用于施加到皮肤或者添加到纹身墨水中的个人化物质及其制备方法

用于施加到皮肤或者添加到纹身墨水中的个人化物质及其制备方法
【专利摘要】本文描述了用于将材料提供到个体的组合物，所述材料例如是生物材料、沙、土壤、金属、水、海水、圣水、合成或生物聚合物、火葬灰、陶瓷、动物或植物组织、或者具有个人意义的另一生理学相容的组分。所述材料被包封在惰性的、不可生物侵蚀的、疏水性的聚合物材料中。本文还提供了制造包封所述个人化物质的微粒的方法以及使用方法。所述个人化物质可以被包封在不可生物侵蚀的聚合物微粒中。所述被包封的个人化物质可以与载体组合以提供到个体的皮肤。在一些实施方式中，所述个人化物质被添加到纹身墨水中并且被引入到在个体的皮肤上创作的纹身中。在注射到皮肤中之后，所述被包封的材料保留在所述微粒中，并且不随时间释放。
【专利说明】用于施加到皮肤或者添加到纹身墨水中的个人化物质及其制 备方法
[0001 ] 相关申请
[0002] 本申请要求2014年1月10日提交的美国临时专利申请第61/925,827号的优先权， 该美国临时专利申请的内容全文并入本文。
[0003] 提交序列表
[0004] 与本申请相关的序列表通过EFS-Web以电子格式提交并且在此通过引用将其全部 内容并入本说明书。含有该序列表的文本文件的名称为121608_00007_PCT_S equenCe_ Listing。该文本文件大小为1KB，该文本文件创建于2015年1月9日。 发明领域
[0005] 本发明涉及要添加到皮肤的个人化材料，例如用于纹身墨水的添加剂。
[0006] 发明背景
[0007] 人类将纹身施加于皮肤已达数千年。例如，首次记录的用于混合并施加纹身墨水 的配方追溯到五世纪并且认为是罗马医生埃提乌斯所为。纹身墨水源自于天然物质并且包 含在液体载体中的着色颗粒的混悬体。用针或类似的工具将纹身墨水施加到墨水永久保留 处的皮肤而产生纹身。该技术通过由皮肤的弹性与针的移动的组合而引起的交替的压力-抽吸作用，将颜料混悬体经过皮肤引入。用于引入到皮肤中的颜料的水和其他载体经过组 织扩散并被吸收。一旦皮肤愈合，大部分颜料颗粒保留在组织间隙中。在愈合过程中，一些 颜料颗粒从皮肤表面消除。在愈合后，纹身由位于真皮中的剩余颜料颗粒构成，在那里它们 被吞噬性皮肤细胞吞噬或者保留在细胞外基质中。参见Mathiowitz等人的美国公布申请第 2009/0311295号。用于纹身的墨水由于它们的惰性和不溶性颜料颗粒的相对较大尺寸而防 止消除。以这种方式产生的纹身将随时间而部分褪色，但通常将保持可见。可出于各种各样 的原因而使用纹身，主要是出于皮肤纹饰。参见Klitzman和Koger的美国专利第6,013，122 号。
[0008] 虽然将纹身墨水施加到皮肤的方法在进步，如电子纹身墨水枪，但现在商业使用 的纹身墨水仍然与几个世纪以前使用的那些相似。标准的纹身墨水含有包含溶解于载体 (通常是乙醇或水）中的金属盐的颜料，以将颜料分散于真皮中。参见美国专利6,013,122。 因此，存在对于具有改进性质的纹身墨水的新型制剂的需要。

【发明内容】

[0009] 本文描述了用于将材料提供到个体的组合物，所述材料例如是生物材料、沙、土 壤、金属、水、海水、圣水、合成或生物聚合物、火葬灰（cremated ash)、陶瓷、动物或植物组 织、或者具有个人意义的另一生理学相容的组分。这些材料可以被包封并然后施用到个体 的皮肤以创作个人化纹身。
[0010] 材料被包封在不可生物侵蚀的聚合物微粒中，其中微粒包含生物相容的、不可生 物侵蚀的、疏水性聚合物。优选地，形成微粒的聚合物(其共聚物或掺合物)具有高于60°C的 玻璃化转变温度或者大于50°C的熔点。还提供了制造和使用组合物的方法。
[0011] 个人化墨水纹身产生了与人、物体、地点或事件的物理联系，因为个人化纹身将个 人化物质引入到纹身墨水中，并因此引入到皮肤上显示的图像中。本文描述的组合物可被 递送到个人的皮肤以创作个人化墨水纹身。例如，组合物可以是纹身墨水的添加剂。或者， 组合物可被提供到未添加纹身墨水的个体的皮肤，例如，通过将组合物施用到已经存在纹 身的位置。
[0012] 任选地与纹身墨水组合，组合物在适合载体中被提供到个体。例如，在使用时，组 合物可以与纹身墨水混合，并且混合物可以使用标准纹身针和程序而施加。
[0013] 或者，组合物与适合的载体一起施用到个体的皮肤中的一个或多个期望位置。通 常，标记被添加到所述位置，或者所述位置含有标记，以指示包封材料的位置。
[0014] 在提供到个体的皮肤之后，被包封的材料保留在微粒中，并且微粒不发生侵蚀。被 包封的材料不从微粒释放。被包封的材料在微粒中保留与其在个体的身体中一样长的时 间，例如至少5年、至少10年、至少15年、至少20年，或者更长的时间段。
[0015]在优选实施方式中，组合物包含从对个体具有意义的一个或多个人类、非人类动 物、或植物，或其组合获得的DNA ANA可以通过任何标准方法获得，例如非侵入式面颊拭子 (cheek-swab) ANA被包封在不可生物侵蚀的聚合物微粒中，其中微粒包含生物相容的、疏 水性的、不可生物侵蚀的聚合物。
[0016] 在一些方面，本发明涉及一种组合物，其包含包封在不可生物侵蚀的聚合物微粒 中的个人化物质，其中微粒包含生物相容的、疏水性的、不可生物侵蚀的聚合物，和其中微 粒不释放个人化物质。在一些实施方式中，组合物还包含适合于注射到皮肤中的载体。在一 些实施方式中，个人化物质呈纳米颗粒形式。在一些实施方式中，个人化物质选自DNA、沙、 土壤、金属、火葬灰、陶瓷和植物组织。在某些实施方式中，微粒具有1微米至10微米，优选1 至5微米范围的尺寸。在某些实施方式中，个人化物质还包含个人识别特征，其中个人识别 特征含有与个人化物质的来源相关的独特信息。
[0017] 在前述组合物的某些实施方式中，个人化物质是DNA，并且DNA包含选自短串联重 复（STR)、单核苷酸多态性(SNP)、表观遗传标记和甲基化DNA图谱的个人识别特征。在某些 实施方式中，个人化物质是火葬灰。
[0018] 在前述组合物的某些实施方式中，聚合物选自聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯类、聚甲 基丙烯酸酯类、及其共聚物和掺合物。在某些实施方式中，聚合物具有大于或等于60°c的玻 璃化转变温度或者具有大于或等于50°C的熔点。在某些实施方式中，个人化物质是DNA，并 且其中微粒含有高达0.01 % (重量/重量)DNA。在某些实施方式中，个人化物质不是DNA，并 且其中微粒含有高达10% (重量/重量)的个人化物质。
[0019] 在前述组合物的某些实施方式中，组合物还包含纹身墨水，其中墨水包含至少一 种颜料或染料。
[0020] 在某些方面，本发明涉及一种制备权利要求1至13中任一项的组合物的方法，其包 括(a)从源生物或源材料分离个人化物质；和(b)将个人化物质包封到微粒中。在某些实施 方式中，方法还包括(c)分析从源生物或源材料分离的个人化物质；（d)分析组合物中的个 人化物质；和(e)比较步骤(d)中获得的数据与步骤(c)中获得的数据以确认从源生物或源 材料分离的个人化物质与组合物中的个人化物质相同。在某些实施方式中，方法还包括在 步骤(b)之前使个人化物质微粉化。在某些实施方式中，方法还包括在步骤(b)之前使个人 化物质形成纳米颗粒。
[0021] 在前述方法的某些实施方式中，个人化物质在步骤(b)之前呈液体形式。在某些实 施方式中，个人化物质是DNA。在某些实施方式中，方法还包括在步骤(b)之前扩增DNA。在某 些实施方式中，DNA包含一个或多个短串联重复(STR)。在某些实施方式中，DNA是人类DNA。
[0022] 在前述方法的某些实施方式中，步骤(b)包括通过选自溶剂蒸发微包封、经溶剂蒸 发的微球双壁形成、热恪融包封(hot melt encapsulation)、相分离包封、自发乳液、溶剂 去除微包封和凝聚的工艺形成微粒。在某些实施方式中，形成单个批量(batch)的包含干燥 微粒的组合物，其中干燥微粒的批量的质量在约lg至3g范围内，优选约2g。
[0023] 在某些方面，本发明涉及一种将个人化物质提供到个体的皮肤的方法，其包括将 前述组合物中的任一种注射到个体的皮肤中。在某些实施方式中，注射在现有的纹身的位 置处进行。在某些实施方式中，注射步骤在皮肤上的不同位置处重复多次以形成纹身设计。
【附图说明】
[0024]图1是显示用于给顾客提供包含具有个人意义的DNA的纹身的示例性端到端方法 的步骤的流程图。由顾客实施且然后由实验室实施的步骤产生了单独的(干粉)或呈液体形 式的(例如，具有载体溶液)被包封的DNA，其作为添加剂添加到纹身墨水中。
[0025] 图2是显示用于给客户提供包含具有个人意义的一种或多种化合物的纹身的示例 性端到端方法的步骤的流程图。由顾客实施且然后由实验室实施的步骤产生了单独的（干 粉)或呈液体形式的（例如，具有载体溶液)具有个人意义的化合物，其作为添加剂添加到纹 身墨水中。
【具体实施方式】
[0026] I.定义
[0027] 本文所用术语"个人化物质"是指对个体具有意义的材料。个人化物质可以是天然 或合成材料，在这种情况下至少一部分材料能够被包封到聚合物微粒中。术语个人化物质 在本文中用于同时指包封之前和之后的材料。
[0028] 术语"添加剂"和"添加性组合物"在本文中可交换使用，指的是具有或不具有载体 的、在纹身之前或在纹身过程中添加到现有的纹身或者添加到纹身墨水中的组合物。
[0029] 本文所用术语"不可生物侵蚀的"和"不可侵蚀的"表示在皮肤中的生理学条件下 是惰性或者非反应性的。本文描述的不可生物侵蚀的聚合物以及由此而来的聚合物微粒在 施加到个体的皮肤之后(例如通过注射到皮肤而施加），能够在生物组织(特别是皮肤)的生 理环境下耐受物理溶解和/或化学降解过程，通常持续至少5年、至少10年、至少15年、至少 20年、或甚至更长时间。
[0030]本文所用术语"疏水性聚合物"是指对水具有低亲和性(在生理温度下，例如37°C) 且在水中具有比聚乳酸(PLA)更低的溶解度的聚合物。
