一种超声辅助LCC降解PET的方法

本发明属于pet的降解技术领域，具体涉及一种超声辅助lcc降解pet的方法。

背景技术：

塑料是一种由碳和氢聚合而成的材料，不仅与我们的日常生活息息相关，而且广泛应用于工业上。据不完全统计，2018年全球塑料产量达到3.59亿吨，平均每秒就卖出二十万个塑料瓶，然而只有9％被重新回收利用。其中，聚对苯二甲酸二乙酯(pet)是最重要的热塑性塑料之一，相比于其他传统材料(如木材、混凝土和金属)，pet拥有许多显著的优势，如不易断裂，轻便，耐腐蚀等。然而，在pet需求日益增长的同时，也造成了固体废弃物的堆积，pet占据了城市固体垃圾的很大一部分，一旦处理不当，便会带来一系列的健康和环境问题，比如地下水污染、温室气体排放、火灾和人体疾病等。目前处理废弃pet的主要方法有填埋、焚烧、再生造粒和热解，其中不论是填埋还是焚烧，都会对环境造成巨大的破坏，而再生造粒和热解等方法所需反应条件苛刻，工艺成本高昂等。因此，寻找绿色的降解方法迫在眉睫！

近年来，利用生物法降解pet塑料引起了广泛的关注，其实质是利用酶降解塑料.生物降解法具有反应条件相对温和、环境绿色友好的优点，降解后得到的产物能够被回收利用，符合可持续发展的理念，被认为是最理想的pet废弃物处理方法。2016年，yoshida等从废弃pet回收点的土样中，分离到一株可消化分解pet的细菌-坂井艾德昂菌(ideonellasakaiensis)。如图1，该菌首先分泌pet水解酶(petase)将pet降解成对苯二甲酸甲基-2-羟乙酯(mhet)，再将mhet转运入体内，并在mhet水解酶(mhetase)的作用最终降解为单体对苯二甲酸(tpa)和乙二醇(eg)。此后，科学家又陆续报道了多个性能不同的pet降解酶.其中，叶分支堆肥角质酶(lcc)经过两步级联催化，可以将pet直接降解为tpa和eg单体，因此利用lcc来生物降解pet具有很大潜能。

lcc(ec3.1.1.74)属于丝氨酸水解酶家族，具有典型地丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化三联体，来源于不同细菌的角质酶水解pet的活性大相径庭，但是都很低。超声波是一种频率为20khz～106khz的机械波，它可以加速某些化学反应，如促进化学物质的水解效率.超声广泛应用于辅助天然产物的提取、脂质的催化酯化和酯交换、食品加工、以及生化工程/生物技术如生物废水处理和生物修复。然而，应用超声波辅助生物降解pet却未见报道。

文献(anengineeredpetdepolymerasetobreakdownandrecycleplasticbottles)通过对lcc的分子改造，来提升lcc的活性和热稳定性，取得了一定的成效，却没有采用物理的方法(如超声)来进一步加大lcc降解pet的效率。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种超声辅助lcc降解pet的方法。

本发明的目的是提供一种超声辅助lcc降解pet的方法，通过与未超声辅助的相比，超声辅助提高了lcc降解pet的效率，可以加速lcc降解pet。)

