10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于渔药技术领域，具体涉及一种10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛 虫药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 鱼类体外寄生纤毛虫病是危害淡水养殖业的严重疾病。多子小瓜虫作为鱼类体外 寄生纤毛虫类的一种，对寄主无选择性，可感染草鱼，淡水白鲳和斑点叉尾鮰等多种淡水和 咸淡水养殖鱼类。该虫主要寄生在鱼鳃、鳍和皮肤上，导致寄生处上皮细胞增生，出现许多 小白点，因此，小瓜虫病又称"白点病"。该病分布广泛，遍及全球，我国每年4月~6月和9 月~11月，水温为20°C~24°C，是小瓜虫病的流行盛期。该病主要危害鱼苗和鱼种，发病 快，死亡率高，极难治愈。
[0003] 生产上过去一直使用孔雀石绿、硝酸亚汞和醋酸亚汞防治多子小瓜虫病。但由于 此类药物高毒高残留，污染环境，危害消费者健康，均已被禁止使用。我国具有丰富的中草 药资源，毒性小，残留低，长期用于人畜疾病治疗，安全可靠，也满足无公害绿色水产品生产 中对病害防治的安全性要求。因此，植物源渔用杀虫药具有广阔开发前景。研究发现，一些 中草药提取物中存在杀灭多子小瓜虫的活性物质。
[0004] 生姜（Zingiber officinale)是姜科多年生草本植物姜的新鲜根莖，味辛，性微 温，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳的功效，常用于风寒感冒、脾胃寒症、肺寒咳嗽等。采 用活性追踪法，分离、纯化和鉴定了生姜中的活性化合物10-姜酚，首次发现该化合物具有 杀灭多子小瓜虫的活性，在文献[Phytochemistry, 48 (5)，889-891]中已公开了该化合物 的结构，其结构式为：
[0006] 分子式为C21H34O4，分子量350. 49,白色结晶或油状液体，味辣而苦。相对密度 1. 0713。折射率1. 5212,沸点235~240°C (2. 39kPa)。微溶于水，可溶于乙醇、乙醚、氯仿、 苯、醋酸。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种10-姜酚在制备防 治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 10-姜酚作为原料在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
[0010] 所述的鱼类体外寄生纤毛虫指的是多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis)〇
[0011] 所述的药物的剂型优选为药液、药膏或粉剂。
[0012] 所述的10-姜酚的有效浓度为4~16mg/L。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0014] (1)10-姜酚来源于食药两用的生姜，属姜科多年生草本植物，同时，该化合物对草 鱼的半致死浓度（85.431^/1)是其防治多子小瓜虫病最低有效浓度（411^/1)的21.4倍，使 用安全性高，解决了目前防治鱼类体外寄生纤毛虫病存在的不安全问题。
[0015] (2)本发明首次将10-姜酚应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物中，特别是用于 杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内即能100%杀灭该虫，起到有效治疗和预防多子小瓜虫 病的作用。
[0016] (3)本发明首次报道了 10-姜酚杀灭多子小瓜虫活性，防治小瓜虫病的有效浓度 为4~16mg/L，效果好。
[0017] (4)本发明的原料来源丰富，生姜是亚洲的一种传统药食两用植物，对人安全，无 环境残留；在我国栽培早、种植广、产量大。提取制备工艺简单成熟，产业化前景广阔。
[0018] (5) 10-姜酚在生姜中含量高，提取制备工艺简单成熟，抗虫活性高，无环境污染和 残留，在新型环保绿色渔药领域有着良好应用前景。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020] 实施例1 10-姜酚对多子小瓜虫成虫和包囊的杀灭作用
