1.0×108。样品收集在感染后4周通过腹膜内注射过量的戊巴比妥将小鼠杀死并移出胃。将胃纵向切成两半，一半于1ml的PBS中匀浆并且将连续稀释的小份涂于巧克力平板上培养3天。计数菌落以确定在每个小鼠的半个胃中幽门螺杆菌的菌落形成单位(CFU)数。计算每组的平均值±SEM。2.2结果表1和图4中显示了从每组小鼠的半个胃中的活菌平均回收。
表1从匀浆的半个胃中回收的细菌
组间非配对的“T-检验”的比较显示，在用HP0310免疫的组中平均的CFU明显地较低(P＜0.001)。用免疫组与非免疫组相比较时细菌的清除百分率为97％。结论当以预防的目的用于防止小鼠中幽门螺杆菌的感染时，来自幽门螺杆菌菌株NCTC11637的蛋白质HP0310是一种保护抗原。期望这种蛋白质在治疗的疫苗中也能有效。3.幽门螺杆菌NCTC 11637 HP0310基因的克隆和表达3.1前言在关于超声处理细菌制品的可溶性部分的蛋白质分析中，首次注意到来自幽门螺杆菌NCTC11637菌株的HP0310蛋白质。通过比较从分离的蛋白质中获得的氨基酸序列与TIGR幽门螺杆菌基因组数据库，鉴定了此蛋白质。使用纯化的天然蛋白质的免疫接种和攻击研究表明了明显的保护诱导并且成为试图克隆用于重组蛋白质生产的基因的根据。3.2方法和结果寡核苷酸直接用TIGR数据库的幽门螺杆菌菌株26695的HP0310序列设计HP03105′和3′末端的寡核苷酸。(图5)。为了容纳随后的扩增基因克隆至表达质粒载体中，在每个寡核苷酸的5′末端引入限制酶切位点。在使用适当的软件包进行关于幽门螺杆菌菌株26695的HP0310序列酶位点搜寻并且考虑到在pQE30系列载体的多克隆位点的可用酶位点后选择了被选的酶位点，5′和3′引物分别为SphI和HindIII。
RNA生产使用Boehringer Mannheim高纯RNA分离试剂盒，从培养3天的幽门螺杆菌NCTC11637菌株中制备总RNA。从细菌中分离RNA的标准程序参照如在试剂盒的方法中扼要描述的，并且包括用DNA酶I处理。将分离的RNA制成用DEPC处理的灭菌去离子水(dd.H2O)中的50μl的终体积。
cDNA生产为了从分离的RNA中产生cDNA，将5μl的总RNA与2μl每种寡核苷酸引物(以约0.5μg/μl)、2μl含有2.5μM的每种dNTP的dNTP混合物、5μl的5×反应缓冲液(Promega)、3μl的1mg/ml的牛血清白蛋白、10个单位的RNasin(Promega)、和200个单位的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)混合。用dd.H2O补至体积为25μl并在42℃保温60分钟。反应通过在70℃保温10分钟终止并用dd.H2O补至终体积为50μl。
聚合酶链式反应扩增使用Taq DNA聚合酶(Promega)和1、2和5mM浓度的MgCl2对5μl的cDNA产物进行扩增。PCR混合物用dd.H20补至50μl并在扩增前在微离心管中脉冲标记。使用如图6扼要描述的方法在Hybaid Touchdown热循环控制仪中进行PCR反应。扩增结束后紧接着将反应管转移到4℃，并且10μl的每个反应进行1％琼脂糖(Progen，澳大利亚)凝胶电泳。琼脂糖凝胶用溴化乙啶染色，与1千碱基对梯状条带(Progen)比较，检查在约900碱基对处的条带(图7)。
PCR片段纯化与克隆一旦成功扩增反应，即包含有预期大小的片段的反应的鉴定之后，使用纯化试剂盒(Boehringer Mannheim)进行PCR产物的纯化。然后将纯化产物从1％琼脂糖凝胶上切下，并使用ProgenBand Pure纯化试剂盒纯化片段。然后将分离的片段与pCR2.1质粒载体以提供的最初的TA克隆试剂盒(Invitrogen，美国)所述的方式连接。将连接混合物转化感受态的TOP10F′大肠杆菌菌株，并涂在含有100μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂平板上，用含有1mM IPTG(Progen)和0.02％X-gal(Amresco，美国)的琼脂覆盖。检查平板中的集落，挑选提示片段插入到pCR2.1载体中的缺少β-半乳糖苷酶活性的菌落，选择了6个这样的菌落使用Pharmacia Flexiprep系统进行质粒DNA的制备。分离的克隆质粒DNA用Eco RI降解，以切下插入片段并在1％的琼脂糖凝胶上检查(图7)。然后将含有正确大小片段的克隆这到澳大利亚新城大学生物医学研究实验室DNA测序部使用ABI Prism 377 DNA自动测序仪进行核苷酸测序。
克隆至pQE表达载体使用引入到PCR引物中的SphI和HindIII限制酶位点，从pCR2.1载体上将克隆的NCTC11637 HP0310基因切下。将此片段连接到pQE31表达载体多克隆位点中的相应位点，并且转化感受态JM109大肠杆菌菌株。菌落在LB氨苄青霉素的平板上得到生长并且再一次的选择6个可能的克隆用于质粒DNA分析。克隆通过限制酶分析和测序得到证实。克隆证实之后，选择2个克隆并且在LB肉汤中生长的培养物用于在-70℃甘油贮藏。
