0] 流动相制备
[0031] 1.通道A-向1000mL去离子水中加入1.OmLFA。将溶液过滤并脱气。
[0032] 2?通道B-向1000mL乙腈中加入1.OmLFA。
[0033]色谱系统（Agilent1290Infinity)
[0034]柱： PhenomenexKinetex(2. 1X150mm，1. 7 微米）
[0035]温度： 60.(TC
[0036] 流动相： 溶剂A-处于水中的0?1 %FA
[0037] 溶剂B-处于CAN中的0?1 %FA
[0038]流速： 0? 400mL/min(梯度）
[0039] 梯度系统
[0040]
[0041] 波长： UV在360nm处，参比在450nm处
[0042] 运行时间： 25分钟（含5.Omin的后运行）
[0043] 进样体积： 2. 0yL
[0044] 数据采集： 25分钟
[0045]参考图2(a)，从左边开始的高亮区域分别描绘出了槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷和槲 皮苷在HPLC图谱中的存在。此外，在下表1中对由小寥获得的所述最终提取物中的槲皮 素-3-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷进行定量分析，以％计。
[0046] 含水量分析
[0047] 样品提取物的含水量通过使用水分分析仪进行测定，其中，将约0. 5-0.6g的粉末 样品转移至铝盘并在l〇5°C下加热，直到获得恒定重量。干燥失重（LOD)由加热期间的重量 损失占初始重量的百分比来确定。
[0048] 表1:以％计的槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷HPLC定量分析以及提取物的含 水量分析。
[0049]分析（w/w) %
[0050] 槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷 0.590818
[0051]槲皮苷0.269141
[0052]含水量（％ ) 5. 76
[0053] 参考图2(b)，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷的保留时间和UV光谱与小寥的样 品提取物的保留时间和UV光谱对比表明，在所述样品中存在这两种化合物。因此，根据上 述HPLC研宄，在小寥的样品提取物中明确鉴定出槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷二者。 对小寥提取物进行研宄，根据下文的结果揭示出了美容增强特征：
[0054] 小寥提取物的抗氧化活性
[0055] 使用氧自由基吸收能力（ORAC方法）测试小寥提取物的抗氧化活性，其显示出非 常高的ORAC值（参见下表）。基于所进行的测试，小寥提取物具有每克11，000微摩尔TE至 每克36, 000微摩尔TE的优选氧自由基吸收能力（ORAC)值，优选ORAC值为至少每克16000 微摩尔TE。进一步对小寥所产生的高ORAC值的保护活细胞免受氧化损伤的能力进行测试， 使用e-CAP分析进行测试。
[0056] 表2:从试验性（pilot)冻干的小寥得到的氧自由基吸收能力（0RAC)。
[0057]
[0059]表3 :从市售的冻干小寥得到的氧自由基吸收能力（0RAC)。
[0061] 表4 :从试验性喷雾干燥的小寥得到的氧自由基吸收能力（0RAC)。
[0064]表5 :从试验性冻干的小寥得到的氧自由基吸收能力（0RAC)。
[0066] 表6 :从具有麦芽糊精作为载体的试验性真空带式干燥的小寥得到的氧自由基吸 收能力（0RAC)。
[0068] 红细胞模型中基于细胞的抗氧化保护（CAP-e分析）
[0069] 作为使用红细胞进行的基于细胞的抗氧化保护分析，CAP-e分析（21)被开发用 来解决以下问题：复杂天然产物中的抗氧化剂是否进入胞浆以及是否有助于细胞内氧化 损伤下降。该分析仅测量在胞浆中的效果，因为在测试中使用的报告染料只有在渗透进细 胞内空间（即，胞浆）后才有功能，所述报告染料在胞浆中经历化学修饰，致使其保留在 细胞内。该分析允许特别地对能够渗透进入活细胞的抗氧化剂进行半定量（Honzel等， 2008，ComparisonofChemicalandCell-BasedAntioxidantMethodsforEvaluation ofFoodsandNaturalProducts:GeneratingMultifacetedDatabyParallelTesting UsingErythrocytesandPolymorphonuclearCells，JournalofAgriculturalandFood Chemistry)〇
