一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用

本发明属于基因工程与制浆造纸领域，特别涉及一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法及应用。

背景技术：

1、全球纸浆和造纸工业持续增长，预计到2027年全球纸浆市场价值将增长超过6000亿美元。废纸是我国造纸产业重要的纤维原料，占比接近60％，使用废纸做成的再生纸浆有助于资源的循环利用，更有利于国内造纸产业可持续发展需求。随着废纸回用次数的增加，造成胶黏性物质急剧增多，带来成纸品质下降、以及纸机停机频率增加等实际问题。解决废纸二次加工过程中存在胶黏物累积等问题，是实现再生浆品质提升的关键技术。

2、胶黏物是指再生浆回用过程中出现的具有黏性、柔软性及疏水性的有机物质，通常是多种物质的组合，主要包括树脂、粘合剂、热熔物、压敏物、施胶剂和油墨残留物等，主要成分有果胶、聚醋酸乙烯酯(pvac)、聚丙烯酸酯、丁苯橡胶(sbr)、乙烯醋酸乙烯酯(eva)、等。胶黏物具有粘附性、亲脂性、表面负电性以及性变形等特点，很容易黏附和沉积在纸机系统的相应部位，如在成型网部出现粘性物质堵塞、在烘干部的烘缸上呈现胶黏性片状或条状胶黏物粘缸。因此会带来多频次的停机、更换刮刀频次增多，且所制作出来的成纸洞眼增多、纸张黑点增多、品质下降、以及成型网、毛布更换时间缩短等不利现象。目前去除和控制浆料中胶黏物的方法主要采用物理法、化学法和生物法。物理法主要通过筛选、净化、热分散、机械处理等方式除去大部分大胶黏物和部分微细胶黏物，但是对机械设备的选型和工艺流程的设计有着比较高的要求，并且存在高耗能、低效率等问题。化学法是通过往浆料中添加各类化学品来控制胶黏物，其所产生的化学垃圾在回用白水中积累，对纸机系统的正常运转和造纸白水的封闭循环有着不良影响，并且容易产生大量工业废水。

3、生物酶具有效率高、环境友好等显著优势，以生物酶为基础的生物造纸技术是实现造纸行业技术改造升级和绿色健康发展必然趋势。目前市面上销售的胶黏物控制用酶主要集中在酯酶和脂肪酶，如巴克曼公司开发的酯酶optimyze系列，诺维信公司的胶黏物控制酶等。它们都属于羧酸酯水解酶，可断裂部分胶黏物组成中的酯键，使其黏附物体积变小及黏附效率减弱，且被分解的胶黏物很难再重新聚合成大颗粒。。现有的胶黏物控制酶专利也以酯酶、脂肪酶为主，如cn106368035a公开了一种高温酯酶ttest去除废纸浆中胶黏物的方法；公布号cn109666661a提供了一种去除纸浆中胶粘物的生物酶制剂，改造了高温脂肪酶；公布号cn114591931a则说明了一种乙酰木聚糖酯酶克隆表达及其在造纸胶黏物控制中的应用等；另外多酶复配降解胶黏物的专利也主要采用酯类酶为主要酶制剂，如cn109957558a介绍中性酯酶的制备方法及用于废纸造纸工艺，cn110983849a选用脂肪酶与角质酶为胶黏物控制酶试剂。虽然脂肪酶及酯酶有一定的胶黏物去除效果，但造纸浆料中的黏性物质的种类多，组成变化大。单依靠脂肪酶、酯酶降解胶黏物，由于生物酶底物的选择性，其有效性只局限于某一种或某一类黏性材料，因此，目前的生物酶对胶黏物控制的效果不理想，需要找寻新的酶种以不同的作用方式协同去除胶黏物质。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法。果胶裂解酶pmgl-ba能够耐受中/高温高碱条件，高效去除胶黏物，提高纸浆的品质，且能够与多种酶复合用于再生浆生产过程中的胶黏物控制，同时该方法具有环境友好、生产成本低、工艺简单等特点，适合工业化生产。

2、本发明的另一目的在于，提供上述方法的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法，包括以下步骤：

5、在再生浆中加入酶，处理后得到低胶黏物的纸浆；

6、所述的酶包括果胶裂解酶pmgl-ba，其氨基酸序列的ncbi数据库登记号为wp_009329358.1。

7、所述的再生浆为旧瓦楞纸箱、书刊杂志纸、旧报纸、纸箱厂的边角料、印刷厂的白纸切边、水泥袋、混合废纸及杂废纸中的至少一种为原料制备的再生浆；优选为废旧箱板纸制备的再生浆料。