重组HP0310蛋白质的表达pQE系列载体的表达是在具有两个Lac操纵子序列的T5启动子的控制之下。为了表达克隆的HP0310基因，将pQE31-HP0310质粒克隆转化包含pREP4质粒的M15大肠杆菌菌株细胞。pREP4质粒提供用于控制插入基因表达的Lac阻遏物基因。转化通过质粒DNA分析得到证实，并且在含有100μg氨苄青霉素/ml和25μg卡那霉素/ml(LBA/AK)的LB琼脂上制备菌落的新鲜平板，卡那霉素抗性基因由pREP4质粒携带。将在M15细胞中表达克隆的单菌落接种至含有氨苄青霉素和卡那霉素(LB/AK)的5ml的LB肉汤中，在37℃培养过夜。用0.5ml的过夜培养物接种4.5ml的新鲜的LB/AK肉汤，并且这种培养物在37℃生长2小时。通过加入100mM的IPTG至2mM的终浓度来诱导基因的表达，培养物在37℃再孵育另外的4小时。在结束表达孵育之后，将细胞在Beckman GPR bench top离心机上在10℃下以3000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于2.5ml0.1M磷酸二氢钠和0.01M Tris、pH7.8的裂解缓冲液中的8M尿素中。使用在MSE程序计时器的控制之下的具有3mm直径探头的SanyoSoniprep 150超声仪，在20秒的非超声之后20秒超声的4个循环中，以7微米的振幅在冰上将细胞悬液进行超声处理。将超声制品如前所述离心15分钟，并将上清液转移到一新管中。沉淀重悬于1ml的PBS中。10μl的每种上清液和沉淀制品加入等体积的含4％SDS的PAGE还原性上样缓冲液，在具有4％丙烯酰胺堆积层(Bio Rad，美国)的12％丙烯酰胺小预制胶上电泳。凝胶在80V进行约15分钟然后在180V电泳，直到溴酚兰标记染色。将所得胶在0.1％的考马斯亮蓝染料中染色并检查应在约35kDa处的重组蛋白质(图8)。
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140Tyr Asp His Ser Leu Met His Asn Asp Phe Thr Pro Tyr Tyr Val Arg145 150 155 160Val Gly Asp Ser Trp Ser Lys Ile Asp Tyr Ser Leu Glu Ala Lys Asp165 170 175Trp Met Lys Pro Leu Ile Arg Gly Val Glu Thr Asp Leu Val Glu Ile180 185 190Pro Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Pro Met Met Phe Ile Lys195 200 205Lys Ser Pro Asn Ser Phe Gly Phe Val Ser Pro His Asp Ile Gly Gln210 215 220Met Trp Ile Asp Gln Phe Asp Trp Val Tyr Arg Glu Met Asp Tyr Ala225 230 235 240Val Phe Ser Met Thr Ile His Pro Asp Val Ser Ala Arg Pro Gln Val245 250 255Leu Leu Met His Glu Lys Ile Ile Glu His Ile Asn Lys His Glu Gly260 265 270Val Arg Trp Val Thr Phe Asn Glu Ile Ala Asp Asp Phe Leu Lys Arg275 280 285Asn Pro Arg Lys Lys290<210>2<211>879<212>DNA<213>幽门螺杆菌<400>2atggcaaaag aaattttagt ggcttatggt gtggatattg atgcggtggc tggttggtta 60gggagctatg gtggggagga ttcgcctgat gatatttcgc gcgggctttt tgcgggtgaa 120gtggggatcc cacggctttt gaaattgttt aaaaaatacc atctcccggc gacttggttt 180tcgccggggc attctattga aactttctct gaacaaatga aaatgatcgt ggatgcaggg 240catgaagtgg gcgcgcatgg gtattcgcat gaaaacccta tcgctatgac ggccaagcaa 300gaagaagacg ttttgttaaa aagcgttgag ttgattaaag atctcaccgg caaagccccc 360acaggctatg tggcgccgtg gtgggagttt tctaatatca ctaatgaatt gcttttaaaa 420cacggcttca aatacgacca ctcgctcatg cacaatgatt tcacgcccta ttatgtgcgc 480gtgggggata gttggagcaa gattgattat agtttggaag ctaaggattg gatgaagcct 540ttaatccgtg gggtggaaac cgatctggtg gaaatccctg cgaactggta tttggacgat 600ttaccgccga tgatgttcat caaaaagtcc cccaatagtt ttggttttgt