葫芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用
【专利摘要】本发明涉及葫芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，可有效解决围绝经期综合征的治疗用药问题，方法是，将葫芦巴粉碎成粗粉，先加石油醚回流提取，脱脂，弃去石油醚；葫芦巴药渣挥干石油醚，加乙醇浸泡，回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散，得样品液；样品液上AB?8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、质量浓度10%的乙醇、质量浓度80%的乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，加等体积石油醚萃取，弃去石油醚；挥尽有机溶剂，水层冷冻干燥，粉碎，得葫芦巴总黄酮，本发明原料丰富，制备方法简单，具有显著提高子宫指数的作用，改变子宫内膜、腺体、肌层的状态，可有效用于制备治疗围绝经期综合征药物。
【专利说明】
葫芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药，特别是一种萌芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 胡芦巴为豆科一年生草本植物，全株有香气，花期4一6月，果期7-8月。多栽培。主 产河南、安徽等。补肾阳，祛寒湿。治寒疝，腹胁胀满，寒湿脚气，肾虚腰酸，阳痿。
[0003] 围绝经期综合征出现的根本的原因是由于生理性或病理性或手术而引起的卵巢 功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破坏，卵巢分泌的雌激素就会减少。女性全身有 400多种雌激素受体，分布在几乎女性全身所有的组织和器官，接受雌激素的控制和支配， 一旦雌激素减少，就会引发器官和组织的退行性变化，出现一系列的症状。
[0004] 围绝经期综合征中最典型的症状是潮热、潮红。多发生于45~55岁，大多数妇女可 出现轻重不等的症状，有人在绝经过渡期症状已开始出现，持续到绝经后2~3年，少数人可 持续到绝经后5~10年症状才有所减轻或消失。人工绝经者往往在手术后2周即可出现围绝 经期综合征，术后2个月达高峰，可持续2年之久。
[0005] 1.月经改变
[0006] 月经周期改变是围绝经期出现最早的临床症状，分为3种类型：
[0007] (1)月经周期延长，经量减少，最后绝经。
[0008] (2)月经周期不规则，经期延长，经量增多，甚至大出血或出血淋漓不断，然后逐渐 减少而停止。
[0009] (3)月经突然停止，较少见。由于卵巢无排卵，雌激素水平波动，易发生子宫内膜 癌。对于异常出血者，应行诊断性刮宫，排除恶变。
[0010] 2.血管舒缩症状
[0011]临床表现为潮热、出汗，是血管舒缩功能不稳定的表现，是围绝经期综合征最突出 的特征性症状。潮热起自前胸，涌向头颈部，然后波及全身，少数妇女仅局限在头、颈和乳 房。在潮红的区域患者感到灼热，皮肤发红，紧接着爆发性出汗。持续数秒至数分钟不等，发 作频率每天数次至30~50次。夜间或应激状态易促发。此种血管功能不稳定可历时1年，有 时长达5年或更长。
[0012]现虽有治疗围绝经期综合征的多种药物，但由于种种原因，其使用和疗效并不尽 人意，因此，研制新的治疗围绝经期综合征的药物势在必行，那么能否将萌芦巴总黄酮用于 制备治疗围绝经期综合征的药物至今未见有公开报导。
【发明内容】
[0013]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种萌芦巴总黄 酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，可有效解决围绝经期综合征的治疗用药问 题。
[0014] 本发明解决的技术方案是，一种萌芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中 的应用，所述的萌芦巴总黄酮是，将萌芦巴粉碎成粗粉，先加石油醚回流提取，脱脂，弃去石 油醚;萌芦巴药渣挥干石油醚，加乙醇浸泡，回流提取，提取液减压回收乙醇至无醇味，加蒸 馏水分散，得样品液;样品液上AB-8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、质量浓度10%的乙醇、 质量浓度80%的乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，加等体积石油醚 萃取1次，弃去石油醚;挥尽有机溶剂，水层冷冻干燥，粉碎，得萌芦巴总黄酮。
[0015] 本发明原料丰富，制备方法简单，具有显著提高子宫指数的作用，改变子宫内膜、 腺体、肌层的状态，可有效用于制备治疗围绝经期综合征药物，开拓了萌芦巴的新用途。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体情况对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0017] 本发明在具体实施中，可由以下方式给出。