[0031] 本文所用术语"高分子量"表示高于1〇,〇〇〇道尔顿(Da)，优选高于20,000Da的分子 量。
[0032] 本文所用术语"载体(carrier)"或"添加性载体"表示用于溶解或储存被包封形式 的个人化物质的组合物。载体通常适合于注射到人类皮肤中。
[0033] 本文所用术语"被包封的材料"表示个人化物质的分子组分。例如，如果个人化物 质是沙，那么被包封的材料包括二氧化硅(Si0 2)、硅酸钙(Ca2Si〇4)、氮化钙(CaN2)和/或氮 化硅(Si 3N4)等。
[0034] 本文所用术语"生物材料"表示任何生物物质，包括，但不限于，生物小分子，如核 苷酸类、氨基酸类、辅因子类或激素类，生物大分子，如核酸类、多肽类、蛋白质类(例如酶 类、受体类、分泌蛋白类、结构和信号蛋白类、激素类、配体类等）、多糖类，和/或其任意组 合。
[0035]本文所用术语"生理学相容性组分"表示与受者（通常是人类）的生理学相容的组 合物中的任意组分。
[0036] 本文所用术语"受者"是指被包封的个人化物质的受者。受者可以是能够接受被包 封的个人化物质的任何受试者、人类、动物或植物。
[0037] 本文所用"纳米颗粒"是指在纳米(nm)范围内的颗粒或结构，通常直径为约1至约 1000nm〇
[0038] 本文所用"微粒"是具有相对较小尺寸、但并不必然在微米尺寸范围内的颗粒;对 于尺寸可以是例如1至约1〇〇〇微米的颗粒，使用该术语。术语"微粒"包括微球、微囊和微粒， 除非另有说明。微粒可以具有复合结构并且不必然是纯的物质；它可以是球形或者其他任 何形状。
[0039] 本文所用术语"负载百分率"是指个人化物质的重量与微粒的重量的比率乘以 100〇
[0040] 本文所用术语"小批量"是指适合于被不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超 过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个、或不超过十个个 体使用的被包封的个人化物质的批量大小，任选地在施用于个体之后剩余少量以用于验证 目的。在一些实施方式中，被包封的个人化物质的批量大小为小于约10，〇〇〇、5000、4000、 3000、2000、1000、500、100、10、1、0.1或0.0111^。这些值中的任一个可以用于限定被包封的 个人化物质的批量大小的范围。例如，被包封的个人化物质的批量大小可以在约10，〇〇〇mg 至约0 · Olmg、约10，000mg至约lOOOmg、或约5000mg至约500mg范围内。
[0041] II.组合物
[0042] 本文描述了用于将个人化物质安置到个体的皮肤中以保留在安置位置处的组合 物。个人化物质被包封到微粒中，在本文中也称为"被包封的材料"。组合物可以用于使纹身 个人化和/或使对个体具有特别意义的物质整合到他/她的皮肤中。
[0043] 在提供到个体的皮肤之后，被包封的材料保留在微粒中，并且微粒不发生侵蚀。被 包封的材料不从微粒释放。可以使用简单的体外试验以确认在提供到个体的皮肤之后，微 粒将不释放被包封的材料。例如，在形成含有被包封的个人化物质的微粒之后，微粒可以浸 没到PH7.4和水浴(bath)中37°C温度下的水性溶液或缓冲剂中至少约1个月。定期除去样 品，例如在1小时后、在1天后、在1周后和在1个月后，并且使用适合的检测方法进行分析以 确认在水性溶液、缓冲剂或上清液中是否存在被包封的材料的任何痕迹。
[0044]适合的检测方法是本领域已知的。例如，用于检测是否释放了任何DNA的适合方法 包括检测释放到水性溶液、缓冲剂或上清液中的被标记DNA的荧光，和/或水性溶液、缓冲剂 或上清液的PCR扩增。用于检测样品中的低水平DNA的PCR方法是本领域已知的。参见，例如， Sambrook等人，Molecular Cloning.(第4版），冷泉港，纽约:冷泉港实验室。具有实时扩增 监视的常规PCR和实时PCR可以用于检测任何DNA释放。PCR扩增可以使用与在包封之前用于 扩增DNA的引物和扩增条件相同的引物和扩增条件。PCR扩增可以使用多达50个扩增循环， 并且如果有任何DNA存在于水性溶液、缓冲剂或上清液中的话，产生可检测的数量的扩增的 DNA分子(称为"扩增产物"）。在PCR之后，如果存在的话，扩增产物可以通过用于检测双链 DNA的常规凝胶电泳技术或者紫外-可见光光谱法检测。参见，例如，Sambrook等人， Molecular Cloning.(第4版），冷泉港，纽约:冷泉港实验室。采用上述方法，存在扩增产物 表明DNA从微粒释放，而不存在扩增产物则表明DNA未从微粒释放。
[0045] 对于非DNA个人化物质，适合的检测方法包括IR，质谱法，例如同位素比率质谱法 (IRMS)或液相色谱质谱法(LC-MS)。
[0046] 本文所用术语"不释放个人化物质的微粒"是指如通过上文描述的体外试验所检 测的、在水性溶液或缓冲剂中不释放实质量(substantial amount)个人化物质的微粒。在 一些实施方式中，如通过上文描述的体外试验所测定的，微粒在1小时、1天、1周、2周、3周、1 个月、6个月、1年、5年、10年、20年或30年后不释放可检测量的个人化物质。在一些实施方式 中，微粒释放微粒中含有的个人化物质的总量的小于10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、 0.01 %、0.005%或0.001 %。在一些实施方式中，微粒在1小时、1天、1周、2周、3周、1个月、6 个月、1年、5年、10年、20年或30年后释放微粒中含有的个人化物质的总量的小于10%、5%、 1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%或0.001%。在一个特定的实施方式中，微粒在2 周后释放微粒中含有的个人化物质(例如DNA)的总量的小于0.1%。
[0047]对于具有作为被包封的个人化物质的DNA的组合物，在如上文描述的体外试验之 后的检测方法包括通过PCR进行扩增，接着通过常规凝胶电泳技术或紫外-可见光光谱法进 行检测。对于具有作为被包封的个人化物质的非DNA材料的组合物，质谱可以用作如上文描 述的体外试验之后的检测方法。
[0048] 1.个人化物质
[0049] 通常，本文描述的组合物包含个人化物质。适合的个人化物质包括但不限于生物 材料，例如，动物或植物组织、沙、土壤、金属、海水、圣水、合成或天然聚合物、火葬灰、陶瓷 和其他生理学相容的组分。在液体个人化物质如海水和圣水的情况下，冻干包含个人化物 质的微粒将除去微粒中含有的任何液体。然而，液体中含有的任何盐或其他非挥发性化合 物将保留。
[0050] 在一些实施方式中，组合物可以含有被包封的DNA而没有任何另外的个人化物质。 在其他实施方式中，组合物含有包含DNA的个人化物质以及包含其他化合物的一种或多种 另外的个人化物质。例如，另外的个人化物质可以是来自沙、土壤、金属、陶瓷和/或植物产 品的一种或多种样品。
[0051 ] A.示例性个人化物质
[0052]适合的个人化物质包括，但不限于，沙、土壤或岩石颗粒、或者从沙、土壤或岩石提 取的化合物。
[0053]沙主要由二氧化硅（Si02)和其他有机与无机矿物（如硅酸钙（Ca2Si〇4)、氮化钙 (Ca3N2)、氮化娃（Si3N4)、氮化错(A1N3)、氧化错(AI2O3)、氮化硼(borazone) "氮化硼"（BN)、 氧化镁(MgO)、氧硫化硅(SiOS)、硅酸锂(Li2Si04)，以及其他金属氧化物/金属氮化物)组成， 如表1所示。
[0054]不含DNA的个人化物质（如沙、土壤、金属、水、海水、圣水、合成或天然聚合物、火葬 灰、陶瓷和源自植物的化合物）的种类（identify)可以通过适合的方法(如质谱法，例如同 位素比率质谱法(IRMS)或液相色谱质谱法(LC-MS))来确认。
[0055]表1.示例性个人化物质 [0056]
[0058]例如，个人化物质可以含有从土壤或岩石样品提取的二氧化硅颗粒。适合的提取 技术是已知的。在提取之后，颗粒可以通过常规手段研磨以将它们的尺寸减小至小于1微 米，任选地，然后筛分微粒以获得具有用于包封的尺寸范围的颗粒群体，或者微粉化微粒以 产生具有适合尺寸的纳米颗粒，通常直径为约1至约l〇〇〇nm。任选地，颗粒可在包封之后与 粉末化或者预分散的纹身墨水混合。
[0059] 在一些实施方式中，个人化物质包含对接受物质的人具有意义的金属或陶瓷物体 的颗粒。例如，这样的金属或陶瓷物体可以被研磨、筛分和提取以除去不想要的组分、包封 并且与纹身墨水混合以包含到纹身中。
[0060] 在一些实施方式中，个人化物质包含对个体具有个人意义的木制物品的提取物。 例如，在一些实施方式中，纤维素被从木制物品提取并包封以提供给个体。
[0061] 个人化物质可以作为固体或者以液体形式，例如以乳液形式，添加到微粒形成材 料。在包封之后，个人化物质在微粒中呈小颗粒(通常为纳米颗粒)形式。通常，个人化物质 在微粒的核中并且由疏水性的、不可侵蚀的聚合物基质（即，壳)包围。被包封的个人化物质 具有小于所得微粒的尺寸，并且通常在直径上（或者对于非球形颗粒来说，在其最大维度 上)小于1微米。
[0062] B.个人化物质中的DNA分子的类型
[0063] 个人化物质旨在在提供到皮肤之后保持为惰性且非反应性并且保持为被包封。 [0064]因此，在一些实施方式中，个人化物质不包含载体。本文所用术语"载体(vector)" 是指在生物技术中用于储存、增殖、递送或整合重组DNA的DNA分子。载体的实例包括质粒骨 架、病毒载体、杆状病毒穿梭载体、粘粒(cosmid)和人工染色体。
[0065]通常，载体自身是由插入物(转基因或重组DNA)与充当载体"骨架"的较大序列组 成的DNA序列。载体的目的在于将插入物转运到另一个细胞，在那里它可以分离、扩增或表 达。在一些实施方式中，个人化物质不包含用于将DNA序列转运到细胞中的DNA。在一些实施 方式中，个人化物质不包含出于扩增或表达其中含有的基因信息的目的而使用的DNA。 [0066] C.任选的组分 [0067] 1.个人识别特征