8、所述的再生浆的纸浆浓度为2～6％；优选为2％。

9、所述的处理的条件为ph5.0～11.0，温度30～90℃；优选为ph7～8，温度50～60℃；进一步优选为ph8.5，温度60℃。

10、所述的处理的时间为1～3h；优选为3h。

11、所述的处理为搅拌处理，转速为100～300rpm；优选为200rpm。

12、所述的果胶裂解酶pmgl-ba的加入量为2～50u/g，以再生浆的绝干质量计；优选加入量为44u/g。

13、所述的酶还包括脂肪酶、果胶酸裂解酶(ec 4.2.2.2)、淀粉酶、甾醇酶、木聚糖酶、酯酶中的至少一种；优选为还包括脂肪酶和果胶酸裂解酶。

14、所述的脂肪酶的ec号为ec 3.1.1.3。

15、所述的脂肪酶的加入量为20～30u/g，以再生浆的绝干质量计。

16、所述的果胶酸裂解酶的氨基酸序列的genbank数据库登记号为genbank:ab428424.1。

17、所述的果胶酸裂解酶的加入量为2～5u/g，以再生浆的绝干质量计。

18、所述的淀粉酶的ec号为ec 3.2.1.1。

19、所述的淀粉酶的加入量为200～400u/g，以再生浆的绝干质量计。

20、所述的甾醇酶的氨基酸序列的genbank数据库登记号为genbank:akz66521.1。

21、所述的甾醇酶的加入量为10～30u/g，以再生浆的绝干质量计。

22、所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶与果胶裂解酶pmgl-ba复配得到；优选为按酶活比20～30:2～4:2～50复配得到。

23、所述的酶为果胶酸裂解酶、淀粉酶与果胶裂解酶pmgl-ba复配得到；优选为按酶活比2～4:200～400:2～50复配得到。

24、所述的酶为脂肪酶、果胶酸裂解酶、淀粉酶、甾醇酶与果胶裂解酶pmgl-ba复配得到；优选为按酶活比20～30:2～4:200～400:10～30:2～50复配得到。

25、所述的低胶黏物的纸浆为白水浊度和电导率低的纸浆。

26、所述的果胶裂解酶处理再生浆胶黏物的方法在造纸中的应用。

27、所述的果胶裂解酶pmgl-ba的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

28、所述的果胶裂解酶pmgl-ba的氨基酸序列为一种多肽序列包含与seq id no.1具有至少90％的序列同一性；优选地，与seq id no.1具有至少95％，最优选至少100％的序列同一性的多肽；包括一种源自seq id no.1的多肽，其通过取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸，对其进行改造，同源性在90％以上。

29、所述的果胶裂解酶pmgl-ba为密码子优化后的编码基因核苷酸序列经构建真核重组表达载体转入毕赤酵母发酵后的上清液经层析后得到。

30、所述果胶裂解酶pmgl-ba上清液酶活可达200～500u/ml，工程菌所产蛋白可达0.4～0.9g/l。优选的，上清液酶活可达440.0u/ml，工程菌上清所产蛋白可达0.89g/l。

31、所述的层析包含阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析中的至少一种。优选的，所述层析为ni-nta亲和层析。

32、优选的，所述的真核重组表达载体的出发载体包括但不限于ppiczαa。

33、优选的，所述的毕赤酵母包括但不限于毕赤酵母x33。

34、优选的，单独使用果胶裂解酶pmgl-ba能达到去除胶黏物、改善纸张质量的目的。

35、更为优选的，多酶联合使用时可更好地降解胶黏物，提高纸张物理性能。

36、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

37、果胶裂解酶pmgl-ba是一种可直接作用于高度甲基化果胶的果胶酶，通过β-消除反应有效裂解聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，生成果胶寡糖，并且不会产生剧毒甲醇，具有酶选择性好、副产物少、反应条件温和、效率高等优点。在制浆造纸工艺中，由于胶黏物在浆料体系中呈现负电性，因而可以吸附各种阳离子物质，降低阳离子聚合物吸附黏性物质的效率，从而加剧胶黏物沉积，因而也被称为“阴离子垃圾”，即溶解和胶体物质(dissolvedand colloidal substances,dcs)，其中的主要物质包括甲基化果胶与聚半乳糖醛酸。因此果胶裂解酶通过降解dcs中的聚半乳糖醛酸来提高阳离子聚合物的效率并减少胶黏物的沉积，同时也可作用于胶黏物中的树脂等聚半乳糖醛酸类物质从而降解胶黏物。本发明旨在开发一种适用于工厂使用环境的中碱性、中高温果胶裂解酶，可特异性降解甲基化果胶，从而减少胶黏物沉积，其与酯酶、木聚糖酶联合等使用效果更佳，且生产成本低，工艺简单，更适合工业化生产。

38、本发明采用真核表达的方法，获得了重组芽孢杆菌来源的果胶裂解酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。

39、本发明中的果胶裂解酶pmgl-ba可以应对再生浆生产过程中的中高温以及中碱性环境，在较高温度下仍能保持较好的胶黏物去除效果。

40、本发明提供了一种果胶裂解酶处理造纸胶黏物的方法，该酶可单独使用，也可以与其他种类酶复配使用，能显著提高纸张的物理性能，降低浊度和电导率，是一种潜在的新型造纸用酶制剂，具体的，

41、本发明获得的果胶裂解酶pmgl-ba，可有效降解多聚半乳糖醛酸类物质，改善阳离子聚合物效率，进而吸附更多胶黏物；

42、果胶裂解酶pmgl-ba与酯酶、脂肪酶、木聚糖酶等复配使用，可水解纤维素和半纤维、纤维素和纤维素之间的黏连的物质，使纤维有效分离，增加纤维的渗透性，利于纤维充分吸水润涨，增强纸张抗张、撕裂、环压、耐破等物理性能。