一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂及其制备与应用
【专利摘要】本发明公开一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂及其制备与应用，属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域。该复方制剂由下列原料药按重量百分比制成：苦参20～40％，白薇60～80％。该复方制剂的制备方法是将各原料药分别干燥后粉碎，过筛，得各原料药干粉；将所得原料药干粉按重量百分比组成，混合，再加入95％的乙醇，浸泡提取2次，得到总提取液；将所得总提取液减压浓缩，所得浓缩液干燥至恒重，得到鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂。本发明的中草药复方制剂具有易分解，无残留及对环境和人安全的优点，降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦参抗小瓜虫的药效，其成本大大降低，易于产业化生产及推广，在水产上具有广阔应用前景。
【专利说明】
一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂及其制备与应用
技术领域
[0001]本发明属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域，特别涉及一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是一种全球分布的寄生纤毛虫，主要寄生于淡水鱼的皮肤、鳃和鳍，引起小瓜虫病，又称“白点病”，给水产养殖业造成巨大经济损失。目前主要通过化学药物来防治小瓜虫病，但是化学药物存在污染环境和危害人类健康的风险，尤其是在孔雀石绿被禁用后，市场上缺少有效防治小瓜虫病的药物。中草药植物具有易分解，无残留及对环境和人安全的优点，具有开发成安全高效绿色渔药的前景。目前，已发现部分抗小瓜虫的植物种类，其中，从白薇中分离鉴定了迄今为止杀小瓜虫效果最好，且安全性高的活性化合物直立白薇苷C，然而该活性化合物在白薇中的含量仅为
0.0031%，成本太高，难以商业化，而白薇的酒精粗提物可以大大降低成本，同时也有良好的杀小瓜虫活性，但是白薇酒精粗提物的毒性较高，连续用低于最低杀小瓜虫成虫浓度(8mg/L)的白薇粗提物治疗患小瓜虫病的草鱼7天，全部鱼中毒死亡。另一种中药苦参也具有抗多子小瓜虫作用，虽然其粗提物的毒性低，但杀小瓜虫活性也较低。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂。该中草药复方制剂低毒、易分解、对环境友好。
[0004]本发明另一目的在于提供所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂的制备方法。
[0005]本发明再一目的在于提供所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂的应用。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂，该中草药复方制剂由下列原料药按重量百分比制成:苦参(Sophora f lavescens)20?40%，白薇(Cynanchum atratum)60?80%。
[0008]优选地，苦参(Sophoraflavescens)30%，白薇(Cynanchum atratum)70%。
[0009]所述的苦参产于浙江，所述的白薇产于安徽。
[0010]所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0011](a)将各原料药分别干燥后粉碎，过筛，得各原料药干粉；
[0012](b)将步骤(a)所得原料药干粉按重量百分比组成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到总提取液；
[0013](c)将步骤(b)所得总提取液减压浓缩，所得浓缩液干燥至恒重，得到鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂。
[0014]步骤(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干；
[0015]步骤(a)中所述的过筛的目数为40?60目，优选为50目。
[0016]步骤(b)中所述的95%乙醇的体积为各原料药干粉混合物的重量的10?15倍，优选为1倍。
[0017]步骤(b)中所述的浸泡的温度为室温，所述的浸泡的时间为18?36h，优选为24h。
[0018]步骤(c)中所述的减压浓缩的温度为70?80°C;
[0019]步骤(c)中所述的干燥的条件是在烘箱中55?65°C下干燥。
[0020]所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂在制备杀灭多子小瓜虫的饲料添加剂或饲料中的应用。