[0070] 将0. 5g的测试产品与处于生理pH下的5mL0. 9%的盐水混合。将测试产品依次 通过翻转和涡旋进行混合。通过2400rpm离心10分钟来除去固体。移出产品的上清液，然 后过滤以用于CAP-e分析。由处于生理pH下0.9%盐水中的各份经过滤的上清液来制备系 列稀释液。
[0071] 用测试产品的系列稀释液处理红血细胞，一式两份。制备未经处理的红血细胞样 品（阴性对照）和用氧化剂但未用含抗氧化剂的测试产品处理的红血细胞样品（阳性对 照），一式六份。通过离心并抽吸掉细胞沉淀上的上清液来将未能进入细胞的抗氧化剂除 去。
[0072] 通过添加过氧自由基生成剂AAPH使细胞暴露于氧化损伤。使用指示染料 DCF-DA(由于氧化损伤能够变成发出荧光的物质），通过测量各试验样品的荧光强度来记 录抗氧化损伤的程度。根据与仅用氧化剂处理的细胞相比用产品处理的细胞的荧光强度的 减少，来计算对氧化损伤的抑制。CAP-e值反映了测试产品的IC5(I剂量，即提供50%氧化损 伤抑制的剂量。然后与已知抗氧化剂没食子酸的IC5(I剂量进行比较。
[0073] 参考图3,其中红色IC5Q线与曲线相交的图表上的点反映了测试产品的IC5Q剂量， 即提供50%氧化损伤抑制的剂量。将这一IC5(I剂量与已知抗氧化剂没食子酸（其在分析中 用作对照）的IC5(I剂量进行比较，从而得到以没食子酸当量单位报告的CAP-e值。对提取 物在红血细胞中预防自由基的抗氧化效果进行测试。已证明小寥提取物的细胞保护作用相 当于没食子酸的55倍（或者可能大于55倍），由此证明没食子酸的比较物质（comparator) 具有活性氧清除（R0S)活性。
[0074] 小寥提取物的抗皱效果
[0075] 使用抗胶原酶测试和MMP-1和MMP-13在体外对该提取物的抗皱效果进行测试。
[0076] 体外胶原酶抑制生物分析
[0077] 胶原蛋白是脊椎动物中最丰富的蛋白，存在于几乎所有组织中。胶原原纤维 (fibrils)是血管和皮肤的细胞外基质、牙齿、骨软骨、结缔组织的支持组织的主要组分。在 所有年龄段的男性中，皮肤厚度与胶原蛋白的含量之间都存在一定的关系。类似的关系存 在于年龄超过60岁的女性中，但在年轻女性中没有那么明显。在成人皮肤中，老化特征与 总胶原蛋白含量密切相关，所述总胶原蛋白含量在两种性别中均随着年龄的增加而降低。 胶原蛋白被胶原酶降解，从而导致皮肤中低的胶原蛋白含量。因此，皮肤中高的胶原酶活性 可造成皮肤的皱纹。胶原蛋白的抑制剂应该能够有助于控制皮肤皱纹形成。特别感兴趣的 是活性胶原酶与类风湿关节炎的病理学之间的关系。有证据显示，在关节结构中自然抑制 的胶原酶可被激活，由此导致关节中特征组织的破坏。
[0078] 溶剂和试剂：EnzChek?明胶酶/胶原酶分析试剂盒（E12055,分子探针， Invitr〇gen，USA，-20°C储存）含有：来自猪皮的DQ明胶、焚光素缀合物，10X反应缓冲液、 1,10-邻菲略啉一水合物、来自溶组织梭菌（Clostridiumhistolyticum)的胶原酶。
[0079] 通过将其溶在200y1DMS0中并用1X反应缓冲液补足至10mL来制备2. 5mg样 品。根据需求制成进一步的稀释液。DQ明胶、荧光素缀合物的酶促裂解使荧光肽释放。荧 光的增加与蛋白水解（proteolytic)活性成比例。用490nm的光激发DQ明胶、焚光素缀合 物的消化产物，并在焚光酶标仪（fluorometricplatereader)中检测在520nm处的激发 光。
[0080] 胶原酶抑制分析按照EnzChek?明胶酶/胶原酶分析试剂盒（E12055,分子探针， Invitrogen，USA)的试剂盒插页（insert)来进行。简要地说，加入80yl的IX反应缓冲 液/载体缓冲液/测试溶液/各种浓度的阳性对照、100u1酶溶液（〇. 1单位/ml)和20y1 底物溶液（lmg/ml)，混合15sec，在25°C下孵育2小时，并在荧光酶标仪[FluostarOptima， BMGLabtech,Germany]中用以下参数进行读取：其中，将其在490nm激发，并通过Costar 96荧光酶标仪记录520nm处的出射光。
[0081] 进行不含测试样品的对照反应，分别做了样品空白、对照空白和载体空白（