[0018] 一种萌芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，所述的萌芦巴总黄 酮是，将萌芦巴粉碎成过20-30目筛的粗粉，粗粉加10倍重量体积的石油醚(沸程60-90°C) 回流提取lh，脱脂，弃去石油醚;粗粉再加10倍重量体积的石油醚(沸程60-90°C)回流提取 Ih，脱脂，弃去石油醚，重量体积是指固体以g计，液体以ml计，萌芦巴药渣挥干石油醚，加粗 粉10倍重量、质量浓度80%的乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，滤过，合并滤液，减压回 收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药量〇.3g/ml，得样品液;样品液上AB-8型大 孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液;继用4倍柱体积、质量浓度10%的乙醇 洗脱，弃去洗脱液;再用6倍柱体积、质量浓度80 %的乙醇洗脱，收集80 %乙醇洗脱液，减压 回收乙醇至无醇味，加等体积石油醚萃取1次，弃去石油醚;挥尽有机溶剂，水层冷冻干燥， 粉碎，得萌芦巴总黄酮。
[0019] 本发明萌芦巴总黄酮经实地试验，可有效用于制备治疗围绝经期综合征的药物， 实现萌芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，有关试验资料如下：
[0020] 1.材料与方法
[0021] 1.1实验材料
[0022] 1.1.1实验动物
[0023] Wistar大鼠，SPF级；性别：雌性;体重：250-270g，提供单位：山东鲁抗医药股份有 限公司；动物合格证号：37005400000027;实验伦理编号:DWLL16020050;河南中医学院动物 实验中心许可证号:SYXK(豫)2015-0005。。
[0024] 1.1.2实验药物
[0025]萌芦巴总黄酮；
[0026]更年安胶囊，山西黄河中药有限公司生产，批号150102;大豆异黄酮维E软胶囊，威 海紫光生物科技开发有限公司生产，批号14100301。
[0027] 1.1.3实验试剂
[0028] 水合氯醛，天津市科密欧化学制剂开发中心，批号20140807 ;羧甲基纤维素钠，天 津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20140728;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公 司，生产批号F4046509; 0.9%氯化钠注射液，河南科伦药业有限分司，批号C2015041601-1; 甲醛溶液(分析纯），烟台市双双化工有限公司，批号20150401;酒精:新乡市三伟消毒制剂 有限公司生，产批号20140905;抗ER多克隆抗体，美国Abeam公司，批号GR134998-6;抗AR多 克隆抗体，美国Abeam公司，批号GR223770-2;兔-IgG免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程 有限公司，批号10108A;大鼠 E2ELISA检测试剂盒，R&D公司，批号20150101A;大鼠 T ELISA检 测试剂盒，R&D公司，批号20150101A;大鼠 LH ELISA检测试剂盒，R&D公司，批号20150101A; 大鼠 FSH ELISA检测试剂盒，R&D公司，批号20150101A;大鼠 GnRH ELISA检测试剂盒，R&D公 司，批号20150IOlA;大鼠 BGP ELISA检测试剂盒，R&D公司，批号20150IOlA;大鼠 β-ΕΡ ELISA 检测试剂盒，R&D公司，批号20150101Α。
[0029] K1.4实验仪器
[0030]电子称，上海民桥医疗器械有限公司，型号JY601;电子分析天平，奥豪斯(上海)公 司，型号AR1140/C;高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂，型号TGL-168;开场活动试验箱， 成都泰盟软件有限公司，型号0FT-100;电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司，型号 HffS12;电动显微镜，日本OLYMPUS公司，型号BX61;酶标仪，美国BIO-RAD公司型号:680;可调 式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司;X3R高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公 司；Real-time 检测仪:ABI(ABI-7300)公司产品。
[0031] 1.2实验方法
[0032] 1.2.1造模与给药
[0033] 造模方法:取体重250~270g雌性wistar大鼠84只，随机取10只作为空白组外，做 假手术处理，其余大鼠造围绝经期模型。大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g) 麻醉后腹位固定，然后从大鼠背部最末肋骨下，在腋中线和距脊柱外侧约2cm交叉处去毛 (用动物专用推子去毛），碘酒消毒后切开皮肤和背肌约lem，切口视野中可见一乳白色发亮 的脂肪团，卵巢即包埋其中。用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，即可见到 一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪）用细线结扎，完 全摘除左侧卵巢，右侧摘除80%。术后用生理盐水棉球擦拭后将子宫角放回腹腔中，缝合肌 肉及皮肤。术后精心饲养，肌肉注射青霉素20万u/kg(每只0.1 mL)以防感染，连续3d，每天1 次。选择60只状态良好的大鼠随机均匀分为6组供实验用，分别为模型组，更年安胶囊组，大 豆异黄酮软胶囊组，大、中、小剂量萌芦巴总黄酮组。