[0021]本发明的原理是:该中草药复方中的每一种中草药都具有杀灭多子小瓜虫的功能。据报道，苦参其根部用于治疗病毒性肝炎、病毒性心肌炎、肠胃出血和皮肤疾病，如湿疹、阴道炎和牛皮癣等，还具有退热、抗肿瘤和抗心肌衰弱等生物功能。日本学者已经证明苦参碱和氧化苦参碱具有杀灭刺激隐核虫的抗寄生虫效果，张其中等人也报道了苦参粗提物抗多子小瓜虫活性。
[0022]白薇为萝蘑科鹅绒藤属植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根。白薇具有抗烟草花叶病毒、抗炎、治疗失忆症和抑制乙酰胆碱酶等功能。张其中等人已经报道了白薇中的直立白薇苷C具有特别好的杀小瓜虫活性。
[0023]因此，将白薇和苦参两种中药配合组成复方，该复方既有良好的抗小瓜虫活性，毒性又低，商业化前景广阔。
[0024]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0025](I)本发明的中草药复方制剂，一方面，克服了孔雀石绿和汞制剂禁用药物毒性大，残留高，具有“三致”作用的缺点，具有易分解，无残留，对环境和人安全的优点，另一方面，也降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦参抗小瓜虫的药效，大大降低了成本，易于产业化生产及推广。该复方具有预防与治疗多子小瓜虫病的作用，在水产上具有广阔应用前景。
[0026](2)本发明的制作工艺简单易行，工厂和个体养殖者都可制备出符合要求的制剂。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028]实施例中用到的寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，来源于广州市花都区五星村鱼苗场。寄生虫模型为多子小瓜虫(Ichthyophthirius multif iliis)，来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。
[0029]实施例1:苦参与白薇对多子小瓜虫幼虫的杀灭作用
[0030](I)中草药乙醇浸膏的制备:将苦参和白薇分别置于55°C烘箱中干燥后粉碎，过50目筛，分别得到干粉;将50g苦参和白薇分别放于中药材提取罐中，再加入500mL 95%的乙醇，室温浸泡提取24h，重复2次，得到总提取液;将总提取液在旋转蒸发仪中进一步减压浓缩，所得浓缩液置于55 °C烘箱中干燥至恒重。
[0031 ] (2)中草药药液的配制:分别称取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用含0.10ADMSO的蒸馏水进行溶解，配成2560mg/L的药物原液，储存于4 °C冰箱备用。
[0032](3)幼虫活性检测:将含有大约600个多子小瓜虫幼虫的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10(^1^不同浓度的药液，使最终浓度为128、64、32、16、12、8、4、2和01!^/L，每个浓度设置3个平行，实验温度控制在23±0.5°(:。4倍显微镜下统计4h内幼虫的死亡时间。
[0033]结果显示:苦参和白薇乙醇粗提物杀灭多子小瓜虫幼虫的最低浓度分别为8和16mg/L，全部致死时间分别为13(^P124min。
[0034]实施例2:苦参与白薇联用药敏试验
[0035](I)中草药乙醇浸膏的制备同实施例1。
[0036](2)中草药药液的配制同实施例1。
[0037](3)根据苦参和白薇乙醇浸膏对多子小瓜虫感染性幼虫活性实验的结果，分别以其MIC开始进行两倍浓度梯度稀释，每种中草药稀释4个浓度梯度。采用棋盘交叉法，每种复方最终检测浓度为16个浓度梯度。同时以2MIC、MIC、1/2MIC和不加药的0.1 %DMS0的蒸馏水作为对照组，进行离体杀灭幼虫实验。中草药联用实验以FIC指数作为联用药敏实验的判定依据。FIC指数=(联用后A药的MIC值/联用前A药的MIC值)+ (联用后B药的MIC值/联用前B药的MIC值)，判断标准:FIC指数<0.75时，为协同作用;FIC指数=1时，为累加作用；KFIC指数<2时，为无关作用;FIC指数多2时，为拮抗作用。FIC指数越小，协同作用越强，若FIC指数<0.5，则认为两药有显著协同作用。
[0038]结果显示:苦参与白薇联用后所得FIC值为I，表明具有累加作用。
[0039]实施例3:中草药复方对多子小瓜虫幼虫的杀灭作用
[0040](I)中草药复方乙醇浸膏的制备:苦参120g，白薇280g，总重量400g，置于中药材提取罐中，再加入4L 95%的乙醇，室温浸泡提取24h，重复2次，得到总提取液;将总提取液在旋蒸仪中进一步减压浓缩，所得浓缩液置于55°C烘箱中干燥至恒重，得到鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂。
[0041 ] (2)中草药复方药液的配制:称取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用20yL无水乙醇促溶，然后用蒸馏水配成2560mg/L的药物原液，储存于4°C冰箱备用。以最高浓度药液中的无水乙醇含量(0.13%)作为标准，配制含0.13%无水乙醇的对照组处理液。
