一种避孕节育dna疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种避孕节育DNA疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 计划生育是我国的一项基本国策，有效控制人口数量、显著提高人口质量是关系 到国富民强、国家、民族兴旺发达的千年大计。研究安全有效、可控可逆、简便易行的避孕措 施不仅有重要的科学意义，而且对国家、对民族具有重要的现实意义和长远的历史意义。
[0003] 随着基因重组技术的发展和人们对受精过程的分子基础和详细机理认识的深入， 开发有效的免疫性避孕、节育疫苗将可能成为控制人口过度增长的理想措施。其机理主要 是应用在受精过程中发挥关键作用的分子作为靶抗原用于免疫目标人群使之产生相应免 疫反应，从而阻断受精过程，达到避孕节育目的，例如如DNA疫苗。
[0004] DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质 粒DNA (有时也可是RNA)，将其注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激 活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗 的优点。同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工 程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。
[0005] 目前世界上所采用的避孕措施主要以女性为主，有关避孕药物还不完善，有致畸、 肝脏毒性等副作用，其遗传后果还有待进一步评估。实际上避孕男女均有责任，男性主动参 与避孕节育将很好促进男女平等和社会进步。目前可供男性选择的避孕措施少，并且这些 措施存在着对肌体有害、可能失败以及不可逆等严重缺点。因此研制雄性免疫节育疫苗更 具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种达到避孕节育效果的DNA疫苗及其制备方 法。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] -种避孕节育DNA疫苗，包含编码和表达SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的质粒，SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列为Binlb的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列。
[0009] Binlb 又名 Spaglla sperm associated antigen 11A,位于 Chromosome:8 ; NC_000074. 6(19157887. . 19159578)。本发明选择 Binlb 的 cDNA 第 35 个碱基至第 371 个 碱基核酸序列作为靶抗原基因以及采用适宜的质粒载体pSG. SS. YL和pSG. SS. C3d. YL，成 功构建了 pSG. SS. YL. Binlb (质粒图谱见图4)和pSG. SS. C3d. YL. Binlb (质粒图谱见图5) 重组真核表达质粒作为DNA疫苗。
[0010] 本发明所采用的靶抗原基因包括和其等同的核苷酸序列，即由于密码子简并性， 等同的核苷酸序列在基因序列上和本发明采用的序列不同，但是并没有改变最终编码蛋白 的氨基酸序列。
[0011] 其中，质粒pSG. SS. YL和pSG. SS. C3d. YL由梁培禾博士惠赠，质粒图谱分别见图1 和图2。
[0012] 作为优选，所述质粒由pSG. SS. YL和位于pSG. SS. YL中信号肽序列SS及终止密码 子标签YL之间的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列组成，即pSG. SS. YL. Binlb重组真核表达质 粒。
[0013] 同时，作为优选，本发明所述DNA疫苗包含编码和表达SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列以及C3d核酸序列的质粒。进一步优选为，由pSG. SS. C3d. YL、位于pSG. SS. C3d. YL中信号 肽序列SS和终止密码子标签YL之间的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列组成，即pSG. SS. C3d. YL. Binlb重组真核表达质粒，所述pSG. SS. C3d. YL为在pSG. SS. YL信号肽序列SS和终止密 码子标签YL之间串联3个C3d核酸序列的质粒。
[0014] 此外，本发明还提供一种避孕节育DNA疫苗的制备方法，扩增SEQ ID NO: 1所示核 苷酸序列并与质粒连接，转化后提取即得，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列为Binlb的cDNA第 35个碱基至第371个碱基核酸序列。
[0015] 作为优选，所述制备方法中与SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列连接的质粒为pSG. SS. YL 或 pSG. SS. C3d. YL。
[0016] 作为优选，所述扩增以口￥六3149-8丨11113为模板，以5￡〇10勵:2和5￡〇10勵:3所 示序列为引物进行PCR扩增。本发明扩增引物前端添加有限制性内切酶Bgl II (AGATCT) 和BamH I识别序列（GGATCC)，故在此基础上，所述连接优选为Bgl II和BamH I双酶切扩增 产物和质粒，在16°C下用T4DNA连接酶连接lh。
[0017] 本发明扩增采用的质粒pYA3149-Binlb由李彦锋博士惠赠，质粒图谱见图3。
[0018] 作为优选，所述PCR扩增扩增程序为：
[0019] 94°C 预变性 5min ;
[0020] 94°C变性 30s、55°C复性 30s、72°C延伸 60s，循环 30 次；
[0021] 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0022] 作为优选，所述PCR扩增体系为：
[0023] 10XPCR缓冲液 5ul lOmmol/L dNTPs lul 25umol/L上游引物 lul .25umol/L下游引物 lul 5IU/ul Taq DNA聚合酶 1 ul 模板DNA 3ul
[0024] 加 ddH20 至 50ul，混匀。