[0068]任选地，组合物包含一个或多个个人识别特征。一个或多个个人识别特征含有独 特信息，其可以用于验证个人化物质是从特定来源(例如人类、非人类动物、或植物)所获得 的。验证步骤可以在包封之前或之后进行，任选地，验证可以在个人化物质置于个体皮肤中 之后发生。
[0069] DNA的示例性个人识别特征包括，但不限于，微卫星标记，如短串联重复(STR)和简 单序列重复(SSR)标记，单核苷酸多态性(SNP)，和表观遗传标记，如甲基化DNA图谱。任何对 于源生物而言独特的DNA序列都可以用作个人识别特征。例如，对于源生物而言独特的DNA 序列可以使用本领域已知的测序方法(如Sanger测序或下一代测序，例如111 umina测序)通 过对从源生物分离的DNA的整个序列或其一部分进行测序而识别。DNA测序方法是本领域公 知的并且描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning.(第4版），冷泉港，纽约:冷泉港 实验室。
[0070] a.多态性基因标记
[0071] DNA通常包含一个或多个多态性基因标记。多态性基因标记是基因组的高度可变 区，其已经为多种应用的开发作出了贡献，如用于准确识别个体的法医学DNA分析和亲子测 试。
[0072]在过去三十年来，已经出现了许多多态性基因标记的识别。例如，称为可变数量串 联重复(VNTR)的多态性基因标记是含有串联重复的、14至80碱基长度的、几乎相同序列的 DNA的丰富且高多态性的区域。参见Jeffreys等人，1985，Nature 314:67-73;Wyman等人， 1980，PNAS 77:6754-6758;和Nakamura等人，1987，Science 235:1616-1622。这些标记在个 体之间的不同使它们可用于识别特定个体。VNTR可以使用聚合酶链式反应(PCR)而从少量 DNA检测。参见Kasai等人，1990，Journal of Forensic Sciences 35(5):1196_1200。扩增 的PCR产物中的大小差异在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上检测出。然而，VNTR的有限数量限制 了该方法的广泛适用性，这进而导致了短串联重复(STR)的识别。
[0073] b.短串联重复（STR)
[0074] STR可以通过聚合酶链式反应扩增，并且是高度丰富且多态性的（个体与个体不 同）ATR可以含有相差两个(二核苷酸）、三个(三核苷酸）、四个（四核苷酸)或五个(五核苷 酸)碱基对的串联重复序列。据估计，人类基因组中大约有50,000至100,000个二核苷酸重 复。三核苷酸与四核苷酸重复较不常见;据估计，人类基因组含有10,000个每种类型的重 复。参见Tautz等人，1989，Nuc.Acids Res· 17:6464-6471;和Hamada等人，1982，PNAS 79: 6465-6469。相比于更短的序列，使用四核苷酸与五核苷酸STR允许更好地区分个体受试者 之间的差异。参见Weber等人，1989,Am J Hum Genet 44:388-396。
[0075] 个人化物质可以含有选自二核苷酸STR、三核苷酸STR、四核苷酸STR和五核苷酸 STR的人类DNA序列。
[0076] 由于来自人类四核苷酸重复区的PCR产物的大小通常在个体之间不同，四核苷酸 重复是用作个人化物质的优选个人识别分子。例如，两种不同大小的PCR产物基于每个个体 从每个母体遗传的一个拷贝的多态性标记而被观察到。每个遗传的拷贝含有可变数量的四 核苷酸重复。因此，两个不相关的个体将可能从相同的四核苷酸多态性标记产生不同大小 的PCR产物。随着更大数量的不同四核苷酸重复区在个体之间相比较，某些个体共同具有相 同的PCR产物图谱的可能性降低。
[0077] c.单核苷酸多态性(SNP)
[0078]单核苷酸多态性是在群体内普遍发生的DNA序列变异（1%)，其中基因组(或其他 共有序列）中的单核苷酸(A、T、C或G)在生物物种或成对染色体的成员之间不同。例如，来自 不同个体的两个测序的DNA片段，AAGC^TA与AAGqTA，含有单核苷酸差异。
[0079] SNP可以在基因的编码序列基因的非编码序列内或者基因间区（基因之间的区 域）中。由于遗传密码的简并性，编码序列内的SNP不必然改变所产生的蛋白质的氨基酸序 列。
[0080] 编码区域中的SNP有两种类型：同义和非同义SNP。同义SNP不影响蛋白质序列，而 非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP有两种类型:错义和无义。
[0081] 不在蛋白质编码区中的SNP仍可以影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或 者非编码RNA的序列。受此类型的SNP影响的基因表达称为eSNP(表达SNP)并且可以在该基 因的上游或下游。
[0082] 对表型没有可观测影响的SNP(所谓的沉默突变）因为它们的数量以及代际之间的 稳定遗传而仍可用作全基因组关联研究中的遗传标记。
[0083] 2.纳米颗粒
[0084] 任选地，个人化物质在被包封到聚合物微粒中之前被形成为纳米颗粒或者被包封 到纳米颗粒中。
[0085] 前述个人化物质中的任一种可以被微粉化以产生具有适合尺寸的纳米颗粒。
[0086] 在一些实施方式中，纳米颗粒包含来自人类或来自伴生动物的DNA，或者由来自人 类或来自伴生动物的DNA组成。DNA可以由磷酸钙沉淀。在其他实施方式中，纳米颗粒包含非 DNA个人化物质、由非DNA个人化物质组成、或者源自非DNA个人化物质，所述非DNA个人化物 质例如沙、土壤、金属、水、海水、圣水、合成或生物聚合物、火葬灰或陶瓷。在某些实施方式 中，在微包封的准备中，纳米颗粒通过使个人化物质微粉化以减小其尺寸而形成。
[0087] 纳米颗粒的直径可以是，例如，约 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、 90、80、70、60、50、40、30或20纳米(腦）。在某些实施方式中，纳米颗粒的直径小于约1000、 900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40或30纳米(腦）。这些值中的 任一个可以用于限定纳米颗粒直径的范围。例如，纳米颗粒直径可以是约20nm至约lOOOnm 或者约20nm至约100nm。
[0088] 2.聚合物微粒
[0089] 个人化物质被包封在聚合物微粒中。微粒的核含有个人化物质，其由形成微粒的 外壳的聚合物基质包围。
[0090] 任选地，个人化物质形成为纳米颗粒，其被包封在聚合物微粒中。在一些实施方式 中，个人化物质是通过磷酸钙沉淀制备的DNA纳米颗粒。磷酸钙沉淀的DNA纳米颗粒可以被 包封在聚合物微粒中而不将DNA溶解于溶剂中。
[0091] 在一些实施方式中，微粒同时包含个人化物质和颜料或染料。聚合物微粒中的颜 料或染料颗粒通常小于lOOnm并且优选小于20nm。在一些实施方式中，包含个人化物质的微 粒不包含颜料或染料。
[0092] A.聚合物
[0093] 疏水性的、生物相容的且不可生物侵蚀的任何聚合物都可以用于形成微粒。优选 地，形成微粒的聚合物的组成和分子量使得聚合物的玻璃化转变温度大于或等于60°C或者 聚合物的熔点大于或等于50°C。在某些实施方式中，聚合物的玻璃化转变温度大于或等于 约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75或80°(：。在某些实施方式中，聚合物的熔点大于 或等于约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65或70 °C。具有高玻璃化转变温度（即玻璃 化转变温度大于或等于60°C)或者高熔点（即熔点大于或等于50°C)的优选聚合物包括但不 限于聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚碳酸酯。在一个特 别的实施方式中，聚合物选自聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、及其共聚 物和掺合物。在另一个特别的实施方式中，聚合物选自聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、 及其共聚物和掺合物。优选地，如果微粒形成自聚合物的共聚物或掺合物，则共聚物或掺合 物形成自具有高玻璃化转变温度或高熔点的聚合物，并且不含具有低玻璃化转变温度（即 低于60 °C的玻璃化转变温度)或者低于50 °C的熔点的任何聚合物。
[0094]具有大于或等于60°C的玻璃化转变温度的适合的聚合物或者具有大于或等于50 °c的熔点的适合的聚合物包括，但不限于，聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚碳酸酯类、 聚丙烯类、聚烯烃类、聚亚烷基二醇类、聚环氧烷类、聚对苯二甲酸二醇酯类、聚乙烯基醚 类、聚乙烯基卤化物类、聚硅氧烷类、聚氨酯类，及其共聚物，羟烷基纤维素类、纤维素醚类、 硝基纤维素类、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、三乙 酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁 酯）、聚（甲基丙烯酸异丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（甲基丙烯酸异癸酯）、聚（甲基丙烯 酸月桂酯）、聚（甲基丙烯酸苯酯）、聚（丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸异丙酯）、聚（丙烯酸异丁 酯）、聚（丙烯酸十八酯）、聚乙烯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯）、聚（乙酸乙烯酯）、和聚乙烯基 氯化物、聚苯乙烯，及其混合物、共聚物和掺合物。