[0042](3)幼虫活性检测:将含有大约600个多子小瓜虫幼虫的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10yL不同浓度的药液，使最终浓度为128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每个浓度设置3个平行，实验温度控制在23±0.5°(:。4倍显微镜下统计4h内幼虫的死亡时间和第4h幼虫的死亡率，计算出EC5Q。计算公式如下:
[0043]死亡率(% ) = (1-实验组幼虫个数/对照组幼虫个数)X 100%。
[0044]结果显示:中草药复方在12mg/L浓度下，115min能够使感染性幼虫100%致死，并且随着药物浓度的增加，致死时间变短。
[0045]实施例4:中草药复方对多子小瓜虫成虫的杀灭作用
[0046](I)中草药复方乙醇浸膏的制备同实施例3。
[0047](2)中草药复方药液的配制同实施例3。
[0048](3)成虫活性检测:将含有大约60个成虫的200yL的水溶液加入24孔板的各孔中，随后加入200yL不同浓度的药液，使最终浓度为128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每个浓度设置3个平行。4倍显微镜下记录5h内成虫的死亡时间和第5h的死亡率，计算出半数有效浓度(EC5q)。接着将24孔板静置于23±0.5°C温度条件下，统计6h各孔存活成虫形成的包囊个数，经过17h，包囊释放出感染性幼虫，统计平均每个包囊释放出感染性幼虫的数量，计算公式如下:
[0049]死亡率(%) = (1-实验前成虫个数/实验后成虫个数)X 100% ;
[0050]平均每个包囊释放出感染性幼虫数=各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。
[0051 ] 结果显示:12mg//L浓度下的中草药复方在202min内可全部杀灭多子小瓜虫成虫，并且随着浓度升高，全部致死时间变短。8mg/L的中草药复方5h内的杀虫率为85%，并且能够完全抑制形成的包囊释放出感染性幼虫。
[0052]实施例5:中草药复方对多子小瓜虫包囊的杀灭作用
[0053](I)中草药复方乙醇浸膏的制备同实施例3。
[0054](2)中草药复方药液的配制同实施例3。
[0055](3)包囊活性检测:将含有大约60个成虫的200yL水溶液加入24孔板各孔中，而后将24孔板静置于23 ± 0.5 °C温度条件下6h，待全部形成包囊并统计各孔包囊个数，然后加入20(^1^不同浓度的药液，使最终浓度为128、64、32、16、12、8、4、2、1和011^/1，每个浓度设置3个平行。在23±0.5°C条件下静置16h，待全部包囊释放出感染性幼虫后，统计每个包囊平均释放出幼虫的数量。
[0056]平均每个包囊释放出感染性幼虫数=各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。
[0057]结果显示:中草药复方浓度在8mg/L及以上，能够完全抑制包囊释放出感染性幼虫。另外，随着药物浓度的降低，平均每个包囊释放出的感染性幼虫数增加。
[0058]实施例6:低浓度中草药复方对多子小瓜虫幼虫感染力的影响
[0059](I)中草药复方乙醇浸膏的制备同实施例3。
[0060](2)中草药复方药液的配制:根据实施例3的方法，配制成16、8、4、2和Omg/L的药液各50mL。
[0061 ] (3)取大约含有100000个感染性幼虫的1mL虫液加入50mL烧杯中，再加入1mL药液，混匀，使最终浓度为8、4、2、I和Omg/L的药液，然后在23 ± 0.5 °C静置Ih。取150尾健康草鱼随机平均分配到15个水族箱中(事先准备15个装有4L曝气自来水的水族箱，每个水族箱10尾鱼)。将被药液处理过的感染性幼虫倒入各水族箱中，让平均每条鱼10000只感染性幼虫感染草鱼，每一处理浓度设置3个平行。感染2h后，每个水族箱的曝气自来水体积加至10L，由充氧栗供氧，实验温度保持在23±0.5°C。每天观察草鱼的存活情况，如有死鱼及时捞出，以免影响水质。实验第七天，用150mg/L的麻醉剂(MS-222)(Sigma)麻醉草鱼，记录每尾草鱼体表的白点数，并统计感染率和感染强度。
[0062]感染率=(体表有白点的鱼数/总鱼数)X100% ;
[0063]感染强度=体表白点总数/体表有白点的鱼数。
[0064]结果显示:8mg/L的中草药复方能显著阻止多子小瓜虫感染草鱼，且感染强度仅为3.8±4.0。处理浓度在4mg/L时感染强度和感染率与对照相比差异显著。表明，低浓度的中草药复方能降低多子小瓜虫幼虫的感染能力。
[0065]实施例7:中草药复方预防和治疗小瓜虫病效果
[0066](I)中草药复方乙醇浸膏的制备同实施例3。
[0067](2)中草药复方药液的配制:称取5g的中草药复方乙醇浸膏，根据实施例3，配制成10000、50000、25000 和 Omg/L 的药液各 50mL。
