刺激敏感性微粒和使用方法
【专利说明】刺激敏感性微粒和使用方法
[0001] 相关申请的的交叉引用 本申请按35 U.S.C. §119 (e)要求提交于2012年9月27日的美国临时申请号 61/706, 126的权益，其通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。 发明领域
[0002] 提供了刺激敏感性微粒及其用途，例如，在示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群 体（例如，循环肿瘤细胞）的效率中的用途；和在提供对照核酸以指标化不依赖于稀少细胞 选择步骤的分子测定中的用途。
[0003] 发明背景 实体组织癌开始生长于原发位点。随着疾病进展，转移出现在远端位置。这些转移事 件加速疾病并最后导致死亡。作为转移过程的一部分，细胞或细胞碎片离开原发位点。转 移的过程是复杂的。一部分转移过程涉及稀少循环肿瘤细胞（CTC)。越来越清楚在给定的 患者中这些CTC不是整体（monolithic)群体。患者中的CTC分级对于理解突变（其是折 磨患者的癌症的原因）是必要的。纯化和分离这些稀少肿瘤细胞（或细胞衍生事件）对于 定义在患者的血中的致癌突变是必须的。许多细胞和细胞碎片存在于不含突变的全血中， 因此为了分离有用的携带突变的细胞，需要纯化策略。
[0004] 为了通过任何技术从细胞混合物中测量在稀少细胞群体(例如，循环肿瘤细胞 (CTC))的DNA基因组中的突变，需要足够数量或质量的DNA。通常2-4 ml的全血，可期望 回收2-10个CTC。此数量的细胞必须用优秀的回收处理以确保携带突变的染色体在处理期 间不被丢失。
[0005] 简述 本文公开的实施方法部分地基于热不稳定性微球的发现以及它们在示踪从稀少细胞 群体的细胞中分离基因组DNA的效率中的用途，所述稀少细胞群体从细胞混合物（例如，来 自生物样本）中分离。本文中描述的热不稳定性微球和示踪方法提供了多步骤过程内部对 照能力，其允许用于性能的校准，例如，在细胞分离的水平上和也在基因组DNA分离的水平 上。
[0006] 在一个方面中，本发明提供了热不稳定性微球。在一些实施方案中，热不稳定性微 球包括： i) 热不稳定性聚合物，其包括内部空间和外部表面，其中所述聚合物在内部空间中含 有靶核酸，其中所述聚合物包含明确的熔点并在大于约50°C的温度下释放核酸；和 ii) 与聚合物的外部表面连接的免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物。在一些实 施方案中，热不稳定性微球另外包括：iii)可检测的标记并且当其被包含于热不稳定性聚 合物内时是可检测的。任选地，可检测的标记被包含于热不稳定性微球的内部空间。在一 些实施方案中，热不稳定性聚合物是同聚物。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物包含在 约50°C -约110°C的温度范围内的明确的熔点，例如，在约50-60°C或55-65°C的范围内，例 如，约50。〇、55。〇、60。〇、65。〇、70。〇、75。〇、80。〇、85。〇、90。〇、95。〇、1001：、105。〇或1101：。在 一些实施方案中，热不稳定性聚合物包括这样的聚合物，其在水性缓冲液中在大于约50°C 的温度下(例如，大于约55°C，大于约60°C或大于约65°C )被降解。在一些实施方案中，热不 稳定性聚合物选自聚己内酯（PCL)、聚L-赖氨酸（PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸甲酯（PMMA)、 聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚异丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、顺式氯丁二烯、己二酸 乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式异戊二烯、聚（己烯1)、聚（异丁 烯酸甲酯）、聚（氯乙烯）、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙缩醛。在一些实施方案中， 热不稳定性聚合物是生物可降解的。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是生物可降解 的聚酯。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚己内酯（PCL)。在一些实施方案中，聚 己内酯（PCL)包含在约Mn 10, 000-约Mn 90, 000的范围（例如，约Mn 10, 000-14, 000、Mn 45, 000或Mn 70, 000-90, 000)中的分子重量。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚 羟基链烷酸酯。在一些实施方案中，微球具有在约10-30 Mm的范围（例如，在约20-30 Mm 的范围内，例如，约 10 Mm、ll Mm、12 Mm、13 Mm、14 Mm、15 Mm、16 Mm、17 Mm、18 Mm、19 Mm、20 Mm、21 Mm、22 Mm、23 Mm、24 Mm、25 Mm、26 Mm、27 Mm、28 Mm、29 Mm 或 30 Mm 的平均或均值直 径）内的大小。在一些实施方案中，靶核酸被包含于DNA质粒中。在一些实施方案中，靶核 酸编码非人DNA序列或突变的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些实施方案中，靶核酸 编码基因，其选自质粒维持蛋白ccdB和3'，5' -环腺苷一磷酸磷酸二酯酶cpdA。