[0021] I. 1实验材料：寄主模型鱼为草鱼（Ctenopharyngodon idelIus)，体重 25. 7 ±3. 8g，来源于广州市花都区五星村鱼苗场。多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis)来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。实验所用10-姜酚的纯度彡98%，由暨 南大学水生生物研究所制备提供。具体制备方法如下：
[0022] 自生姜提取的姜油树脂2kg，购自贵州红星发展都匀绿友有限责任公司。将其依 次用石油醚、乙酸乙酯、水萃取，得到石油醚萃取物500g，乙酸乙酯萃取物1200g，水萃取物 300g。经杀虫实验，测定出乙酸乙酯部位活性最佳。乙酸乙酯部位经过一级硅胶柱层析，以 石油醚：乙酸乙酯（1 :〇、1:1、〇:1)和乙酸乙酯：甲醇（1:1、〇:1)为洗脱系统进行梯度洗脱， 每级洗脱液60L。根据一级硅胶柱层析各部位杀虫活性结果，将杀虫活性最佳的石油醚：乙 酸乙酯（1:1)部位590g经过二级硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯（1:0、4:1、1:1)和乙酸 乙酯：甲醇（1:〇、〇:1)为洗脱系统进行梯度洗脱，每级洗脱液50L。根据二级硅胶柱层析各 部位杀虫活性结果，将杀虫活性最佳的石油醚：乙酸乙酯（4:1)部位350g经过三级硅胶柱 层析，以石油醚：乙酸乙酯（1 :〇、1〇:1、4:1)和乙酸乙酯：甲醇（1:1、0:1)为洗脱系统进行 梯度洗脱，每级洗脱液40L。根据三级硅胶柱层析各极性部位杀虫活性结果，将杀虫活性最 佳的石油醚：乙酸乙酯（10:1)部位96g经过制备型高效液相色谱，以甲醇：水（80:20)为流 动相进行洗脱，洗脱液40L，获得纯度多98%的活性化合物10-姜酚。
[0023] I. 2实验方法：
[0024] 1. 2. 1 10-姜酚药液配制：在十万分之一天平上精确称取10-姜酚5mg，用20 μ L 二甲基亚砜促溶，加入3. 105mL蒸馏水，配成1600mg/L的一级储备液。取0. 2mL -级储备 液和4. 8mL超纯水，得到5mL 64mg/L的二级储备液。再利用二倍梯度稀释法，配制成64、 32、16、8、4、2、1和0(对照组）mg/L的药液各2mL。此时，64mg/L药液的二甲基亚砜含量为 0.0256% (v/v)，对照（Omg/L药液）的二甲基亚砜含量亦为0.0256 % (v/v)。
[0025] 1. 2. 2将含有大约100个成虫（滋养体）的200 μ L的水溶液加入24孔板的孔中， 随后各加入200 μ L药液，此时10-姜酚的最终浓度依次为32、16、8、4、2、1、0. 5和Omg/L，每 组设置3个平行。4倍显微镜下记录4h内成虫的死亡时间和第4h的死亡率，计算出半数有 效浓度（EC m)。计算公式如下：
[0026] 死亡率（％) = (1-实验组活成虫个数/对照组成虫总数）X 100%
[0027] 结果表明：8mg/L浓度下的10-姜酚可100%杀死多子小瓜虫成虫，并且随着浓度 增加，全部致死时间缩短。
[0028] 1. 2. 3在24孔板中，向孔中加入200 μ L约含30个成熟多子小瓜虫成虫的虫液， 显微镜下准确计数各孔成虫数，静置6h，待其形成包囊后，计数各孔包囊数，再分别加入 200 μ L不同浓度的试液，使最终试液的浓度依次为32、16、8、4、2、1、0. 5和Omg/L，各实验浓 度设置3个平行。在4倍显微镜下记录自包囊加药后至第4h的死亡数，计算4h死亡率和 4h的EC 5。。计算公式如下：
[0029] 死亡率（％)=各孔中死亡包囊数/各孔总包囊数X 100% ;
[0030] 上述计数完毕后，将24孔板（未死亡的包囊）于23°C恒温培养箱中静置12h，保 持相同温度，在4倍显微镜下观察孵化情况，计数各孔孵化幼虫数。计算公式如下：
[0031] 平均每个包囊孵化的幼虫数=各孔幼虫总数/各孔包囊数；
[0032] 结果表明：10_姜酚的浓度在16mg/L可以100 %杀死包囊，完全抑制包囊孵化，无 感染性幼虫释放