[0095] 优选的聚合物包括聚丙烯酸酯类和聚甲基丙烯酸酯类。
[0096] 在某些实施方式中，聚甲基丙烯酸酯是聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)。医用级PMMA (Mff=35kDa;残留MMA单体〈0.1%)可商购自Vista Optics Ltd.(Widnes，UK)〇
[0097] B.形状和尺寸
[0098] 微粒可以具有任何形状。通常，微粒是球形。其他适合的形状包括，但不限于，薄片 形(flakes)、三角形、椭圆形、杆状、多边形、针形、管形、立方体形和长方体形结构。
[0099] 在某些实施方式中，微粒具有小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0·9、0·8、0·7、0·6、 0.5、0.4、0.3、0.2或0.1微米的直径。这些值中的任一个可以用于限定微粒的直径的范围。 例如，微粒的直径可以是约0.1至约10微米、约0.1至约1微米、或者约0.1至约2微米。通常， 微粒的直径小于5微米。优选地，对于用作纹身墨水中的添加剂的组合物，微粒的直径在约1 至约10微米，更优选约1至2微米。直径为10微米和更小的微粒可以借助纹身枪或任何类似 装置引入到皮肤中。
[0100]在其他实施方式中，可以使用更大的微粒或颗粒。例如，微粒可以具有10微米至 1 〇〇〇微米的直径。在这些实施方式中，微粒可以通过皮内注射提供到皮肤。
[0101] C.微粒中的被包封的个人化物质的负载
[0102] 通常，包封在微粒中的个人化物质的浓度表示为百分比负载。由于百分比负载的 值取决于个人化物质的重量，不同的个人化物质的百分比负载值可以明显不同。因此，可预 期不同的个人化物质的百分比负载的不同范围。
[0103] 在一些实施方式中，微粒中个人化物质的低浓度(例如，最多0.1 %重量/重量或更 低)是防止个人化物质从微粒沥滤(1 each ing)所要求的。
[0104] 在一些实施方式中，如在包封材料是DNA时，只有小样品提供给包封。在这些实施 方式中，微粒通常含有低浓度的DNA。然而，如果提供大量的包封材料，则微粒中包封材料的 负载可以更高，只要所得微粒不允许DNA释放。
[0105] 在一些实施方式中，微粒包含约0.00001、0.00005、0.0001、0·0005、0·001、0·005、 0·01、0·02、0·03、0·04、0·05、0·06、0·07、0·08、0·09、0·1、0·5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10% 包封材料重量/微粒重量（重量/重量）。在一些实施方式中，微粒包含小于约0.00001、 0·00005、0·0001、0·0005、0·001、0·005、0·01、0·02、0·03、0·04、0·05、0·06、0·07、0·08、 0.09、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%包封材料重量/微粒重量(重量/重量）。这些值中 的任一个可以用于限定微粒中包封材料的浓度的范围。例如，微粒可以含有约0.00001至约 10%重量/重量或约0.001至约2%重量/重量的量的包封材料。在一些实施方式中，微粒中 的包封材料的量小于约0.1%重量/重量。
[0106] 1.DNA的百分比负载
[0107] 通常，微粒中DNA的百分比负载在0.000001 %至0.1 %DNA重量/微粒总重量（％重 量/重量）范围内。在优选实施方式中，微粒中DNA的量小于0.01 % (重量/重量)DNA，更优选 地，微粒中DNA的量在0.001 %至0.00001 % (重量/重量）范围内。这些负载范围通常可应用 于单壁微粒。
[0108] 然而，对于微粒是双壁微粒的实施方式，可以使用更高的DNA负载。预期双壁微粒 的结构保护DNA免于沥滤出微粒。在这些实施方式中，微粒中DNA的量可以在0.000001 %至 约5%DNA重量/微粒总重量（％重量/重量)范围内，任选地为约1 %-5% (重量/重量）。
[0109] 2.其他个人化物质的百分比负载
[0110]通常，微粒中除DNA以外的个人化物质的百分比负载高于DNA的负载。例如，微粒中 个人化物质的量可以在约0.001至约10%重量/重量或者约0.001至约2%重量/重量的范围 内。任选地，微粒中个人化物质的量小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、 0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%重量/重量。这些值中的任一个 可以用于限定微粒中物质的浓度的范围。例如，微粒中个人化物质的量可以在约0.001至约 10%重量/重量或者约0.001至约2%重量/重量的范围内。在一个特别的实施方式中，微粒 包含小于约0.1 %重量/重量％的除DNA以外的个人化物质。
[0111] 3.载体
[0112] 在某些实施方式中，本文描述的组合物被配制用于注射到人类皮肤中。例如，组合 物可以包含用于通过注射提供给人类的适合的生物相容性载体。适合的载体包括任意的 醇，包括但不限于乙醇、异丙醇，或者水。适合的载体还包括醇与水的任意组合。通常，载体 中醇的量在约5%至约30% (重量/重量）范围内，并且载体中水的量在约40%至约70% (重 量/重量)范围内。
[0113] 在优选实施方式中，载体是60%水、30%甘油(甘油）和10%乙醇的溶液。还可以预 期其他载体溶液，包括55%水、30 %甘油和15 %乙醇；50%水、30 %甘油和20 %乙醇；45 % 水、30%甘油和25%乙醇；或者40%水、30%甘油和30%乙醇。
[0114] 4.含有DNA的示例性组合物
[0115] 在某些实施方式中，要提供给个体的个人化物质含有来自人类、非人类动物（例 如，宠物)或植物的DNA。
[0116] 在一个特别的实施方式中，DNA来自人类。没有两个人在他们的细胞中具有完全相 同的DNA序列。个体人类的DNA差异产生可以用于区分个体的独特DNA谱。此外，各个个体的 独特DNA谱提供了用于验证个人化物质是来自于特定个体的手段。因此，将DNA包含到载体 中或纹身墨水中给纹身墨水或载体提供了可以验证(例如通过DNA测序或遗传标记分析)的 独特特征。
[0117] DNA可以是编码或非编码基因组DNA、编码或非编码线粒体DNA或者互补DNA (cDNA)。cDNA使用逆转录酶从RNA合成而来。基因组DNA、线粒体DNA和用于cDNA合成的RNA可 以分离自任何生物，包括但不限于人类、动物和植物。在一些实施方式中，DNA分离自单个生 物，例如，一个人。在其他实施方式中，DNA分离自两个或更多个生物，例如，两个或更多个 人。分离基因组DNA、线粒体DNA和RNA的方法以及cDNA合成方法是本领域公知的并且描述 于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning.(第4版），冷泉港，纽约:冷泉港实验室。
[0118] D.DNA分离和扩增
[0119] 在一些实施方式中，个人化物质中含有的DNA直接分离自生物，如基因组DNA或线 粒体DNA。在其他实施方式中，个人化物质中含有的DNA扩增自从生物收集的样品，例如，通 过聚合酶链式反应(PCR)。用于四核苷酸PCR扩增的多个DNA区段通常可以在单个管中扩增。 这样的多个DNA区的多重扩增在本领域中称为多重PCR。如本领域所知，多个PCR产物例如通 过电泳分离，并且仪器读取电泳凝胶或图像以自动分析PCR产物大小。在一些实施方式中， 个人化物质中含有的DNA是从分离自上文所述生物的RNA反转录的cDNA。
[0120] 可以测序DNA使得可以进行下文描述的验证步骤。（Sambrook等人，Molecular Cloning ·(第4版），冷泉港，纽约:冷泉港实验室）。
[0121]可以按照如下方法制备用作个人化物质的DNA样品，虽然本领域技术人员已知制 备类似的DNA样品的其他方法。一个优选方法包括以下通用步骤：
[0122] 用于制备个人化物质中含有的DNA的样品是从面颊拭子、皮肤、毛发、唾液或血液 样品或者如本领域已知的来自生物的其他组织的样品收集而来。面颊拭子样品是优选的。 用于收集和处理样品的方案是本领域已知的。
[0123] 例如，适合用于从颊部细胞分离基因组DNA的DNA分离套件(kit)可以用于从面颊 拭子分离DNA。这些套件是可商购的，并且通常产生0.5-2微克的总DNA。然后通过PCR扩增含 有被分离的DNA的多态性基因标记(如STR和SNP)的期望基因组区以产生微克级(通常为1至 10微克）的要用作个人化物质的DNA。扩增的DNA可被测序，因而可以进行下文描述的验证步 骤。这种扩增的DNA是被包封到微粒中的个人化物质。
[0124] 任选地，个人化DNA分子的包封可以包括具有已知序列的对照DNA分子，其以与个 人化DNA分子相同的量而被包括。对照DNA可以用于测试以确认是否释放了任一被包封的 DNA，如通过上文描述的体外方法。
[0125] 替代性地或任选地，个人化DNA可以部分或全部用荧光团标记，如Alexa Fluor? 染料(Molecular Probes，Inc.)。被标记的DNA可以用于确认DNA被成功包封，例如使用被包 封颗粒的流式细胞术。替代性地或另外地，被标记的DNA可以用于确认是否任一被包封的 DNA会在提供到个体的皮肤之后释放。这项测试可以通过测量水性溶液、缓冲剂或上清液的 荧光而进行，其中空的微粒或者包封被标记DNA的微粒在例如上文描述的体外方法中被检 测DNA释放。