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的超声辅助lcc降解pet的方法，包括如下步骤：

将角质酶、pet固体加入缓冲液中，混合均匀，得到混合液，升温进行超声处理，超声处理结束后进行保温处理，得到反应液，灭酶处理，完成超声辅助lcc降解pet的过程。

进一步地，所述缓冲液的ph值为7.5-8.5。

进一步地，所述缓冲液ph值为8.0。

进一步地，所述缓冲液为磷酸缓冲液。

优选地，所述缓冲液为0.1mol/l磷酸钾缓冲液。

进一步地，所述pet固体为片状薄膜，pet固体厚度为0.1-0.3mm。

优选地，所述pet固体厚度为0.2mm。

进一步地，所述pet固体与缓冲液的质量体积比为1.5-2.5：1g/l。

优选地，所述pet固体与缓冲液的质量体积比为2g/l。

进一步地，在所述混合液中，角质酶的浓度为7-15nmol/l。

优选地，在所述混合液中，角质酶的浓度为10nmol/l。

进一步地，所述超声处理的功率为20-30w，超声处理的时间为0-10h。

优选地，所述超声处理的功率为25w，超声处理的时间为5h。

进一步优选地，所述超声处理的功率为25w，超声处理的时间为2.5-10h。

进一步地，所述超声处理的温度为60-70℃。

优选地，所述超声处理的温度为65摄氏度。

进一步地，所述保温处理的时间为0-72小时。

进一步地，所述灭酶处理包括：将所述反应液煮沸12-20min。

优选地，所述灭酶处理包括：将所述反应液煮沸15min。

优选地，所述角质酶(lcc)可以利用微生物发酵产lcc，纯化后获得纯lcc酶液，具体方法包括：

取2μl含lcc基因的重组质粒，加入到100μle.colibl21(de3)感受态细胞中，轻柔混匀后冰浴30分钟后，取出后置入42℃恒温水浴90秒，然后立即冰浴5分钟，再加入1mllb培养基，在摇床中振荡复苏培养1小时(37℃、180rpm)。复苏结束后，取100μl涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb固体培养基，37℃过夜培养，所得单菌落即为e.colibl21(de3)-pet-26b(+)-lcc。挑取单菌落至含有卡那霉素(50μg/ml)的lb中培养12小时，作为种子液。接种1％体积的种子液于含有卡那霉素(50μg/ml)的lb中，37℃、180rpm扩大培养至菌液od600在0.6～0.8，冷却至室温后，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，于16℃、160rpm培养20小时进行诱导表达。使用高速冷冻离心机在4℃，8000rpm离心5min，收集诱导表达后的菌体，用ph8的磷酸缓冲液重悬，使用超声破碎仪在350w，工作3s，停止5s的条件下对重悬的菌液破碎20min，再使用高速冷冻离心机在4℃，8000rpm离心20min，得上清液为粗酶液，再用镍柱亲和层析纯化得lcc纯酶液。

本发明提供的超声辅助lcc降解pet的方法中，由超声引起的空化现象会产生大量包含反应液蒸气的微气泡，微气泡在pet和反应液之间的宽界面(大于200μm)处不对称塌陷，并以高速(大于100m/s)向pet表面产生微射流，而且微气泡的瞬时破裂也会产生高达10³mpa的强烈冲击波，反应液朝着或远离微气泡的剧烈运动形成的微对流可以加剧反应液与pet之间的碰撞，从而促进lcc对pet的解聚作用(该反应是主要的限速步骤)。另一方面，由空化现象引起的lcc的结构变化拓宽了lcc的底物通道。然而，超声功率过高、时间过长，lcc的结构进一步改变，趋向于不合理构象，导致lcc失活。与此同时，较高功率的超声所产生的瞬间空化作用会形成大量的高能量自由基，其会攻击lcc发生化学变化，影响lcc结构，使lcc活力降低。不仅如此，高强度的微射流和冲击波会破坏lcc结构，甚至会把lcc剪切成小碎片，而使其活性降低甚至乎失活，变的不利于pet的降解。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的超声辅助lcc降解pet的方法，操作简单，对环境无污染；

(2)本发明提供的超声辅助lcc降解pet的方法比未超声辅助的降解效率更高，降解效率是未超声辅助的1.21倍；

(3)本发明提供的超声辅助lcc降解pet的方法中，所采用的物质体系和降解条件都是经过实验优化的，降解效率高。

附图说明

图1为实施例中lcc降解pet的过程示意图。

图2a为实施例1中超声功率为25w时不同的超声时间对降解效率影响的结果图；

图2b为对比例1中超声功率为50w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2c为对比例2中超声功率为75w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2d为对比例3中超声功率为100w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2e为对比例4中超声功率为125w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2f为对比例5中超声功率为150w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图3a为未经任何处理的pet表面扫描电镜图；

图3b为浸泡在缓冲液5小时后pet表面扫描电镜图；

图3c为浸泡在缓冲液而且在25w的超声功率条件下进行超声5小时后的pet表面扫描电镜图；

图3d为浸泡在含0.05nmol的lcc的缓冲液5小时后的pet表面扫描电镜图；

图3e为实施例1中步骤2在25w的超声功率下进行超声5小时后的pet表面扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

一种超声辅助角质酶降解pet的方法，包括以下步骤：

步骤1

取2μl含lcc基因的重组质粒溶液(浓度为1ng/μl)，加入到100μle.colibl21(de3)感受态细胞中，混匀后冰浴30分钟后，取出后置入42℃恒温水浴90秒，然后立即冰浴5分钟，再加入1mllb培养基，在摇床中振荡复苏培养1小时(37℃、180rpm)。复苏结束后，取100μl涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb固体培养基，37℃过夜培养(12小时)，所得单菌落即为e.colibl21(de3)-pet-26b(+)-lcc。挑取单菌落至含有卡那霉素(50μg/ml)的lb中培养12小时，作为种子液。接种1％体积的种子液于含有卡那霉素(50μg/ml)的lb中，37℃、180rpm扩大培养至菌液od600在0.6-0.8，冷却至室温后，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，于16℃、160rpm培养20小时进行诱导表达。使用高速冷冻离心机在4℃，8000rpm离心5min，收集诱导表达后的菌体，用ph8.0的磷酸缓冲液重悬，使用超声破碎仪在350w，工作3s，停止5s的条件下对重悬的菌液破碎20min，再使用高速冷冻离心机在4℃，8000rpm离心20min，得上清液为粗酶液，再用镍柱亲和层析纯化得lcc纯酶液。