[0034] 配药:0.5 % CMC配制方法:称取羧甲基纤维素钠4g，用蒸馏水配成800ml。
[0035] (1)大、中、小剂量萌芦巴总黄酮组给药剂量分别为200mg · kg-1UOOmg · kg-\ 50mg · kg<(相当于临床用量的20、10、5倍，给药体积lml/100g)。配置方法:分别取萌芦巴总 黄酮8粒、4粒、2粒，先混悬于少量的0.5 % CMC溶液，然后再定容到120ml，混匀，即为所需萌 芦巴总黄酮大、中、小剂量混悬液。
[0036] (2)更年安胶囊(450mg · kg^1，浓度45mg · ml/1，相当于临床用量的10倍）；配置方 法:取更年安胶囊15粒，先混悬于少量的0.5 % CMC溶液，然后再定容到100mL，混匀，即为所 需更年安胶囊混悬液。
[0037] (3)大豆异黄酮维E软胶囊（167mg · kg'配成16.7mg · ml/1，相当于临床用量的10 倍）；配置方法：取大豆异黄酮胶囊4粒，先混悬于少量的0.5%CMC溶液，然后再定容到 120ml，混勾，即为所需大豆异黄酮混悬液。
[0038]储存方法:冷藏，用时隔水温热
[0039]给药方法:各组动物于手术后第10天给予相应药物。更年安胶囊组灌服更年安胶 囊混悬液450mg · kg^1，大豆异黄酮软胶囊组灌服大豆异黄酮软胶囊混悬液167mg · kg^1， 大、中、小剂量萌芦巴总黄酮组分别组别灌服大、中、小剂量萌芦巴总黄酮200mg · kg^1、 IOOmg · kg'50mg · kg'空白组和模型组分别灌服同体积蒸馏水，每日灌胃给药1次，连续 给药30d。
[0040] 1.2.2观察项目及检测方法 [0041 ] 1.2.2.1观察项目
[0042] 各组大鼠于给药第29天时测定大鼠开场活动(Open field)。末次灌胃后2h，取血， 测定血清中E2、T、LH、FSH、GnRH、BGP的含量，血浆β-ΕΡ含量;处死大鼠后，摘除胸腺、脾脏、子 宫，称量其湿重并计算脏器指数，然后取脑，将左侧下丘脑、垂体、子宫固定于10%福尔马林 溶液中，用免疫组化法测下丘脑、垂体、子宫中ER表达，下丘脑、垂体中AR表达。
[0043] 1.2.2.2检测方法
[0044] (I)Open field法测试
[0045] 各组大鼠于给药29天时测定大鼠开场活动(Open field)，观察大鼠3min内站立次 数和水平活动距离。
[0046] (2)试剂盒测定方法：
[0047]血清标本的获取:使用不含热原和内毒素的试管，取血过程中避免任何刺激，防止 溶血;收集血液后，3000转离心10分钟后，将血清和红细胞迅速小心的分离。
[0048]血浆标本的获取:肝素抗凝管抗凝。3000转离心30分钟取上清。
[0049] 试剂盒的测定:大鼠雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、促性腺激素释 放激素(GnRH)、骨钙素(BGP/0CN)、β-内啡肽(β-ΕΡ)ELISA检测试剂盒测定方法，详见说明 书。
[0050] 2.3统计学处理方法
[0051]实验结果用SPSS17.0统计软件进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数土 标准差(x±s)的形式表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用LSD法进行检 验，方差检验不齐者用Games-Howe 11法检验，等级资料米用Ridit检验。
[0052] 2.结果
[0053] 2.1对围绝经期大鼠大鼠旷场活动的影响
[0054] 表1萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠旷场活动的影响(x±s)
[0056] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较 [0057]由上表可知，与空白组相比，模型组大鼠的活动距离和站立次数都显著减少（P〈 0.01);反映了大鼠对新鲜环境的好奇程度降低。与模型组比较，大剂量萌芦巴总黄酮组与 更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊均能使大鼠活动距离和站立次数显著增加(p〈0.01)。
[0058] 2.2对围绝经期大鼠脏器指数的影响
[0059] 对围绝经期模型大鼠胸腺、脾脏、子宫指数的影响，见表12
[0060] 表2萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠胸腺、脾脏、子宫、肾上腺指数的影响(x±s)
[0062] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较
[0063] 由上表可看出，与空白组比，模型组大鼠的胸腺指数、脾脏指数、子宫指数显著下 降(P〈0.01)，说明不完全摘除卵巢所致围绝经期大鼠模型出现胸腺、脾脏和子宫萎缩。与模 型组比，大、中、小剂量萌芦巴总黄酮组与更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊可显著提高围绝 经期模型大鼠胸腺指数、脾脏指数、子宫指数、肾上腺指数(P〈〇.01)。
[0064] 2.3对血清生化指标的影响
[0065] 对围绝经期模型大鼠 E2、T、LH、FSH的影响见表13、14。
[0066] 表3萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠 E2、LH、F SH的影响(X土s )