[0126] 透射电镜(TEM)可以用于验证扩增的DNA的包封。
[0127] 在一些实施方式中，基因组DNA、线粒体DNA和/或RNA使用本领域已知的方法而从 样品分离，例如在Sambrook等人(在上文中引用）中描述的那些方法。可以测定提取的DNA或 RNA的浓度和完整性，例如，以告知用PCR或反转录继续进行检测或者获取另一样品的决定。
[0128] 在一些实施方式中，个人化物质中含有的DNA可以通过PCR产生。如本领域已知的， 例如，包含STR的DNA可以通过使用引物的PCR进行扩增，所述引物扩增基因组DNA样品的三 个至五个四核苷酸重复区段，任选地包含可检测的标记，如放射性或荧光标记。用于扩增 DNA的PCR引物可以从商业来源获得或者可以使用本领域已知的方法合成。用于PCR引物设 计的软件是本领域公知的。
[0129] 可以通过PCR扩增的优选STR的实例在下表2中陈述。本领域技术人员将认识到还 可以扩增另外的合适四核苷酸与五核苷酸重复。合适四核苷酸DNA重复的优选性质之一是 在受试者群体中的高度杂合性(个体之间的变异性）。合适四核苷酸DNA重复的另一个优选 性质是它们不编码生物活性产物，例如，蛋白质、tRNA、rRNA、miRNA或siRNA。合适四核苷酸 DNA重复的又一个优选性质是它们在受者中不诱导免疫应答并且不产生治疗作用。
[0130]表2.用于扩增的DNA中的优选重复
[0131]
[0132] 为了成功产生四核苷酸重复，并且为了确认样品显示了来自个体的DNA样品的相 对独特的表现，通常通过例如电泳分析所得PCR产物。
[0133] E.扩增的DNA的验证
[0134] 在一些实施方式中，分析DNA以确认个人化物质中含有的DNA来自或产生自期望的 源生物。例如，对于包含STR的DNA，个人化物质中含有的DNA的PCR产物图谱可以与从源生物 获得的对照样品相比较。个人化物质中含有的DNA还可以通过DNA测序进行分析，例如，cDNA 测序或全基因组测序，以确认个人化物质中含有的DNA是来自期望的源生物。
[0135] DNA的测序可以使用本领域已知的方法进行。这些方法包括，但不限于，基础测序 方法，如Sanger法、Maxam-Gilbert测序和链终止法（Franca等人，Quarterly Review of Biophysics，35 (2) : 169-200，2002)，先进方法和从头测序，如鸟枪法测序和桥式PCR (Braslavky等人，Proc .Natl .Acad· Sci，100(7): 3960-3964,2003)，或下一代方法。下一代 测序应用于基因组测序、基因组重测序、转录组分析（RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用 (Chip-测序）、和表观基因组表征（duMagalhSes等人，Ageing Res Rev.9(3)315-323， 2010;Liu等人，Journal of Biomedicine and Biotechnology，2012:1-11，文章 ID251364， 2012;和Hall，The Journal of Experimental 8丨〇1(^7,209:1518-1525,2007)。重测序是 必要的，因为物种的单个个体的基因组不会指示同一物种的其他个体中的基因组变异。
[0136] 下一代测序包括大量方法，包括，但不限于，单分子实时测序、大规模平行签名测 序（MPSS)、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、离子激流半导体测序、DNA纳米球测序、 heliscope单分子测序、连接法测序(SOLiD测序)和单分子实时测序(SMRT)。这些方法在Liu 等人，Journal of Biomedicine and Biotechnology，2012:1-11，文章 ID 251364,2012和 Hall，The Journal of Experimental Biology，209:1518_1525,2007中详细描述并进行比 较。
[0137] 在一些实施方式中，个人化物质中含有的DNA在个人化物质在与载体组合或组合 到纹身墨水中之前进行分析。在其他实施方式中，个人化物质中含有的DNA在与个人化物质 与载体或纹身墨水组合之后进行分析。
[0138] DNA可以纯化以获得适合地不含污染物的药品级/生物制品级DNA。
[0139] II.制造组合物的方法
[0140] 微粒可以使用多种已知微包封方法制造，如溶剂蒸发、多壁(或双壁)微包封、凝聚 和熔融加工。
[0141] 上文描述的不可生物侵蚀的、疏水性聚合物中的任一种可以用于形成聚合物微 粒。
[0142] 1.溶剂
[0143] 可以用于形成微粒的溶剂包括有机溶剂如二氯甲烷，其会留下通常认为安全的低 水平残留物。适合的水不溶性溶剂包括二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙酸乙酯和环己烷。另外 的溶剂包括，但不限于，醇类，如甲醇（甲醇）、乙醇（乙醇）、1_丙醇（正丙醇）、2_丙醇（异丙 醇）、1_ 丁醇（正丁醇）、2_ 丁醇（仲丁醇）、2_甲基-1-丙醇（异丁醇）、2_甲基-2-丙醇（叔丁 醇）、1_戊醇(正戊醇）、3_甲基-1-丁醇(异戊醇）、2,2_二甲基-1-丙醇(新戊醇）、环戊醇(环 戊醇）、1_己醇(正己醇）、环己醇(环己醇）、1_庚醇(正庚醇）、1_辛醇(正辛醇）、1_壬醇(正壬 醇）、1-癸醇(正癸醇）、2_丙烯-1-醇(烯丙醇）、苯甲醇(苄醇）、二苯甲醇(二苯甲醇）、三苯甲 醇（三苯甲醇）、甘油、苯酚、2-甲氧乙醇、2-乙氧乙醇、3-乙氧-1，2-丙二醇、二（乙二醇）甲 醚、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、1，3-戊二 醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇、2，4-戊二醇、2，5-戊二醇、3，4-戊二醇、3，5-戊二 醇、及其组合。优选的醇是异丙醇。
[0144] 可以用于配制凝聚体体系的材料包含阴离子型、阳离子型、两性型和非离子型表 面活性剂。阴离子型表面活性剂包括二-(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠;非离子型表面活性剂 包括脂肪酸类及其酯类;两性型组中的表面活性剂包括(1)分类为简单蛋白质、偶合蛋白质 和衍生蛋白质的物质，如白蛋白类、明胶类和糖蛋白类，和(2)磷脂类别中含有的物质，如卵 磷脂。阳离子型组中的胺盐和季铵盐也包括有用的表面活性剂。可用于形成凝聚体的其他 表面活性剂化合物包括多糖类及其衍生物、粘多糖类和聚山梨醇酯类及其衍生物。可用作 表面活性剂的合成聚合物包括组合物，如聚乙二醇和聚丙二醇。可以用于制备凝聚体体系 的适合的化合物的另外的实例包括糖蛋白类、糖脂类、半乳糖、明胶类、改良液体明胶类和 半乳糖醛酸。
[0145] 3.表面活性剂
[0146] 疏水性表面活性剂如脂肪酸类和胆固醇可以在微粒的制备过程中添加以改善疏 水性个人化物质在疏水性聚合物微粒中的所得分布。适合的脂肪酸的实例包括丁酸、戊酸、 己酸、庚酸、辛酸、壬酸、辛酸、i 酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、 硬脂酸、十九酸、花生酸、异巴豆酸、十一碳烯酸、油酸、反油酸(elaidic acid)、山梨酸、亚 油酸、亚麻酸和花生四烯酸。
[0147] 疏水性表面活性剂如0土?20和聚乙烯醇(PVA)改善亲水性染料在聚合物中的 分布。如果染料是亲水性的且聚合物是疏水性的，则两亲型表面活性剂是优选的。
[0148] 表面活性剂如脂肪酸或其药学上可接受的盐通常以0.2至1重量份脂肪酸或其盐/ 1重量份染料的比率添加。
[0149] 4.微粉化和纳米颗粒形成
[0150] 使个人化物质微粉化以产生纳米颗粒的方法，如果需要的话，包括例如声处理和/ 或产生剪切力，以及在例如5，000RPM至25，000RPM的速度下的转子定子混合或用同心轴碾 磨。
[0151] 在DNA是个人化物质的一些实施方式中，DNA可以通过使用标准技术沉淀而制备， 如乙醇或异丙醇沉淀，或者盐沉淀。在一些实施方式中，DNA通过用磷酸钙沉淀而微粉化，并 且沉淀物不是被溶解到而是作为纳米颗粒被直接包含到微粒中。在一些实施方式中，DNA作 为水中的乳液而被包封，水随后在包封过程之后被除去以产生DNA的小固体颗粒。DNA也可 以结合到固体纳米颗粒如二氧化硅或金，或者交联在一起以形成聚集体。
[0152] 将DNA包封到纳米颗粒中的方法在本领域中描述。参见，例如，US2009/0311295和 van de Berg等人，2010，Journal of Controlled Release 141:234-240。
[0153] 5.纳米颗粒在微粒内的分布
[0154] 优选地，含有个人化物质的纳米颗粒均匀分布在聚合物微粒内，并且处于低负载 水平以避免被包封的个人化物质的任何沥滤。在包封材料是DNA或含有DNA时，这是特别期 望的。
[0155] 大多数微粒生产方法的问题在于在纳米颗粒在添加到聚合物溶液之后开始分散 时，纳米颗粒朝着底部快速沉降。然后在除去溶剂时，纳米颗粒在聚合物中一部分中比另一 部分中更优先存在。难以在除去聚合物溶剂以形成微粒的同时使纳米颗粒保持分散。因此， 已经开发了方法，其中纳米颗粒分散于聚合物溶液中使得溶液是"稳定化的"，从而纳米颗 粒在聚合物内保持均匀分布并持续一段时间以形成微粒。这个时间可以短至十分钟或者长 至数小时。纳米颗粒将在聚合物中保持混悬的时间的量取决于纳米颗粒的大小和组成。