在一些实 施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物包括一种或多种CTC相关的标志物， 例如，上皮细胞粘附分子（Ep-CAM)、KRT19、MUC1、CEACAM5、BIRCS、SCGB2A2 和 ERBB2。在一 些实施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物选自生物素、上皮细胞粘附分子 (Ep-CAM)和洋地黄毒苷。在一些实施方案中，可检测的标记是焚光基团。在一些实施方案 中，荧光基团包含约460 nm的激发峰和约500 nm的发射峰，例如，FAM。在一些实施方案 中，荧光基团选自氧杂蒽衍生物（例如，荧光素、若丹明、俄勒闪绿、伊红和德克萨斯红）、花 青衍生物（例如，花青、靛炭花青、氧杂炭花青、硫杂炭花青和部花青）、萘衍生物（例如，丹 酰和氟硅酸钠（prodan)衍生物）、香豆素衍生物（例如，羟基香豆素、甲氧基香豆素和氨基 香豆素）、噁二唑衍生物（例如，吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑和苯噁二唑）、芘衍生物（例如， 瀑布蓝（cascade blue))、噁嗪衍生物（例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、叮啶衍生 物（例如，二氨基吖啶、叮啶橙、叮啶黄）、芳基甲川衍生物（例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿） 和四吡咯衍生物（例如，扑吩、酞菁、胆红素）。
[0007] 在另外的方面中，本发明提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的细胞的 效率的方法。在一些实施方案中，方法包括： a) 将预定数量的如上面和本文中描述的热不稳定性微球与细胞混合物(其被怀疑包含 稀少细胞群体的细胞）混合，其中与微球的外部表面连接的免疫原性表位或抗原、或表面或 其它标志物是用于分离稀少细胞群体的相同表位或抗原； b) 向包含热不稳定性微球的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原 性表位或抗原、或表面或其它标志物结合；和 c) 从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微球和稀少细胞群体的细胞，其中捕 获的微球的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率；由此示踪从细胞 混合物中回收稀少细胞群体的效率。
[0008] 在另外的方面中，本发明提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率和 回收基因组DNA的效率的方法。在一些实施方案中，该方法包括： a) 将预定数量的上面和本文中描述的热不稳定性微球与细胞混合物(其被怀疑包含稀 少细胞群体的细胞）混合，其中与微球的外部表面连接的免疫原性表位或抗原、或表面或其 它标志物是用于分离稀少细胞群体的相同表位或抗原； b) 向包含热不稳定性微球的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原 性表位或抗原、或表面或其它标志物结合； c) 从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微球和稀少细胞群体的细胞，其中捕 获的微球的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率； d) 在并发地从细胞中释放基因组DNA和从微球中释放靶核酸的条件下，使分离的微球 和分离的稀少细胞群体中的细胞经历至少50°C的温度；和 e) 并发地扩增和定量来自分离的细胞的基因组DNA和从热不稳定性微球中释放的靶 核酸，其中扩增的靶核酸的量代表从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效 率，由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率和回收基因组DNA的效率。
[0009] 在一些实施方案中，该方法另外包括： 在d)之前，通过询问可检测的标记鉴定在C)期间分离的微球的数量；和 将鉴定的微球的数量与在a)中提供的预定数量相比较。在一些实施方案中，在稀少细 胞群体中的细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，稀少细胞群体包括循环肿瘤 细胞（CTC)。在一些实施方案中，细胞混合物在来自患者的生物样本中。在一些实施方案 中，生物样本是全血。在一些实施方案中，热不稳定性微球的预定数量在约10-约100个微 球的范围内。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，结合配偶体(其与免 疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物结合）是抗体或抗体片段。
[0010] 在另外的方面中，提供了刺激敏感性微粒。在一些实施方案中，该微粒包含： i) 包含内部空间和外部表面的壳，其中所述壳在内部空间中包含一种或多种报告分 子，其中所述壳当暴露于刺激时释放所述一种或多种报告分子；和 ii) 与壳的外部表面连接的免疫原性表位。在不同的实施方案中，微粒是球状的。在 一些实施方案中，微粒包含在约I Mm-约100 Mm的范围内的平均直径，例如，在约I Mm-约 10 Mm的范围内的平均直径，例如，在约10 Mm-约100 Mm的范围内的平均直径。在不同 的实施方案中，刺激是温度、pH、辐射、光和/或与酶接触。在不同的实施方案中，壳包括一 种或多种聚合物、单层（unilamellar)胶束、双层（bilamellar)胶束、树状聚体或树状体 (dendrosme )和/或碳纳米管或由它们组成。在一些实施方案中，壳由pH敏感性树状聚体或 树状体、脂质体或一种或多种聚合物组成。