[0068] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较
[0069] 表4萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠 FSH、LH的影响(x±s)
[0071] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较 [0072]由上表可看出，与空白组比，模型组大鼠的血清E 2、T水平显著下降（P〈0.01)，LH、 FSH水平显著升高(P〈0.01)，说明不完全摘除卵巢致围绝经期大鼠模型性激素紊乱，围绝经 期大鼠模型复制成功。与模型组比，更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊、大剂量萌芦巴总黄酮 组可以显著的升高E2、T的水平和降低FSH、LH的水平。
[0073] 表5萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠 GnRHj-EP的影响Cx士s)
[0075] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较 [0076]由上表可看出，与空白组比，模型组大鼠的血清GnRH水平显著升高、血浆β-ΕΡ水平 显著下降(Ρ〈〇.01)，说明不完全摘除卵巢致围绝经期大鼠模型性激素紊乱，因负反馈调节 导致下丘脑分泌的相关激素也发生紊乱。与模型组比，大、中剂量萌芦巴总黄酮组、大豆异 黄酮软胶囊组、更年安胶囊组GnRH水平可显著升高(Ρ〈0.01)。各用药组β-ΕΡ水平可显著降 低(Ρ〈0·01)〇
[0077] 表6萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠 BGP的影响(x±s)
[0079] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较 [0080]由上表可看出，与空白组比，模型组大鼠的血清BGP水平均显著降低(P〈0.01)，说 明不完全摘除卵巢所致围绝经期大鼠模型骨钙质有所降低。与模型组比，大、中、小剂量萌 芦巴总黄酮组、大豆异黄酮软胶囊组、更年安组BGP水平可显著升高(P〈0.01)。
[0081 ] 2.4对免疫组化指标的影响
[0082]对围绝经期模型大鼠子宫、垂体、下丘脑中ER的表达以及垂体、下丘脑中AR的影响 [0083] 表7萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠垂体、下丘脑、子宫（ER)表达的影响（平均光密 度)（x±S)
[0085] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较
[0086] 表8萌芦巴总黄酮对围绝经期大鼠垂体、下丘脑(AR)表达的影响（平均光密度） (：X±S^)
[0089] 注:ΛΛΡ〈0.01，表示与空白组比较;*P〈0.05，#P〈0.01，表示与模型组比较 [0090]由上表可看出，与空白组比较，模型大鼠各组织ER、AR的表达均显著降低（P〈 0.01)，说明不完全摘除降低了雌雄激素的生物效应。与模型组比较，大剂量萌芦巴总黄酮、 更年安胶囊和大豆异黄酮软胶囊能够显著升高ER在子宫、垂体、下丘脑的表达(P〈0.01 )，显 著升高AR在垂体、下丘脑的表达(P〈0.01)。
[0091] 3.结论
[0092] 萌芦巴总黄酮对大鼠围绝经期模型有好的改善作用，萌芦巴总黄酮能使大鼠活动 距离和站立次数显著增加，可显著提高围绝经期模型大鼠胸腺指数、脾脏指数、子宫指数、 肾上腺指数。萌芦巴总黄酮可显著升高E2、T水平和降低FSH、LH水平。萌芦巴总黄酮组GnRH 水平可显著升高，β-ΕΡ水平可显著降低。萌芦巴总黄酮组BGP水平可显著升高。萌芦巴总黄 酮可显著升高ER在子宫、垂体、下丘脑的表达，显著升高AR在垂体、下丘脑的表达。有效用于 制备治疗围绝经期综合征的药物，是治疗围绝经期综合征药物上的创新，具有实际的应用 价值。
【主权项】
1. 一种萌芦巴总黄酮在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，所述的萌芦巴总黄酮 是，将萌芦巴粉碎成过20-30目筛的粗粉，粗粉加10倍重量体积的石油醚回流提取lh，脱脂， 弃去石油醚;粗粉再加10倍重量体积的石油醚回流提取lh，脱脂，弃去石油醚，重量体积是 指固体以g计，液体以ml计，萌芦巴药渣挥干石油醚，加粗粉10倍重量、质量浓度80%的乙醇 浸泡〇.5h，回流提取2次，每次lh，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至 相当于含生药量0.3g/ml，得样品液;样品液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水 洗脱，弃去水液;继用4倍柱体积、质量浓度10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液;再用6倍柱体积、质 量浓度80%的乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，加等体积石油醚萃取 1次，弃去石油醚;挥尽有机溶剂，水层冷冻干燥，粉碎，得萌芦巴总黄酮。
【文档编号】A61K36/48GK105943591SQ201610406883
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】苗明三, 曹利华, 孙丽敏
【申请人】河南中医学院