[0156] 稳定性是聚合物、溶剂组成以及分散方法和被包封材料密度的选择的函数。例如， 必须调整有机聚合物溶液的浓度以使纳米颗粒保持分散并且防止纳米颗粒在包封过程中 沉降。在理论上（如果不是机械地)与打蛋清类似的方法中，聚合物溶液被声处理或以其他 方式经受剪切力，使用5000-25，000RPM的开放式叶片混合器或转子定子，或者被使用同心 轴碾磨，直到稳定。替代性地或另外地，溶剂和表面活性剂(如果存在的话)可以用于改变纳 米颗粒的表面性质使得它们在聚合物溶液中保持悬浮。然后除去溶剂以形成在聚合物内具 有均匀纳米颗粒分布的微粒。
[0157] 6.制造微粒的方法
[0158] 存在多种制造微粒的方法，包括，例如，多壁微包封、热熔融包封、相分离包封、自 发乳液、溶剂蒸发微包封、溶剂去除微包封和凝聚。这些方法是本领域已知的。方法的详细 描述在Mathiowitz等人，〃Microencapsulation"，Encyclopedia of Controlled Drug Delivery，第2卷，第495-546页，John Wiley&Sons，Inc ·，New York，N. Y.中论述，并在下文 中简要展示。优选的方法是溶剂蒸发微包封(特别高的油/水相比率以获得小颗粒，并添加 表面活性剂如油酸以改善个人化片段在聚合物相中的分散）。对于溶剂蒸发，最小浓度为 0.1%重量/体积(聚乙烯醇/水）。另一个优选方法包括将纳米颗粒添加到通过熔融而液化 的聚合物中以确保均匀分布。
[0159] 纳米颗粒在聚合物基质内的分散可以通过改变以下条件而提高：（1)用于使聚合 物溶剂化的溶剂或溶剂组合；（2)聚合物与溶剂的比率；（3)要包封的纳米颗粒的尺寸；和 (4)纳米颗粒相对于聚合物的百分比（即，纳米颗粒负载）。纳米颗粒在聚合物基质内的分散 也可以通过使用表面活性剂而提高。
[0160] 在某些实施方式中，在制备微粒的过程中分析个人化物质，例如，在微粉化后和/ 或在包封后，以确认个人化物质的种类。通常，微粒以小批量制备。
[0161] A.热熔融微包封
[0162] 在热熔融微包封中，要包封的个人化物质(任选地呈纳米颗粒形式)添加到熔融的 聚合物中。该混合物作为熔融小滴悬浮在对聚合物而言的非溶剂(通常为油基）中，所述非 溶剂已经被加热到聚合物熔点的大约l〇°C以上。通过剧烈搅拌维持乳液，同时使非溶剂浴 快速冷却到聚合物的玻璃化转变温度之下，导致熔融小滴固化并夹带核材料。
[0163] B.相分离微包封
[0164] 在相分离微包封中，要包封的个人化物质(任选地呈纳米颗粒形式)通过搅拌分散 在聚合物溶液中。在连续搅拌以使材料均匀混悬时，对聚合物而言的非溶剂缓慢添加到溶 液中以降低聚合物的溶解度。取决于聚合物在溶剂和非溶剂中的溶解度，聚合物沉淀或者 相分离成为富聚合物相和贫聚合物相。在适当的条件下，富聚合物相中的聚合物将移动至 与连续相的界面，在具有外聚合物壳的小滴中包封个人化物质(任选的呈纳米颗粒形式）。
[0165] C.自发乳化
[0166] 自发乳化包括通过改变温度、蒸发溶剂或添加化学交联剂而使乳化的液体聚合物 小滴固化。包封剂以及要包封的个人化物质的物理和化学性质决定适合的包封方法。例如 疏水性、分子量、化学稳定性和热稳定性等因素影响包封。
[0167] D.熔融-溶剂蒸发法
[0168] 在熔融溶剂蒸发法中，聚合物加热到足够的流动性以使操作容易（例如，用刮刀搅 拌)的点。这样做所要求的温度取决于聚合物的固有性质。例如，对于晶体聚合物，该温度将 高于聚合物的熔点。在达到期望温度后，个人化物质（任选地呈纳米颗粒的形式)添加到熔 融的聚合物并物理地混合，同时维持温度。使熔融的聚合物与个人化物质混合直到混合物 达到对该特定体系而言最大的均一性水平。使混合物冷却至室温并硬化。该项技术导致个 人化物质在聚合物中分散。
[0169] 可以使用高剪切涡轮以搅拌该分散体，通过将纳米颗粒逐渐添加到聚合物溶液中 而进行补充，直到获得期望负载。或者，可以调节聚合物溶液密度以防止纳米颗粒在搅拌过 程中沉降。
[0170] E.溶剂蒸发微包封
[0171] 在溶剂蒸发微包封中，聚合物通常溶解于水不混溶性有机溶剂中，并且要包封的 个人化物质(通常呈纳米颗粒形式)添加到聚合物溶液中，作为有机溶剂中的分散体、混悬 体或乳液。通过将该分散体、混悬体或乳液添加到烧杯中并剧烈搅拌体系而形成乳液（即， 第二乳液，如果包封材料作为乳液加入的话）。任何适合的表面活性剂可以用于稳定乳液。 典型的表面活性剂包括但不限于聚乙二醇或聚乙烯醇(PVA)。蒸发有机溶剂，同时连续搅 拌。蒸发导致聚合物沉淀，形成含有核包封材料的固体微囊，其中被包封材料呈乳状液或固 体形式。
[0172] 溶剂蒸发法可以用于使液体核材料包埋于聚合物或共聚物微囊中，而液体在聚合 物已经包封了物质之后通过常规方法除去。
[0173] 溶剂蒸发法是用于包封DNA的优选方法。
[0174] F.溶剂去除微包封
[0175] 在溶剂去除微包封中，聚合物通常溶解于油混溶性有机溶剂中，并且要包封的个 人化物质(通常呈纳米颗粒形式)添加到聚合物溶液中，作为有机溶剂中的混悬体或溶液。 可以添加表面活性剂以改善要包封的材料的分散。通过将该混悬体或溶液添加到剧烈搅拌 的油中而形成乳液，其中油对聚合物而言是非溶剂并且聚合物/溶剂溶液在油是中不混溶 的。有机溶剂通过扩散到油相中同时连续搅拌而除去。溶剂去除导致聚合物沉淀，形成含有 核材料的固体微囊。
[0176] G.凝聚
[0177] 使用凝聚技术的用于不同物质的包封程序已经在本领域中描述于，例如，68_8_ 929 406，GB-B-929 401，美国专利第3,266,987、4,794,000和4,460,563号中。凝聚是涉及 使胶体溶液分成两个或更多个不混溶的液体层的方法（Ref . Dowben，R . General Physiology，Harper&Row,New York, 1969,第142-143页）。通过凝聚法，可以产生称为凝聚 体的包含两个或更多个相的组合物。包含两相凝聚体体系的成分同时存在于两个相中；然 而，富胶体相具有比贫胶体相更高的组分浓度。
[0178] 在凝聚法中，聚合物或共聚物在稍微（immediately)低于将产生相分离的浓度 (即，浊点）的非溶剂浓度下，溶解于溶剂与非溶剂的混溶性混合物中。液体核材料添加到溶 液中，同时搅动以形成乳液并使材料分散为小滴。蒸发溶剂与非溶剂，其中溶剂以较快速率 蒸发，导致聚合物或共聚物相分离并朝向核材料小滴的表面移动。该相分离溶液然后转移 到搅动的一定体积的非溶剂中，导致任何剩余的溶解的聚合物或共聚物沉淀，并从形成的 膜萃取任何残留溶剂。结果是由聚合物或共聚物壳与液体材料核构成的微囊。
[0179] 例如，DNA可以溶解于水中，然后溶解的DNA的乳液形成为有机聚合物溶液。该乳液 然后添加到水性溶液并混合(任选地，对于长度小于2千碱基(kb)的DNA，可以使用高剪切） 直到有机溶剂蒸发，然后洗涤整个混合物并冷冻和冻干，产生在聚合物内部的DNA干燥颗 粒。
[0180] 材料可以使用乳化剂包封，如吐温80?、油酸、卵磷脂、Brij?92、Span?80、 Arlacel?83和Span?85屬者，材料可以不使用乳化剂而包封。
[0181] H.多壁微包封
[0182] 多壁聚合物微球可以通过使两种聚合物溶解于溶剂中而制备。使要包含的个人化 物质分散在聚合物溶液中，并且使混合物混悬于连续相中。然后缓慢蒸发溶剂，产生具有由 一种聚合物形成的内核和第二种聚合物形成的外层的微球。连续相可以是有机油、挥发性 有机溶剂、或含有第三聚合物的水性溶液，所述第三聚合物不溶于聚合物最初的混合物并 且将导致最初的两种聚合物随着混合物搅拌而相分离。
[0183] 可以使用任何两种或更多种不同的不可生物降解的疏水性聚合物，其在由可使用 的相图所决定的特定浓度下不溶于彼此。多层微囊具有尺寸一致的聚合物层并且可以包含 一系列物质。
[0184] 为了制备双壁微球，每种聚合物在分隔的容器中溶解于对该聚合物而言适合的溶 剂中，并且与表面活性剂如油酸混合;个人化物质（任选地呈纳米颗粒形式)添加到聚合物 溶液之一。然后混合两种(或更多种)聚合物溶液，并且然后将混合物添加到含有表面活性 剂如PVA的大体积水相中以形成乳液(水与一些表面活性剂的水性溶液）。施加高剪切。油与 水相的比率通常为1:20,以确保在1-5微米范围内的小微粒大小，或者甚至更小的微粒，如 在1至2微米范围内。
[0185] 含有由第一聚合物构成的聚合物核以及第二聚合物的均匀涂层(coating)、以及 包含在至少一种聚合物中的物质的微球可以如在美国专利第4,861，627号中描述的那样制 造。
[0186] I.溶剂蒸发对于纳米颗粒微包封而言是有利的
[0187] 溶剂蒸发微包封可以导致纳米颗粒在聚合物溶液中稳定化并持续足以包封纳米 颗粒的一段时间。在某些实施方式中，纳米颗粒在聚合物溶液中稳定约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 分钟。在某些 实施方式中，纳米颗粒在聚合物溶液中稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟。在某些实施方式中，纳米颗 粒在聚合物溶液中稳定少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟。这些值中的任一个可以用于限定纳米颗粒在聚合 物溶液中稳定的时间的量的范围。例如，纳米颗粒可以在聚合物溶液中稳定约10分钟至约 30分钟。
[0188] 使个人化物质在分散相(通常是挥发性有机溶剂）内稳定可以对大部分依赖分散 相的微包封方法有帮助，包括铸膜、溶剂蒸发、溶剂去除、喷雾干燥、相转化和许多其他方 法。
[0189] 通过使混悬的纳米颗粒在分散相内稳定，纳米颗粒在整个聚合物溶液以及在微包 封过程中形成的所得聚合物基质中保持均匀分散。