步骤2

在反应瓶中，往5ml浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲液(ph8.0)中依次加入0.01g的pet固体(厚度为0.2mm)和lcc，得到混合液，在所述混合液中，角质酶(lcc)的浓度为0.05nmol/l，在65℃水浴条件下，在超声功率为25w条件下分别超声2.5小时、5小时、7.5小时、10小时，然后置于65℃水浴锅中进行保温处理。

参照设置：在反应瓶中，往5ml浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲液(ph8.0)中依次加入0.01g的pet固体(厚度为0.2mm)和lcc，得到混合液，在所述混合液中，角质酶(lcc)的浓度为0.05nmol/l，置于65℃水浴锅中进行保温处理。

步骤3

取样，煮沸15min终止反应(灭酶处理)，高效液相色谱测定对苯二甲酸(tpa)的浓度

从反应瓶中取样100μl，沸水浴15min，加900μl的dmso，再使用高效液相色谱检测tpa，色谱柱为eclipseplus-c18柱(5μm,4.6×150mm,agilent)，柱温30℃.流动相a为0.1％体积比的甲酸水溶液，流动相b为纯乙腈，流速为0.8ml/min，采用梯度洗脱，95％流动相a和5％流动相b在15min内改变成54.5％流动相a和45.5％流动相b，紫外检测波长为254nm。

对比例1

对比例1与实施例1基本相同，唯一不同之处在于，步骤2中的超声功率改为50w，其余操作均与实施例1相同。

对比例2

对比例2与实施例1基本相同，唯一不同之处在于，步骤2中的超声功率改为75w，其余操作均与实施例1相同。

对比例3

对比例3与实施例1基本相同，唯一不同之处在于，步骤2中的超声功率改为100w，其余操作均与实施例1相同。

对比例4

对比例4与实施例1基本相同，唯一不同之处在于，步骤2中的超声功率改为125w，其余操作均与实施例1相同。

对比例5

对比例5与实施例1基本相同，唯一不同之处在于，步骤2中的超声功率改为150w，其余操作均与实施例1相同。

图2a为实施例1中超声功率为25w时不同的超声时间对降解效率影响的结果图；图2b为对比例1中超声功率为50w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2c为对比例2中超声功率为75w时，超声时间对降解效率影响的结果图；图2d为对比例3中超声功率为100w时，超声时间对降解效率影响的结果图；图2e为对比例4中超声功率为125w时，超声时间对降解效率影响的结果图；图2f为对比例5中超声功率为150w时，超声时间对降解效率影响的结果图；

图2a-图2f的横坐标表示步骤2的反应时间(从超声处理开始计算，至保温处理结束)，纵坐标为反应液中tpa的浓度(用以表示降解效率)。由图2a-图2f可发现：在相同超声功率处理条件下，不同的超声时间对降解效率影响不同，在低功率(25-75w)条件下，低超声时间(2.5-5h)下的超声对lcc降解pet都能起来积极的效果。25w超声功率的效果最显著。以25w超声功率为例，超声时间为5h，降解24h后，tpa浓度从0.72g/l提升到0.87g/l，降解效率是未超声的1.21倍。在高功率(100-150w)条件下，超声往往对lcc降解pet起负作用，以150w超声功率为例，未超声的比超声降解效率都要高。；在相同的超声处理时间的条件下，不同的超声功率对降解效率影响也不同，5h以内的超声往往比5h以外的超声效果要好。

图3a为未经任何处理的pet表面扫描电镜图；图3b为浸泡在缓冲液5小时后pet表面扫描电镜图；图3c为浸泡在缓冲液而且在25w的超声功率条件下进行超声5小时后的pet表面扫描电镜图；图3d为浸泡在含0.05nmol的lcc的缓冲液5小时后的pet表面扫描电镜图；图3e为实施例1中步骤2在25w的超声功率下进行超声5小时后的pet表面扫描电镜图。

为了进一步说明超声加速了lcc降解pet，利用sem分析了超声功率为25w，超声时间为5h时的pet表面降解情况，如图3a-图3e所示。未经任何处理的pet表面光滑无凹痕(图3a)，超声和未加lcc都不会改变pet的结构(图3b、图3c)，加入lcc但未超声条件下降解5h后，其表面出现明显凹凸不平的裂痕、凹槽、颗粒感(图3d)，而在25w超声辅助下，pet的表面破坏程度更加明显，出现了更多的裂痕、凹槽和碎片化(图3e)，说明相比于未超声，25w超声加速了lcc对pet的降解。

由图3a-图3e可发现：实施例1中在超声功率为25w的超声辅助下，pet的表面破坏程度更加明显，出现了更多的裂痕、凹槽和碎片化，25w超声加速了lcc对pet的降解。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。