一种先天性小耳畸形动物模型的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物模型制备技术领域，特别涉及一种先天性小耳畸形动物模型的制 备方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 先天性小耳畸形是由于胚胎时期第一、二鳃弓及其第一鳃沟的发育异常引起的 外、中耳畸形，许多患者还同时伴有同侧下颂骨和面部软组织的发育不良。先天性小耳畸形 是继唇、腭裂之后最为常见的面部畸形，也是导致面部不对称最常见的先天性畸形。
[0003] 动物模型是研究致畸物发病机制的重要手段，可靠、稳定、便于获得的动物模型有 助于研究先天畸形的发病机制、组织学改变及分子水平的研究，为临床预防、诊断及治疗提 供实验证据。目前文献报道的利用啮齿类动物为实验动物的先天性小耳畸形动物模型大部 分为基因敲除或转基因模型，如Rowe等对PACT敲除的小鼠模型的研究，Cousley等对Hfm转 基因小鼠的研究，这些模型虽稳定可靠，但均存在费用高、技术手段相对复杂、一般实验应 用不便等缺点。关于耳廓胚胎发育的实验研究已经有很多年的历史，但目前机制仍不明确。 建立先天性小耳畸形动物模型已成为研究先天性小耳畸形发病机制及早期预防、早期诊断 的关键，但是现有的先天性小耳畸形动物模型操作复杂，成功率极低，为动物模型的建立带 来诸多困难，严重影响后续实验研究工作。 (三)
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种操作简单、成本低、便于复制、可重 复性强，成功率高、相对于转基因或基因敲除制备的先天性小耳畸形动物模型更贴近于疾 病发生的自然过程的先天性小耳畸形动物模型的制备方法，解决了现有技术中存在的问 题。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0006] -种先天性小耳畸形动物模型的制备方法，包括如下操作步骤：
[0007] (1)大鼠饲养及合笼:采用颗粒饲料喂养SD大鼠，喂养期间自由饮水，将SD大鼠按 雌雄比2:1合笼过夜，于次日早检查雌鼠阴道，发现阴栓定为孕0天，于次日中午定位孕0.5 天；
[0008] (2)挑选步骤(1)怀孕雌鼠中皮毛光滑、精神状态良好、无流产迹象的雌鼠，随机分 笼饲养；
[0009] (3)维甲酸干预：于孕8-13.5天，按30-60mg/kg体重的维甲酸剂量，对孕雌鼠进行 皮下注射。
[00?0]步骤(3)维甲酸干预时间在孕9天，干预剂量采用40mg/kg体重注射剂量。
[0011]本发明制备方法以SD大鼠为实验对象，来源方便易得、成本低;通过维甲酸干预， 并采用皮下注射的方式，注射后经局部血液循环进入体内，对大鼠母体的刺激性小，系统毒 性较少，相对于转基因或基因敲除制备的先天性小耳畸形动物模型的建立操作简单，相对 于胃管灌注避开了肝脏的首关效应，避免了肝脏代谢对维甲酸的分解以及维甲酸吸收过快 短期内大量进入母体循环对母体造成的系统毒性，相对于腹腔注射则不直接作用于子宫， 对子宫及胚胎发育的直接扰动小，获得的胚胎数量多，便于重复及测量，相对于现有先天性 小耳畸形动物模型造模成功率几乎为0的结果，成功率大大提升。该种制备方法更贴近疾病 发生、发展的自然过程，保证后续实验更有效的研究发病机制并进行相关检测。 (四） 说明书附图
[0012] 图1为本发明方法制备所得单侧无耳大鼠胚胎；
[0013] 图2为正常胚胎与本发明方法制备所得的异常胚胎头部CT扫描对比。
[0014] 从图1可见，胚胎右侧耳壳存在但较正常明显缩小(箭头所示），左侧未见耳壳及其 掩盖的外耳道;从图2可见，与图片中上方一行的正常胚胎头部相比，下方本发明方法制备 所得的异常胚胎头部狭小，外形异常，骨骼发育明显不良。 (五)
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0016] 实施例1:
[0017] -种先天性小耳畸形动物模型的制备方法，采用如下操作步骤：
[0018] (1)大鼠饲养及合笼:采用颗粒饲料喂养3月龄SD大鼠，喂养期间自由饮水，将SD大 鼠按雌雄比2:1合笼过夜，于次日早检查雌鼠阴道，发现阴栓定为孕0天，于次日中午定位孕 0.5天；
[0019] (2)挑选步骤(1)怀孕雌鼠中皮毛光滑、精神状态良好、无流产迹象的雌鼠，随机分 笼饲养；
[0020] (3)维甲酸干预:将维甲酸用橄榄油溶解，配制成40mg/毫升维甲酸溶液，于孕9天， 按40mg/kg体重的维甲酸剂量，对孕雌鼠进行皮下注射；
[0021] (4)继续常规饲养至孕20天，将孕鼠脱颈处死，固定于操作台，于腹部做大十字切 口，暴露子宫，剪开子宫壁，分离蜕膜团，将胚胎自蜕膜上取下，即得先天性小耳畸形动物模 型，具体体征指标检测如下表1:
[0022] 表 1
[0023]
[0024]由上表1可以看出，孕9天(G9天)干预组与对照组相比，体长及体重不存在明显统 计学差异(P>〇.05)，但其他指标存在明显统计学差异(P〈0.05)，从测量指标可以看出，G9天 干预组对胚胎整体发育影响较小，但对耳廓发育影响较大，相对于正常耳廓为小耳畸形。
[0025] 该剂量在孕9天皮下注射的10只孕鼠全部存活，共获得畸形胚胎72只，成功率高。
[0026] 实施例2:
[0027] -种先天性小耳畸形动物模型的制备方法，采用如下操作步骤：
[0028] (1)大鼠饲养及合笼:采用颗粒饲料喂养2月龄SD大鼠，喂养期间自由饮水，将SD大 鼠按雌雄比2:1合笼过夜，于次日早检查雌鼠阴道，发现阴栓定为孕0天，于次日中午定位孕 0.5天；
[0029] (2)挑选步骤(1)怀孕雌鼠中皮毛光滑、精神状态良好、无流产迹象的雌鼠，随机分 笼饲养；
[0030] (3)维甲酸干预:将维甲酸用橄榄油溶解，配制成30mg/毫升维甲酸溶液，于孕8天， 按30mg/kg体重的维甲酸剂量，对孕雌鼠进行皮下注射；
[0031] (4)继续常规饲养至孕20天，将孕鼠脱颈处死，固定于操作台，于腹部做大十字切 口，暴露子宫，剪开子宫壁，分离蜕膜团，将胚胎自蜕膜上取下，即得先天性小耳畸形动物模 型，具体体征指标检测如下表2:
[0032] 表 2
[0033]
[0034] 由上表2可以看出，孕8天(G8天)干预组与对照组相比，各指标均存在明显统计学 差异(P〈0.001)，从测量指标可以看出，G8天干预组对胚胎