[0190]溶剂蒸发微包封具有几个优势。例如，溶剂蒸发微包封允许确定最佳的聚合物-溶 剂-纳米颗粒混合物，其将帮助形成可以用于包封纳米颗粒的均质混悬体。溶剂蒸发微包封 使纳米颗粒在聚合物溶液中稳定。这种纳米颗粒的稳定化在小规模操作过程中是优势，因 为人们将能够让不溶性颗粒的混悬体静置短的时间段，使方法更安全并且避免在客户之间 混淆。溶剂蒸发微包封允许产生不释放被包封材料的微粒。溶剂蒸发微包封避免了"突释效 应(burst effect)"问题，即被包封的材料在施用1小时内释放，其在允许非常低负载的纳 米颗粒或个人化物质并且产生具有最少孔的微粒的其他包封方法中出现。
[0191] 7.小批量制备
[0192] 在一些实施方式中，组合物以小批量制造。批量大小可以受限于个人化物质的性 质和量、或者终端用户数量。
[0193] 在优选实施方式中，个人化物质被包封在聚合物微粒中以供一个或数个个体个人 使用。因此，制备小批量的包封个人化物质的聚合物微粒是优选的。在一些实施方式中，制 备的批量的大小可以小至供单个个体单次使用。在其他实施方式中，制备的批量的大小可 以小至供数个个体单次使用，如不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过 六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个、或不超过十个个体。在其他实施方式中，批量 大小可以小至供同一个体多次使用。
[0194] 在其他实施方式中，小批量制备的大小可以由可用的个人化物质的量所决定。例 如，如果DNA用作个人化物质，则通过面颊拭子从一个个体获得的DNA的量可以正好小到足 够生产供单个受者单次使用的批量。在优选实施方式中，单次小批量产生供一个终端用户 单次使用的足够量的包封个人化物质的微粒。
[0195] 在优选实施方式中，小批量制备方法产生约l-10g干燥形式的包封个人化物质的 微粒，优选约1 -2g干燥形式的包封个人化物质的微粒。例如，在一些实施方式中，制备了 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0或10克微粒。例如，在一些实施方式中，制备了少于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、1·5、2·0、2·5、3·0、3·5、4·0、4·5、5·0、6·0、7·0、8·0、9·0或 10克微 粒。这些值中的任一个可以用于限定以此制备的微粒的量的范围。例如，可以制备0.5至5克 或者2至5克微粒。在一个特别的实施方式中，制备了约2克微粒。
[0196] IV.使用方法
[0197] 本文描述的组合物可以独立使用，与载体组合使用，或者用作物质的添加剂，如纹 身墨水的添加剂，以提供到皮肤，通常通过注射。
[0198] 1.用作组合物
[0199] 在一些实施方式中，本文描述的组合物适合用作具有个人意义的组合物。组合物 的使用可以由终端用户选择。例如，组合物可以由终端用户使用以使具有个人意义的物质 保存长的时间段。终端用户可以储存组合物，或者选择将组合物作为礼物送给另一个个体。 或者，终端用户可以选择使用组合物作为其他物质的添加剂。
[0200] 在一些实施方式中，组合物通过注射施用到个体的期望皮肤位置。通常，所述位置 含有标志，或者标志被添加到所述位置，以指示被包封的个人化物质在该位置的存在。
[0201] 2.用作添加剂
[0202] 在一些实施方式中，个人化物质可以用作纹身墨水的添加剂。添加剂可以用于创 作一类具有与人或地点或事件的物理联系的纹身。
[0203] 获得个人化墨水纹身产生了与人、物体、地点或事件的物理联系，因为个人化纹身 将个人化物质引入到纹身墨水中，并因此引入到皮肤上显示的图像中。
[0204] 可商购的纹身墨水颜料通常是呈粉末形式的组合物，常常包含用于着色的重金属 盐。纹身墨水颜料溶解于载体中，优选醇或水，以注射到皮肤中并使颜料分布到真皮内。醇 还可以给予抗微生物效果。含有与载体预混合颜料的预分散墨水也是可商购的。
[0205] 在某些实施方式中，被微包封的个人化物质配制成适合于由纹身师将其与载体混 合的干粉形式。在一些实施方式中，被微包封的个人化物质可以与载体混合并作为预分散 的溶液供应。与个人化物质组合使用的纹身墨水可以具有本领域已知的任何期望颜色。
[0206] 在一些实施方式中，包含个人化物质的纹身墨水可以通过将含有个人化物质的微 粒与混悬在液体(如水、甘油或金缕梅(witch hazel))中的纹身墨水混合而制备。微粒与纹 身墨水可以通过振摇、搅拌、涡旋或轻度声处理微粒与纹身墨水而混合。在一些实施方式 中，微粒在微粒与纹身墨水的混合物中的浓度为0.001 %、0.005 %、0.01 %、0.05 %、0.1 %、 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%重量/重量。
[0207] -旦含有个人化物质的微粒与纹身墨水混悬，纹身墨水可以通过将少量(例如，少 于10克）的微粒-装饰性纹身墨水浆料倒到杯或其他容器中而施用，所述杯或其他容器具有 足够的大小以供人将包括纹身针或针组的纹身工具蘸到杯或容器中。纹身可以通过将纹身 针蘸到含有微粒-纹身墨水混合物的杯或容器中，然后用针刺穿皮肤以将微粒-纹身墨水混 合物注射到皮肤中而创作。
[0208] 个人化物质在施加到皮肤时必须在受者中是非免疫原性的。在一些实施方式中， 个人化物质在它被包含到纹身墨水中之前被包封在纳米颗粒和/或微粒中，以防止在受者 中的免疫应答。
[0209] V.套件
[0210] 提供了用于从终端用户获得个人化物质的套件以及用于将被包封的个人化物质 提供给终端用户的套件。图2显示了描述获得个人化物质，然后分离、制备并将被包封的个 人化物质提供给终端用户的端到端方法的流程图。图1显示了DNA用作示例性个人化物质的 相似流程图。
[0211] 在图1说明的方法中，给顾客提供面颊拭子套件。顾客使用面颊拭子以从顾客感兴 趣的人类或非人类动物获得样品。然后顾客将样品邮寄或以其他方式交付给实验室。实验 室分离、扩增(如果需要的话)和纯化(如果需要的话)DNA，然后将DNA包封在微粒中。然后被 包封的DNA冻干成粉末。任选地，粉末添加到适合于注射(未显示）的载体。然后粉末或溶液 交付给顾客。顾客然后将溶液或粉末交付给纹身店，其将它注射到顾客的期望位置或者将 它添加到纹身墨水并在顾客身上创作纹身。
[0212] 在图2说明的方法中，给顾客提供收集套件。顾客将来自顾客感兴趣的来源的样品 放置到收集器皿(例如，小瓶）中。然后顾客将样品邮寄或以其他方式交付给实验室。实验室 从个人化物质提取、任选地纯化和/或灭菌一种或多种化合物，然后将个人化物质包封到微 粒中。然后被包封的个人化物质冻干成粉末。任选地，粉末添加到适合于注射(未显示)的载 体。然后粉末或溶液交付给顾客。顾客然后将溶液或粉末交付给纹身店，其将它注射到顾客 的期望位置或者将它添加到纹身墨水并在顾客身上创作纹身。
[0213] 在一些实施方式中，套件提供用于获得个人化物质样品的工具。工具可以根据待 提供个人化物质的性质而制作。例如，如果个人化物质是DNA，则套件可以包括尖端为泡沫 或棉的面颊拭子、用于该拭子的防护容器以及使用说明。如果个人化物质是沙，则套件可以 包括防水容器和使用说明。
[0214] 在其他实施方式中，套件提供供终端用户使用的最终产品。在这些实施方式中，套 件可以包括个人化物质、载体和使用说明。套件可以根据终端用户偏好而定制。例如，套件 含有粉末形式的个人化物质以及载体。在其他实施方式中，套件可以含有与载体预混合的 个人化物质。
[0215] 套件可以提供给终端用户。或者，套件可以提供给纹身店，在那里套件组分可以由 终端用户在纹身店使用。
[0216] 实施例
[0217] 材料
[0218]医用级PMMA(MW = 35kDa;残留MMA单体〈0· 1% )购自 Vista Optics Ltd. (Widnes， UK)，PVA(Mw = 25kDa; 88% 水解）购自 Poly sc iences，Inc · (Warrington，Pa.，USA)。二氯甲烧 (DCM;Burdick and Jackson,Muskegon,Mich.，USA)、乙酸乙酯（EA;Mallinckrodt， Hazelwood，Mo ·，USA)和 1-辛醇（Sigma-Aldrich，St .Louis，Mo ·，USA)是分析级溶剂。颗粒通 过溶剂蒸发微包封而制备。
[0219]实施例1.制备空白聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)微粒
[0220] 材料与方法
[0221] 在20ml玻璃闪烁瓶中称重500mg PMMA(约25,000MW);15ml二氯甲烷(DCM)添加到 PMMA、涡旋30秒并声处理5分钟，直到溶液变得澄清（1)。在这时，聚合物完全溶解，没有颗粒 状物质。
[0222] 250ml表面活性剂（1.0%聚（乙烯醇）（PVA)(MW~25,000Da;88%水解））倒入到1L Virtis?烧瓶⑵中。
[0223] 100ml 0.5%PVA(MW^25,000Da;88%水解)倒入到800ml烧杯(3)中。烧杯放置在 速度设定为3，000RPM的叶轮下(离烧杯底部约0.5cm)。
[0224] Virtis?旋风分离器(cyclone)设定为"55"（13,7501^1〇;然后100微升1-辛醇添 加到1.0 % PVA溶液(2)中并使其静置5分钟(4)。PMMA溶液（1)添加到在1LVktis?烧瓶中。 该混合物在旋风分离器上在13，750rpm下混合15分钟。
[0225] 内容物从Virtis?烧瓶倒入到含有〇. 5%PVA的800ml烧杯(3)中，并且搅拌约24小 时以形成颗粒浆料。
[0226] 颗粒浆料倒入到50mlEppend〇rf?管中，拧上盖子并在4,000RPM(3345Xg)下离 心20分钟。PVA溶液使用50ml移液管尖头抽走;保留该溶液以作进一步评估。40ml蒸馏水添 加到管中；充分混合并振摇直到颗粒在蒸馏水中再混悬。拧回盖子并在4,500RPM下再离心 20分钟。蒸馏水用50ml移液管尖头抽走。40ml蒸馏水添加到管中；充分混合并振摇直到颗粒 在蒸馏水中再混悬。拧回盖子并在4,000RPM(3345Xg)下再离心20分钟。蒸馏水用50ml移液 管尖头抽走。颗粒浆料合并到一个或两个管中，急速冷冻并冻干48-72小时。