[0025] 经过试验检测，本发明提供的 pSG. SS. YL. Binlb 和 pSG. SS. C3d. YL. Binlb 的 DNA 疫苗免疫雄鼠后，其精子活力、雌鼠受孕率、平均产仔数量显著降低，免疫避孕效果显著好 于对照组。同时雄鼠血清抗Binlb蛋白IgG抗体滴度显著升高，血清IL-2、INF-Y浓度显 著降低，血清IL-4、IL-10浓度显著增加。表明本发明所述避孕节育DNA疫苗可有效诱导雄 鼠产生免疫性避孕效应。
[0026] 由以上技术方案可知，本发明以Binlb的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸 序列作为靶抗原基因、以pSG. SS. YL和pSG. SS. C3d. YL为适宜的质粒载体，成功构建了 pSG. SS. YL. Binlb和pSG. SS. C3d. YL. Binlb重组真核表达质粒作为DNA疫苗，可有效达到避孕节 育效果。
【附图说明】：
[0027] 图1示pSG. SS. YL质粒图谱；
[0028] 图 2 示 pSG. SS. C3d. YL 质粒图谱；
[0029] 图 3 示 pYA3149_Binlb 质粒图谱；
[0030] 图 4 示 pSG. SS. YL. Binlb 质粒图谱；
[0031] 图 5 示 pSG. SS. C3d. YL. Binlb 质粒图谱；
[0032] 图6示Binlb的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列琼脂糖凝胶电泳鉴定 图；其中，M:DNA Marker DL2000 ;1 :Binlb PCR 产物；2 :Binlb/Bgl II ;3 :Binlb/BamH I ;
[0033] 图7示不同重组质粒转染HEK293细胞后培养上清中表达产物的Western blot 分析；其中，A :pSG. SS. YL 转染结果；B :pSG. SS. C3d3. YL-Binlb 转染结果；C :pSG. SS. YL-Binlb转染结果。
【具体实施方式】：
[0034] 本发明公开了一种避孕节育DNA疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的DNA疫苗及其制备方法已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0035] 本发明实施例所涉及的主要材料及其试剂如下：
[0036] 昆明小鼠雄性，体重20~22g/只，均为8周龄以上健康有生育力成年鼠；
[0037] 酶联免疫检测仪（美国Biorad)，96孔酶标板（丹麦NUNC);
[0038] HEK293细胞和Raji细胞购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC)；
[0039] 分子生物学操作所用工具酶购自日本TaKaRa公司；
[0040] 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Omega公司；
[0041] 胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxford公司；
[0042] 琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工生物技术服务有限公司；
[0043] DMEM购自美国Gibco公司；
[0044] 引物由上海鼎安生物科技有限公司合成；
[0045] 脂质体转染剂Lipofetamine 2000购自美国Invitrogen公司；
[0046] 抗Binlb羊抗多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司（SPAG11A/B，K-13， sc-103236)；
[0047] SP9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
[0048] FITC标记的兔抗羊IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。
[0049] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0050] 实施例1 :本发明所述DNA疫苗的制备
[0051] 以pYA3149-Binlb为模板进行PCR扩增反应获得337bp大小的目的片段，琼脂糖 凝胶电泳检测与预期大小一致（图6)。其中，PCR扩增程序为：
[0052] 94°C 预变性 5min ;
[0053] 94°C变性 30s、55°C复性 30s、72°C延伸 60s，循环 30 次；
[0054] 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0055] PCR扩增体系为：
[0056] IOxPCR缓冲液 5ul lOmmol/L dNTPs lul 25umol/L上游引物 lul 25umoi/L下游引物 lul 5IU/ul Taq DNA聚合酶 l ul 模板DNA 3ul
[0057] 加 ddH20 至 50ul，混匀。
[0058] Bgl II分别酶切PCR产物和pSG. SS. C3d3. YL以及pSG. SS. YL，用PCR产物纯化试 剂盒进行回收，对回收产物分别用BamH I进行再酶切，0. 8%琼脂糖凝胶电泳酶切产物后， 紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶，用胶回收试剂盒进行回收。T4DNA连接酶连接 胶回收产物（16°C，lh)。
[0059] 将连接产物转化已准备好的感受态大肠杆菌DH5 a，铺LB琼脂平板（氨苄青霉素 抗性），37°C培养。进行质粒DNA转化。LB培养基重悬细菌，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼 脂平板上，倒置平板待液体吸收后，37°C培养12-16小时，观察抗药菌落的出现。待菌落长 出后挑取单个菌落，小量扩增，提取质粒，获得重组质粒pSG. SS. YL. Binlb和pSG. SS. C3d. YL. Binlb，即 DNA 疫苗。
[0060] 实施例2 :重组质粒的验证
[0061] 对提取后的质粒pSG. SS. C3d3. Binlb 和 pSG. SS. YL. Binlb 用 Bgl II 和 BamH I 双酶 切进行鉴定，以PCR结果为对照。0.8%琼脂糖凝胶电泳酶切结果显示，近337bp处的条带为 酶切后的目的片段，同时测序结果也显示该片段为目的基因，表明pSG. SS. C3d3. YL. Binlb 和 pSG. SS. YL. Binlb 构建成功。
[0062] 实施例3 :重组质粒Binlb表达的间接免疫荧光检测
[0063] pSG. SS. C3d3. YL. Binlb 和 pSG. SS. YL