一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法与流程

本发明涉及木质材料性质研究技术领域，尤其涉及一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法。

背景技术：

在木材解剖的研究中，不同细胞或组织水平上，高质量的显微切片是必要的基础工作。现阶段的显微切片制作中，无论是用于观察的石蜡切片、滑走切片，还是半薄切片，染色都是关键步骤。几十年来，对于木材显微切片染色方法的研究已有较多报道。随着染色剂的多样化，多个染色剂对显微切片进行复染的染色方法也越来越受关注。

番红-固绿双染法是植物制片中最普通的二重染色法，染色手续简单并能清晰的显示出细胞的结构。中国早在1960年江西师范学院的生物制片手册就已记录了番红-固绿双重染色法；1979年容寿柏尝试在其基础上尝试两色一步整染改进；而后很对学者对番红-固绿双染进行了减少耗时和提高染色效果的改进。至今番红-固绿经典双染法已广泛运用于各类研究中。番红-固绿双染法多用于细胞化学成分区别较大的细胞切片，如制作树皮显微切片使用番红-固绿双染法镜检出石细胞呈红色，制作应拉木鹅掌楸显微切片时使用番红-固绿双染法镜检出呈绿色的区域中胶质木纤维含量高。而细胞化学成分差异较小的细胞切片，番红-固绿经典双染法会出现不适用的情况。

薄壁细胞是一类胞壁薄、未木质化的组成植物基本组织的生活细胞类型.具有许多重要功能，如光合作用、贮藏、分泌等。薄壁细胞存在于多数植物体内，成熟后继续存活,只有很薄的初生壁，没有次生壁，一般为直径近乎相等的多面体，但也可以分化为星芒、分枝以及臂状等。薄壁细胞的功能很多，如贮存食物、进行光合作用和需氧呼吸等。厚壁细胞是植物体中的机械组织，由死细胞组成，起加固植物体的作用。细胞壁均匀增厚，主要是木质素的沉积，也称为木质化。

由于薄壁细胞和厚壁细胞均由天然高分子聚集而成，常规的双染色法很难实现对两者进行区分染色和观察，加之染色的清晰度和分辨率不高，现有技术缺乏一种简单有效区分木材中薄壁细胞和厚壁细胞的染色方式。

技术实现要素：

本发明为了克服现有染色方法对木材中薄壁细胞和厚壁细胞区分不够清晰、分辨率不高的缺陷，提供了一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法，包括以下步骤：

(1)以质量百分比浓度1％的番红染色液对木材切片染色45～75min，得到番红染色切片；

(2)依次以质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液对番红染色切片进行梯度洗脱，得到脱染色切片；

(3)以酸洗液清洗脱染色切片，得到酸洗切片；

所述酸洗液为含有质量百分比浓度13～15％冰醋酸的乙醇溶液；

(4)以质量百分比浓度1％的阿利新蓝染色液对酸洗切片染色1～3min，质量百分比浓度65～80％的乙醇水溶液洗脱，封片。

优选的，所述步骤(1)中，番红染色液的溶剂为水。

优选的，所述步骤(2)中，质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液的洗脱时间独立的为1～3min。

优选的，所述步骤(3)中，所述酸洗液的溶剂为质量百分比浓度65～75％的乙醇水溶液。

优选的，所述步骤(3)中，清洗的时间为0.5～2min。

优选的，所述步骤(4)中，阿利新蓝染色液的溶剂为质量百分比浓度65～75％的乙醇水溶液。

优选的，所述步骤(4)中，以甘油进行封片。

优选的，将步骤(4)所述封片后得到染色切片，镜检，其中红色为厚壁组织染，亮蓝色是薄壁细胞染。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法，以质量百分比浓度1％的番红染色液对木材切片染色45～75min，得到番红染色切片；依次以质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液对番红染色切片进行梯度洗脱，得到脱染色切片；以酸洗液清洗脱染色切片，得到酸洗切片；所述酸洗液为含有质量百分比浓度13～15％冰醋酸的乙醇溶液；以质量百分比浓度1％的阿利新蓝染色液对酸洗切片染色1～3min，质量百分比浓度65～80％的乙醇水溶液洗脱，封片。

阿利新蓝为羧基基团染色剂。在木材木质部中，羧基大多位于纤维素和半纤维素中，一般认为木质素中不存在羧基，因而阿利新蓝一般不用于木材染色。本发明采用酸洗的方式调节染色介质内的ph值改变染色剂活性，只要控制得当就能达到两种细胞响应各异，从化学成分角度区分出木材中厚壁组织和薄壁细胞。如本发明实施例以及附图所示，采用本发明所述方法对樟子松切片进行染色，不仅厚壁管胞(樟子松厚壁细胞)被均匀染成红色，射线薄壁细胞也被均匀染成亮蓝色，包括包括树脂道内的泌脂细胞也被染成亮蓝色。能够清楚的观察到射线薄壁细胞和射线管胞的形态。清楚地观察到射线管胞内壁有锯齿状加厚，锯齿状加厚存在于硬松类，如马尾松、油松和黑松等。而在红松、华山松和白皮松等软松类中射线管胞内壁平滑。锯齿状加厚对木材识别与鉴定具有重要意义。

对于厚壁细胞和薄壁细胞这种结构相近的组织区分研究而言，本发明提供的染色方法相对于现有技术更为简便有效。

附图说明

图1为实施例1的染色流程图；

图2为实施例1的染色效果图；其中，a图为横切面，b图为弦切面，c图为径切面；图中t表示管胞；r表示木射线；rc表示树脂道；rt表示射线管胞；rp表示射线薄壁细胞；