[0227] 变化：用不同质量的PMMA(约1M MW)重复上文记载的步骤。仅有的区别出现在PMMA 溶液的形成中。
[0228] 在实施例1的变化中，在50ml Falcon管中称重500mg PMMA;30ml二氯甲烷(DCM)添 加到PMMA、涡旋(30秒)并声处理(5分钟)直到溶液变得澄清。
[0229] 题
[0230] 在该方法中使用的约80 %的PMMA形成了空白PMMA微粒。
[0231] 在实施例1的变化中获得了基本上相同的收率。
[0232] 实施例2.制备含有低负载的DNA的聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)微粒和包含PMMA微 粒的纹身墨水
[0233] 材料与方法
[0234] 在40ml玻璃闪烁管（1)中称重lOOOmg PMMA(25,000MW)。制备在线粒体基因座处扩 增的DNA。通过在10%CheleX树脂的存在下煮沸10分钟，从收获的人类颊部粘膜细胞提取 DNA。使用对人类线粒体基因组的非编码区（碱基15,971-16411)具有特异性的以下引物， PCR扩增提取的DNA的一部分：
[0235] 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3'（SEQ ID N0:1)
[0236] 5，-GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3，（SEQ ID N0:2)
[0237] 使用Invitrogen PureLink凝胶提取&PCR纯化联合试剂盒纯化PCR产物。纯化的 DNA的一部分用AlexaFluor 488标记、乙醇沉淀以除去过量的标记、在水中再混悬、并与剩 余DNA混合以产生含有5.6纳克DNA/微升的适合于包封的溶液。DNA溶解于水中，并且溶液浓 度为5微克/ml(2)。取约100微升DNA溶液以制备微粒，相当于0.56微克。
[0238] 30ml二氯甲烷(DMC)添加至IjPMMA小瓶（1)中。10微升Span⑩80(山梨糖醇酐单油 酸酯)添加到PMMA溶液中并且浴中声处理15分钟（3)』ΝΑ(2)用移液管吸取到PMMA溶液(3) 中，并在10,000rpm下混合1分钟以形成乳状液(4)。
[0239] 250ml表面活性剂（1 · 0 %PVA(MW~25，000Da; 88%水解））倒入到lLVirtis_? 烧瓶 中。Virtis?旋风分离器设定为10000RPMJ50微升1-辛醇添加到1%PVA中、混合1分钟、然 后使其沉降5分钟(5)。
[0240] PMMA-DNA乳状液(4)添加到1.0%PVA溶液(5)中，并在7，OOOrpm下混合15分钟(6)。
[0241] 200ml 0.5 %PVA(Mff ^ 25，000Da; 88 %水解)倒入到800ml烧杯中。烧杯放置在叶轮 下(离烧杯底部约〇.5〇1〇，并且叶轮速度设定为3,0001?^。
[0242] 来自Virtis?烧瓶(6)的内容物倒入到含有0.5%PVA的800ml烧杯中，并且搅拌约 24小时以形成颗粒浆料。
[0243] 颗粒浆料倒入到50mlEppeH(torf?管中，拧上盖子并在4,000RPM(3345 Xg)下离 心20分钟。PVA溶液用50ml移液管尖头抽走。保留该溶液以作进一步评估。40ml蒸馏水添加 到管中；充分混合并振摇直到颗粒在蒸馏水中再混悬。需要时，使用声处理以打碎卡在管底 的任何颗粒团聚体。拧回盖子并在4,500RPM下再离心20分钟。蒸馏水用50ml移液管尖头抽 走。40ml蒸馏水添加到管中；充分混合并振摇直到颗粒在蒸馏水中再混悬。拧回盖子并在4， 000RPM(3345Xg)下再离心20分钟。蒸馏水用50ml移液管尖头抽走。颗粒浆料合并到一个或 两个管中，急速冷冻并冻干48-72小时。
[0244] 结果
[0245] 在该方法中使用的约60 %的PMMA形成了具有低量DNA的PMMA微粒。
[0246] 用扫描电镜(SEM)观察微粒形态。大体上，微粒形状为球形，并且具有光滑表面形 态。没有可见的孔，甚至在高倍数(4,000x)下。微球大体上具有1-2微米的颗粒直径。显微图 像中没有观察到聚合物或DNA的片段。在荧光显微镜下的观察这些微粒揭示了它们中的一 部分含有用AlexaFluor 488标记的DNA。
[0247] 含有个人化物质的纹身墨水通过使lg上文描述的含有DNA的PMMA微粒与19g装饰 性黑色纹身墨水混合，并手动振摇混合物而制备。装饰性黑色纹身墨水包含约70% (重量/ 重量)的液体混合物(水、甘油和金缕梅)和约30% (重量/重量)的D&C黑色2号炭黑颜料。
【主权项】
1. 一种组合物，其包含包封在不可生物侵蚀的聚合物微粒中的个人化物质，其中所述 微粒包含生物相容的、疏水性的、不可生物侵蚀的聚合物，和其中所述微粒不释放所述个人 化物质。2. 根据权利要求1所述的组合物，其还包含适合于注射到皮肤中的载体。3. 根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述个人化物质呈纳米颗粒形式。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述个人化物质选自DNA、沙、土壤、 金属、火葬灰、陶瓷和植物组织。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述微粒具有1微米至10微米，优选 1至5微米的尺寸。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述个人化物质还包含个人识别特 征，其中所述个人识别特征含有与所述个人化物质的来源相关的独特信息。7. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述个人化物质是DNA，并且所述DNA包含选自短 串联重复(STR)、单核苷酸多态性(SNP)、表观遗传标记和甲基化DNA图谱的个人识别特征。8. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述个人化物质是火葬灰。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述聚合物选自聚乙酸乙烯酯、聚 丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、及其共聚物和掺合物。10. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述聚合物具有大于或等于60°C 的玻璃化转变温度或者具有大于或等于50 °C的熔点。11. 根据权利要求1至7或9至10中任一项所述的组合物，其中所述个人化物质是DNA，并 且其中所述微粒含有最多〇. 01 % (重量/重量)DNA。12. 根据权利要求1至6或8至10中任一项所述的组合物，其中所述个人化物质不是DNA， 并且其中所述微粒含有最多10 % (重量/重量)的所述个人化物质。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其还包含纹身墨水，其中所述墨水包 含至少一种颜料或染料。14. 一种制备根据权利要求1至13中任一项所述的组合物的方法，其包括： (a) 从源生物或源材料分离所述个人化物质;和 (b) 将所述个人化物质包封到所述微粒中。15. 根据权利要求14所述的方法，其还包括： (c) 分析从所述源生物或源材料分离的所述个人化物质； (d) 分析所述组合物中的所述个人化物质;和 (e) 比较步骤(d)中获得的数据与步骤(c)中获得的数据以确认从所述源生物或源材料 分离的所述个人化物质与所述组合物中的所述个人化物质相同。16. 根据权利要求14所述的方法，其还包括在步骤(b)之前微粉化所述个人化物质。17. 根据权利要求14所述的方法，其还包括在步骤(b)之前使所述个人化物质形成纳米 颗粒。18. 根据权利要求14所述的方法，其中所述个人化物质在步骤(b)之前呈液体形式。19. 根据权利要求14所述的方法，其中所述个人化物质是DNA。20. 根据权利要求19所述的方法，其还包括在步骤(b)之前扩增所述DNA。21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述DNA包含一个或多个短串联重复(STR)。22. 根据权利要求19所述的方法，其中所述DNA是人类DNA。23. 根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)包括通过选自溶剂蒸发微包封、经溶剂 蒸发的微球双壁形成、热熔融包封、相分离包封、自发乳液、溶剂去除微包封和凝聚的工艺 形成所述微粒。24. 根据权利要求14-23中任一项所述的方法，其中形成单个批量的包含干燥微粒的所 述组合物，其中干燥微粒的所述批量的质量为约lg至3g，优选约2g。25. -种将个人化物质提供到个体的皮肤的方法，其包括将根据权利要求1至13中任一 项所述的组合物注射到所述个体的皮肤中。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述注射在现有的纹身的位置处进行。27. 根据权利要求25所述的方法，其中注射步骤在皮肤上的不同位置处重复多次以形 成纹身设计。
【文档编号】A61K8/81GK106061558SQ201580008405
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】P·J·小达菲, E·D·乔根森, E·T·A·伯格, E·马蒂奥维茨
【申请人】室内作品有限责任公司