在一些实施方案中，壳是由温度敏感性树状聚体 或树状体、脂质体或聚合物组成。在不同的实施方案中，壳是由同聚物，例如，生物可降解的 聚酯组成。在一些实施方案中，同聚物含有明确的熔点并在大于约50°C的温度下释放核酸。 在一些实施方案中，同聚物选自聚己内酯（PCL)、聚L-赖氨酸（PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸 甲酯（PMMA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚异丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、顺式氯丁 二烯、己二酸乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式异戊二烯、聚（己烯 1)、聚（异丁烯酸甲酯）、聚（氯乙烯）、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙缩醛。在一些 实施方案中，同聚物是聚己内酯（PCL)。在一些实施方案中，壳是由一种或多种共聚合物组 成。例如，在不同的实施方案中，壳包括N异丙基丙烯酰胺（NIPAAm)、丙基丙烯酸（PAA)和 丙烯酸丁酯（BA)。在一些实施方案中，壳包含羧甲基壳聚糖（CMCTS)和羧甲基壳聚糖-接 枝-聚（N，N-二乙基丙烯酰胺）（CMCTS-g-PDEA)。在一些实施方案中，壳包含三甲基-壳 聚糖（TMC)、聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（PEGDM)和异丁烯酸（MA)。在一些实施方案 中，壳包含聚（N异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM)和聚乙二醇（PEG)。在一些实施方案中，壳包 括聚（异丁烯酸（MAA)-乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDM)共聚物（P(MAA- C〇-EGDMA)或聚 (异丁烯酸（MAA)-乙二醇异丁烯酸酯（EGM)共聚物（P(MAA-co-EGMA)。在一些实施方案 中，壳包含水解的异丁烯酸化的明胶（HGel-MA)、N，N'亚甲基双丙烯酰胺和N异丙基丙烯酰 胺。在一些实施方案中，壳包括藻酸1? (Ca-ALG)、藻酸-寡壳聚糖（ALGOCH)和藻酸-寡壳 聚糖-EUDRAGIT? L100-55 (ALG-OCH-EL)。在不同的实施方案中，壳是由树状聚体或树状体 组成。在一些实施方案中，树状体由高分枝的聚甘油、环糊精和双链聚己内酯（BPCL)组 成。在一些实施方案中，壳在小于约7或大于约8的pH下或在小于约20°C或大于约37°C 的温度下释放一种或多种报告分子。在一些实施方案中，壳由油酰胺衍生物组成。在不同 的实施方案中，一种或多种报告分子包括革G核酸。在一些实施方案中，革El核酸包括DNA。在 一些实施方案中，靶核酸包含于DNA质粒中。在一些实施方案中，靶核酸编码非人DNA序列 或突变的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些实施方案中，一种或多种报告分子包括可 检测的标记。在不同的实施方案中，可检测的标记是荧光基团。在不同的实施方案中，荧光 基团包含约460 nm的激发峰和约500 nm的发射峰。在一些实施方案中，免疫原性表位或 抗原选自上皮细胞粘附分子（Ep-CAM)、洋地黄毒苷和生物素。
[0011] 在另一方面中，提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的细胞的效率的方 法。在一些实施方案中，该方法包括： a) 将上面和本文中描述的预定数量的微粒与细胞混合物(其被怀疑包含稀少细胞群体 的细胞）混合，其中与微粒外部表面连接的免疫原性表位或抗原是用于分离稀少细胞群体 的相同表位； b) 向包含微粒的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原性表位结 合； c) 从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微粒和稀少细胞群体的细胞，其中捕 获的微粒的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率； d) 使分离的微粒和分离的稀少细胞群体中的细胞经历并发地从细胞中释放基因组 DNA和从微粒中释放一种或多种报告分子的条件；和 e) 并发地定量来自分离的细胞的基因组DNA和从微粒中释放的一种或多种报告分子， 其中一种或多种报告分子的量代表从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效 率，由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率。在一些实施方案中，该方法另外包 括：在d)之前，通过询问一种或多种报告分子鉴定在c)期间分离的微粒的数量；并将鉴定 的微粒的数量与在a)中提供的预定的数量作比较。在不同的实施方案中，稀少细胞群体包 括真核细胞(例如，循环肿瘤细胞（CTC))。在不同的实施方案中，微粒包含与被示踪、捕获、 回收和处理的细胞接近或类似的大小和形状。在不同的实施方案中，细胞混合物在来自患 者的生物样本(例如，全血）中。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，微粒的 预定数量在约10-约100个微粒的范围内。在一些实施方案中，结合配偶体(其与免疫原性 表位或抗原结合)是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，稀少细胞群体包括原核细胞。在 一些实施方案中，细胞混合物在水样本中。在一些实施方案中，细胞混合物在食品样本中。
[0012] 定义