aagtccgcac 660gatatagggc aaatgtggat cgatcaattt gattgggttt atcgtgagat ggattatgcg 720gtgtttagca tgacaatcca ccctgatgtg agcgcccgtc cgcaagtgtt gctcatgcat 780gaaaaaatca ttgagcatat caacaagcac gagggcgtgc gttgggtaac attcaatgaa 840atcgctgatg atttcttaaa acgaaaccct agaaaaaaa879<210>3<211>12<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>3Ala Lys Glu Ile Leu Val Ala Tyr Gly Val Asp Ile1 5 10<210>4<211>59<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>4Ala Lys Glu Ile Leu Val Ala Tyr Gly Val Asp Ile Asp Ala Val Ala1 5 10 15Gly Trp Leu Gly Ser Tyr Gly Gly Glu Asp Ser Pro Asp 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Gly Arg Thr Val Glu Met Tyr Pro Asp Arg Ala20 25 30Lys Glu Ile Val Gln Arg Gly His Glu Ala Ala Ala His Gly Trp Asp35 40 45Trp Asp Asn Glu Phe Asn Met Thr Ala Pro Gln Glu50 55 60<210>16<211>44<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>16Glu Asp Val Leu Leu Lys Ser Val Glu Leu Ile Lys Asp Leu Thr Gly1 5 10 15Lys Ala Pro Thr Gly Tyr Val Ala Pro Trp Trp Glu Phe Ser Asn Ile20 25 30Thr Asn Glu Leu Leu Leu Lys His Gly Phe Lys Tyr35 40<210>17<211>44<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>17Arg Asp Phe Ile Gln Arg Asn Val Asp Ile Ile Leu Lys Val Thr Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly Leu Arg Gly Ser Val Asn20 25 30Ile Leu Thr Val Leu Asn Glu Leu Gly Phe Val Tyr35 40<210>18<211>60<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>18Arg Leu Leu Lys Leu Phe Lys Lys Tyr His Leu Pro Ala Thr Trp Phe1 5 10 15Ser Pro Gly His Ser Ile Glu Thr Phe Ser Glu Gln Met Lys Met Ile20 25 30Val Asp Ala Gly His Glu Val Gly Ala His Gly Tyr Ser His Glu Asn35 40 45Pro Ile Ala Met Thr Ala Lys Gln Glu Glu Asp Val50 55 60<210>19<211>60<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>19Lys Ile Leu Asp Val Leu Lys Lys His Asp Val His Ala Thr Phe Phe1 5 10 15Val Thr Gly His Tyr Leu Lys Thr Ala Pro Asp Leu Val Lys Arg Met20 25 30Val Lys Glu Gly His Ile Val Gly Asn His Ser Trp Ser His Pro Asp35 40 45Met Thr Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ile Lys Lys Glu50 55 60<210>20<211>22<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>20Leu Leu Lys ser Val Glu Leu Ile Lys Asp Leu Thr Gly Lys Ala Pro1 5 10 15Thr Gly Tyr Val Ala Pro20<210>21<211>22<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>21Leu