图3为实施例1的染色效果局部放大图；其中，d图为横切面，e图为弦切面，f图为径切面。

具体实施方式

本发明提供了一种区别木材中厚壁细胞和薄壁细胞的染色方法，包括以下步骤：

(1)以质量百分比浓度1％的番红染色液对木材切片染色45～75min，得到番红染色切片；

(2)依次以质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液对番红染色切片进行梯度洗脱，得到脱染色切片；

(3)以酸洗液清洗脱染色切片，得到酸洗切片；

所述酸洗液为含有质量百分比浓度13～15％冰醋酸的乙醇溶液；

(4)以质量百分比浓度1％的阿利新蓝染色液对酸洗切片染色1～3min，质量百分比浓度65～80％的乙醇水溶液洗脱，封片。

在本发明中，所述番红染色液用于染色木材的厚壁细胞，染色完成后的切片中显为红色。在本发明中，所述番红染色液的溶剂优选为水，将番红与水混合即得。在本发明中，所述番红染色液的染色时间优选为60min。

得到番红染色切片后，本发明依次以质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液对番红染色切片进行梯度洗脱，得到脱染色切片。本发明采用30～70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱是为了去除非厚壁组织上结合的番红染色液。在本发明中，所述质量百分比浓度30％、45％、60％和70％的乙醇水溶液的洗脱时间独立的优选为1～3min，更优选为2min。得到脱染色切片后，本发明以酸洗液清洗脱染色切片，得到酸洗切片；所述酸洗液为含有质量百分比浓度13～15％冰醋酸的乙醇溶液。本发明利用酸洗液清洗脱染色切片的目的是为了调节待染色细胞的ph值，使ph值维持在5.5～6.5的范围，从而用于激活阿利新蓝染料的活性，使其稳定的附着在木材的薄壁细胞上，实现清晰度高、分辨率高的染色，进而实现对木材薄壁细胞和厚壁细胞的区分。

在本发明中，所述酸洗液的溶剂优选为质量百分比浓度65～75％的乙醇水溶液，更优选为质量百分比浓度70％的乙醇水溶液。在本发明中，所述酸洗的时间为0.5～2min，更优选为1min。

得到酸洗切片后，本发明将以质量百分比浓度1％的阿利新蓝染色液对酸洗切片染色1～3min，质量百分比浓度65～80％的乙醇水溶液洗脱，封片。

在本发明中，阿利新蓝染色液用于为木材切片的薄壁细胞，在染色完成得到的染色切片中，薄壁细胞被染为亮蓝色。在本发明中，所述阿利新蓝染色液的溶剂优选为质量百分比浓度65～75％的乙醇水溶液，更优选为质量百分比浓度70％的乙醇水溶液。在本发明中，所述阿利新蓝染色液的染色时间优选为2min。

本发明采用质量百分比浓度65～80％的乙醇水溶液对阿利新蓝染色液染色后的切片进行洗脱，洗去附着在非薄壁细胞上的阿利新蓝染料；更优选为质量百分比浓度70％的乙醇水溶液。

在本发明中，所述封片优选的采用甘油进行封片，也可以采用其他本领域已知的封片剂进行封片。

本发明所述染色方法封片后得到染色切片，镜检，染色切片中厚壁细胞被染为红色，薄壁细胞被染为亮蓝色。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)试验材料

a、取树龄约22年樟子松木材，在胸高处取10厘米厚圆盘，带回实验室气干，而后使用滑走式切片米切取15～20μm切片，应力释放(用拨片夹平整，70℃水浴加热4h)后备用；

b、配置药液，番红染色液为质量百分比浓度1％的番红水溶液；阿利新蓝染色剂中，溶剂为70％乙醇溶液，溶质/(溶剂+溶质)为1％；酸洗液中，溶质为冰乙酸，溶剂为70％乙醇溶液，溶质/(溶剂+溶质)为13～15％。

(2)试验过程

染色流程如图1所示，取治好的樟子松切片，用番红染色液染色60min，得到番红染色切片；依次以质量百分比浓度30％、45％、60％、70％的乙醇水溶液各洗脱2min，得到脱染色切片；

以酸洗液对脱染色切片酸洗1min，得到酸洗切片；以阿利新蓝染色液对酸洗切片染色2min后，以质量百分比浓度70％乙醇洗净浮色，用甘油封片，显微镜下观察。

(3)试验结果

樟子松管胞和薄壁细胞的化学成分存在差异。管胞木质化程度高于薄壁细胞，管胞细胞壁含大量木质素和结晶度较高的纤维素，薄壁细胞细胞壁内纤维素和半纤维素含量高于木质素。调控染色介质内的ph改变染色剂活性，只要控制得当就能达到两种细胞响应各异，从化学成分角度区分出木材中厚壁和薄壁细胞。

镜检结果如图2和图3所示，可以看出不仅厚壁管胞被均匀的染成红色，射线薄壁细胞也被均匀的染成亮蓝色，包括树脂道内的泌脂细胞也被染成亮蓝色。能够清楚的观察到射线薄壁细胞和射线管胞的形态。清楚地观察到射线管胞内壁有锯齿状加厚，锯齿状加厚存在于硬松类，如马尾松、油松和黑松等。而在红松、华山松和白皮松等软松类中射线管胞内壁平滑。锯齿状加厚对木材识别与鉴定具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。