[0068](3)选择轻度感染的草鱼(体表白点数为37± 13.6)随机分配到21个含有60L曝气自来水的10L水族箱中，每个水族箱5尾已感染小瓜虫草鱼。随后向每个水族箱中加入10尾健康草鱼混养。温度保持在23±0.5°C。随后向水族箱中加入上述配制的原药液，混匀，使最终浓度为5、4、2和Omg/L，每个浓度设置3个平行。实验期间，每天加入与第一天体积相同的原药液，观察鱼的存活情况(如有死鱼，及时捞出，以免影响水质)，随机麻醉(150mg/L MS-222)3尾患病草鱼，计数其体表白点数。若无白点，所对应浓度的实验组停止用药，记录治疗时间，用150mg/L的麻醉剂(MS-222) (Sigma)麻醉全部草鱼，记录每尾草鱼体表的白点数，统计感染率、感染强度和存活率。在实验第8天，全部实验组停止加药，并统计感染率、感染强度和存活率，同时更换50 %无药液的新鲜曝气自来水。在第25天，记录存活草鱼体表的白点数，并统计各实验组的感染率、感染强度和存活率。计算公式如下:
[0069]感染率(％)=(体表有白点的鱼数/总鱼数)X 100% ;
[0070]感染强度=体表白点总数/体表有白点的鱼数；
[0071 ] 存活率(% )=(实验后存活鱼数/总鱼数)X 100%。
[0072]结果显示:中草药复方在5mg/L浓度下，药物累加治疗8天，预防与治疗多子小瓜虫病，实验组已感染草鱼与未感染草鱼的感染率和感染强度均为0，存活率均为100%。药物在4mg/L浓度下，未感染鱼的感染率为0，被感染鱼的感染率下降到73.3%，且感染强度与对照组相比，显著降低。
[0073]实施例8:中草药复方对鱼的急性毒性实验
[0074](I)中草药复方乙醇浸膏的制备同实施例3。
[0075](2)中草药复方药液的配制同实施例7。
[0076](3)预实验:中草药复方使草鱼24h全部致死的浓度为190mg/L，96h不发生死亡的浓度 90mg/L。
[0077]事先18个装有1L曝气自来水的水族箱，每个水族箱放10尾健康草鱼，温度控制在
23± 0.5 °C，并由充氧栗供氧。在预实验的基础上，再设置170、130、100和Omg/L，每个浓度3个平行重复，进行急性毒性实验。实验期间，随时观察各浓度组实验鱼的中毒情况，如发现草鱼中毒死亡，立即捞出，以免破坏水质，影响实验结果。记录在24、48、72、和96h各个浓度组，草鱼的死亡数量。根据草鱼死亡数及死亡时间，计算24h、48h、96h半致死浓度(LC5q)和对草鱼的安全浓度。
[0078]结果显示:中草药复方对草鱼24、48、96h的半致死浓度(LC5q)分别为164.2mg/L，152.5mg/L，136.9mg/L;对草鱼安全浓度为39.5mg/L。中草药复方安全浓度是其预防与治疗浓度的8倍左右，对鱼绝对安全。
[0079]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂，其特征在于:该中草药复方制剂由下列原料药按重量百分比制成:苦参(Sophora f Iavescens)20?40%，白薇(Cynanchumatratum)60?80%。2.根据权利要求1所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂，其特征在于:该中草药复方制剂由下列原料药按重量百分比制成:苦参30%，白薇70%。3.权利要求1或2所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (a)将各原料药分别干燥后粉碎，过筛，得各原料药干粉； (b)将步骤(a)所得原料药干粉按重量百分比组成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到总提取液； (c)将步骤(b)所得总提取液减压浓缩，所得浓缩液干燥至恒重，得到鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(a)中所述的过筛的目数为40?60目。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(b)中所述的95%乙醇的体积为各原料药干粉混合物的重量的10?15倍。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(b)中所述的浸泡的温度为室温，所述的浸泡的时间为18?36h。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(c)中所述的减压浓缩的温度为70?80°C。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于: 步骤(c)中所述的干燥的条件是在烘箱中55?65°C下干燥。10.权利要求1或2所述的鱼用防治多子小瓜虫病的中草药复方制剂在制备杀灭多子小瓜虫的饲料添加剂或饲料中的应用。
【文档编号】A61K36/489GK106038682SQ201610569132
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】张其中, 林德杰
【申请人】暨南大学