Asp Ala Val Ser Asp Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Gln Glu Gly1 5 10 15Thr Val Tyr Val Arg Pro20<210>22<211>60<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>22Arg Leu Leu Lys Leu Phe Lys Lys Tyr His Leu Pro Ala Thr Trp Phe1 5 10 15Ser Pro Gly His Ser Ile Glu Thr Phe Ser Glu Gln Met Lys Met Ile20 25 30Val Asp Ala Gly His Glu Val Gly Ala His Gly Tyr Ser His Glu Asn35 40 45Pro Ile Ala Met Thr Ala Lys Gln Glu Glu Asp Val50 55 60<210>23<211>60<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>23Lys Ile Leu Asp Val Leu Lys Lys His Asp Val His Ala Thr Phe Phe1 5 10 15Val Thr Gly His Tyr Leu Lys Thr Ala Pro Asp Leu Val Lys Arg Met20 25 30Val Lys Glu Gly His Ile Val Gly Asn His Ser Trp Ser His Pro Asp35 40 45Met Thr Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ile Lys Lys Glu50 55 60<210>24<211>22<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>24Leu Leu Lys Ser Val Glu Leu Ile Lys Asp Leu Thr Gly Lys Ala Pro1 5 10 15Thr Gly Tyr Val Ala Pro20<210>25<211>22<212>PRT<213>幽门螺杆菌<400>25Leu Asp Ala Val Ser Asp Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Gln Glu Gly1 5 10 15Thr Val Tyr Val Arg Pro20<210>26<211>26<212>DNA<213>幽门螺杆菌<400>26atcgcatgca aaagaaattt agtggc 26<210>27<211>25<212>DNA<213>Helicobacter pylori<400>27atcaagcttt ttttctaggg tttcg 2权利要求
1.一种幽门螺杆菌抗原蛋白质，如在还原性或非还原性条件下由SDS-PAGE所测量的具有35kDa的分子量，并且具有如下氨基酸序列MAKEILVAYGVDIDAVAGWLGSYGGEDSPDDISRGLFAGEVGIPRLLKLFKKYHLPATWFSPGHSIETFSEQMKMIVDAGHEVGAHGYSHENPIAMTAKQEEDVLLKSVFLIKDLTGKAPTGYVAPWWEFSNITNELLLKHGFKYDHSLMHNDFTPYYVRVGDSWSKIDYSLEAKDWMKPLIRGVETDLVEIPANWYLDDLPPMMFIKKSPNSFGFVSPHDIGQMWIDQFDWVYREMDYAVFSMTIHPDVSARPQVLLMHEKIIEHINKHEGVRWVTFNEIADDFLKRNPRKK.
2.如权利要求1的蛋白质，其以基本上纯的形式提供，优选基本上不含其它蛋白质。
3.如权利要求1或权利要求2的蛋白质之抗原/免疫原性同源物或衍生物。
4.如权利要求1或权利要求2的蛋白质或如权利要求3的蛋白质之同源物或衍生物的一种或多种抗原/免疫原性片段。
5.一种重组核酸分子，其包含或由如下组成(i)序列ATGGCAAAAGAAATTTTAGTGGCTTATGGTGTGGATATTGATGCGGTGGCTGGTTGGTTAGGGAGCTATGGTGGGGAGGATTCGCCTGATGATATTTCGCGCGGGCTTTTTGCGGGTGAAGTGGGGATCCCACGGCTTTTGAAATTGTTTAAAAAATACCATCTCCCGGCGACTTGGTTTTCGCCGGGGCATTCTATTGAAACTTTCTCTGAACAAATGAAAATGATCGTGGATGCAGGGCATGAAGTGGGCGCGCATGGGTATTCGCATGAAAACCCTATCGCTATGACGGCCAAGCAAGAAGAAGACGTTTTGTTAAAAAGCGTTGAGTTGATTAAAGATCTCACCGGCAAAGCCCCCACAGGCTATGTGGCGCCGTGGTGGGAGTTTTCTAATATCACTAATGAATTGCTTTTAAAACACGGCTTCAAATACGACCACTCGCTCATGCACAATGATTTCACGCCCTATTATGTGCGCGTGGGGGATAGTTGGAGCAAGATTGATTATAGTTTGGAAGCTAAGGATTGGATGAAGCCTTTAATCCGTGGGGTGGAAACCGATCTGGTGGAAATCCCTGCGAACTGGTATTTGGACGATTTACCGCCGATGATGTTCATCAAAAAGTCCCCCAATAGTTTTGGTTTTGTAAGTCCGCACGATATAGGGCAAATGTGGATCGATCAATTTGATTGGGTTTATCGTGAGATGGATTATGCGGTGTTTAGCATGACAATCCACCCTGATGTGAGCGCCCGTCCGCAAGTGTTGCTCATGCATGAAAAAATCATTGAGCATATCAACAAGCACGAGGGCGTGCGTTGGGTAACATTCAATGAAATCGCTGATGATTTCTTAAAACGAAACCCTAGAAAAAAA.；(ii)与(i)中序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)的那些序列编码相同蛋白质的序列；(iv)与(i)、(ii)或(iii)的那些中任一个具有基本上的同一性的序列；(v)编码如此处所描述的蛋白质的同源物、衍生物或片段的序列。
6.一种包含如权利要求5的核酸序列的载体。
7.一种包含如权利要求6的载体的宿主细胞。
8.一种包含如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、和/或如权利要求3所定义的同源物或衍生物、和/或如权利要求4所定义的一个或多个片段的免疫原性/抗原组合物
9.如权利要求8的免疫原性/抗原组合物，其是疫苗或是用于诊断鉴定。
10.一种包含一种或多种如权利要求5所定义的核酸序列的疫苗组合物。
11.一种用于幽门螺杆菌检测/诊断的方法，其包括使如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的同源物或衍生物或如权利要求4所定义的其片段与待测试的样品相接触的步骤。
12.如权利要求11的方法，其中样品是生物学样品，如从待测试的受试者中得到的组织样品或者血液或唾液样品。
13.一种能结合于如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的同源物或衍生物或如权利要求4所定义的片段的抗体。
14.一种用于幽门螺杆菌检测/诊断的方法，其包括使如权利要求13所定义的至少一种抗体与待测试的样品相接触的步骤。
15.一种用于幽门螺杆菌检测/诊断的方法，其包括使如权利要求5所定义的至少一种核酸序列与待测试的样品相接触的步骤。
16.如权利要求15的方法，其中样品是生物学样品，如从待测试的受试者中得到的组织样品或者血液或唾液样品。
17.一种免疫接种受试者抗幽门螺杆菌的方法，其包括给受试者施用如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的衍生物或同源物、如权利要求4所定义的其一个或多个片段、或如权利要求8或权利要求9所定义的免疫原性组合物的步骤。
18.一种免疫接种受试者抗幽门螺杆菌的方法，其包括给受试者施用如权利要求5所定义的核酸分子的步骤。
19.一种用于幽门螺杆菌感染的预防或治疗的方法，其包括给受试者施用如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的衍生物或同源物、如权利要求4所定义的其一个或多个片段、或如权利要求8或权利要求9所定义的免疫原性组合物的步骤。
20.一种用于幽门螺杆菌感染的预防或治疗的方法，其包括给受试者施用如权利要求5所定义的核酸分子的步骤。
20.一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其中包含如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的同源物或衍生物、如权利要求4所定义的其一个或多个片段、或如权利要求8或权利要求9所定义的抗原组合物。
21.一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其中包含如权利要求5所定义的一种或多种核酸分子。
22.一种在检测/诊断幽门螺杆菌感染中使用的试剂盒，其中包含如权利要求13所定义的一种或多种抗体。
23.如权利要求1或权利要求2所定义的蛋白质、如权利要求3所定义的同源物或衍生物、如权利要求4所定义的其一个或多个片段、或如权利要求8或权利要求9所定义的抗原组合物在制备幽门螺杆菌感染的预防或治疗的药物中的用途。
24.如权利要求5所定义的一个或多个核酸分子、或其一个或多个片段在幽门螺杆菌感染的预防或治疗的药物的生产中的用途。
全文摘要
公布了一种得自幽门螺杆菌的新抗原。也描述了它的诊断和治疗用途,也描述了包含抗原和/或编码此抗原的核酸分子的试剂盒。
文档编号A61P31/04GK1330662SQ9981463
公开日2002年1月9日 申请日期1999年11月11日 优先权日1998年11月17日
发明者M·顿克雷, S·哈瑞斯 申请人:普罗瓦利斯英国有限公司