一种基于CO2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置及其在微生物固碳合成有机酸中的应用

本发明属于发酵工程，具体涉及一种基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置及其在微生物固碳合成有机酸中的应用。

背景技术：

1、作为一类基础化学品，有机酸市场需求量在千万吨级，通过微生物固碳合成有机酸，有利于促进碳减排与碳中和，是一种绿色友好的生产技术。例如，丁二酸、富马酸、l-苹果酸均可通过微生物厌氧固定co2代谢产生。丁二酸、富马酸均是重要的有机化工中间体，不仅广泛应用于食品、化工、医药等领域，还可通过化学反应转化为1，4-丁二醇、γ-丁内酯、四氢呋喃等多种大宗化学品(精细石油化工,2022,39(4)，现代化工,2005,25:81)；l-苹果酸是优良的酸味剂，在医药、食品等领域有广泛用途(生物加工过程,2014,12(3))。利用微生物厌氧固碳合成有机酸是一项绿色环保的碳减排技术，然而，在发酵过程中，大部分输入的co2气体以气泡的形式迅速溢出，导致细胞对co2气体的实际利用效率极低，有研究指出菌株对co2气体的实际利用效率不足3％(化学工程,2009,37(1))，进而依赖碳酸盐或碳酸氢盐的供给(journal of co2 utilization，2018，26，595-601)，大大增加了成本。

2、微纳米气泡尺寸小，比表面积大，在水中上升速度慢，有利于提高气体在水中的溶解度，例如使臭氧在水中的溶解度提高2倍以上(separation and purificationtechnology，2020，238：116484)。因此，微纳米气泡可促进co2在水中的缓释。

3、固定化纤维床反应器已应用于多种有机酸生产中，通过吸附大量细胞，衰退期细胞或活力差的细胞会自动脱落，保证了纤维上细胞的活力，可缩短菌体生产周期，实现连续发酵。徐虹等人在专利cn101402914b中，构建了以甘蔗渣为固定化材料的发酵生产有机酸的固定化纤维床反应器，通过甘蔗渣固定化材料构建的甘蔗渣纤维床反应器生产丁二酸生产效率可以达到2.1g/l/h以上。

4、可见，如果将两者结合，可能有利于进一步促进微生物高效固碳合成有机酸等化学品。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中co2利用效率低、生产成本高等问题，提供一种基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述内置式固定化纤维床反应装置在微生物固碳合成有机酸中的应用。

3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

4、一种基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置，所述的内置式固定化纤维床反应装置内设置有co2缓释材料，所述的co2缓释材料为延缓水中co2释放的纤维素材料，由如下步骤制备得到：

5、(i)纤维素材料通过如下两种方式之一进行预处理：

6、纤维素材料通过水热法进行预处理：将纤维素材料与水混合后进行第一加热反应，反应结束后将体系洗涤至中性，烘干，得到预处理后的纤维素材料；或者

7、纤维素材料通过碱处理法进行预处理：将纤维素材料加入到第一氢氧化钠水溶液中进行第二加热反应，反应结束后将体系洗涤至中性，烘干，得到预处理后的纤维素材料；

8、(ii)预处理后的纤维素材料通过如下两种方式之一进行胺基改性：

9、预处理后的纤维素材料通过环氧化接枝法进行胺基改性：将步骤(i)得到的预处理后的纤维素材料加入到第二氢氧化钠水溶液中浸泡，随后取出洗涤至中性，烘干，得到烘干后的纤维素材料；将烘干后的纤维素材料和环氧氯丙烷加入到第三氢氧化钠水溶液中进行环氧接枝反应，反应结束后固液分离，固体部分水洗涤至中性，烘干，得到环氧化纤维素材料；将环氧化纤维素材料加入到有机胺溶液中进行胺基接枝反应，反应结束后固液分离，固体部分用水洗涤至中性，烘干，即得；或者

10、预处理后的纤维素材料通过戊二醛交联法进行胺基改性：将有机胺直接加入到戊二醛的磷酸钾缓冲溶液中进行胺基交联反应，随后向体系中加入步骤(i)得到的预处理后的纤维素材料，继续进行羟基交联反应，反应结束后固液分离，固体部分用水洗涤至中性，烘干，即得。

11、其中，步骤(i)中，所述的纤维素材料为天然的丝瓜络或者人工制备的纤维素海绵。

12、其中，步骤(i)中，在水热法中，所述的纤维素材料与水的质量体积比为1g：30ml～60ml；所述的第一加热反应，反应温度为150～170℃，优选为160℃，反应时间为20～40min，优选为20min。

13、其中，步骤(i)中，在碱处理法中，所述的纤维素材料与第一氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g：90ml～110ml，优选为1g：100ml；所述的第一氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的浓度为4～10wt％；所述的第二加热反应，反应温度为80～90℃，优选为85℃，反应时间为1.5～2.5h。

14、其中，步骤(ii)中，在环氧化接枝法中，所述的预处理后的纤维素材料与第二氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g：20ml～60ml，优选为1g：30ml；所述的第二氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的浓度为20～40wt％，优选为30wt％；所述的浸泡，浸泡时间为2～4h，优选为2h。

15、其中，步骤(ii)中，在环氧化接枝法中，所述的烘干后的纤维素材料与环氧氯丙烷的质量体积比为1g：6ml～10ml，优选为1g：7ml；所述的烘干后的纤维素材料与第三氢氧化钠水溶液的质量体积比为1g：30ml～90ml，优选为1g：60ml；所述的第三氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的浓度为1～10wt％；所述的环氧接枝反应，反应温度为30～50℃，反应时间为2～4h，优选为2h。

16、其中，步骤(ii)中，所述的有机胺为伯胺或仲胺；其中，伯胺为乙醇胺、二乙烯三胺、异丁醇胺、正丁胺、2-胺基正丁醇、乙二胺中的任意一种或几种的组合，仲胺为二乙醇胺、二乙胺、n-乙基乙醇胺中的任意一种或几种的组合，优选的有机胺为二乙醇胺、乙醇胺、二乙烯三胺、二乙胺中的任意一种。

17、其中，步骤(ii)中，在环氧化接枝法中，所述的有机胺溶液，溶剂为50v/v％乙醇水溶液，有机胺溶液中的有机胺与环氧氯丙烷的摩尔比为1：1；所述的胺基接枝反应，反应温度为40～60℃，优选为50℃，反应时间为1.5～4h，优选为2h。

18、具体的，当所述的有机胺溶液中有机胺为伯胺时，伯胺的摩尔浓度为0.6mol/l；当所述的有机胺溶液中有机胺为仲胺时，仲胺的摩尔浓度为1.2mol/l。

19、其中，步骤(ii)中，在戊二醛交联法中，所述的有机胺与戊二醛的摩尔比为1：1；所述的戊二醛在磷酸钾缓冲溶液中的浓度为2～4g/l，优选为2g/l；所述的磷酸钾缓冲溶液，由0.05mol/l磷酸二氢钾和0.05mol/l磷酸氢二钾等体积混合而成，ph＝6.8～7；所述的胺基交联反应，反应温度为30～40℃，优选为35℃，反应时间为2～4h，优选为2h。

20、其中，步骤(ii)中，在戊二醛交联法中，所述的预处理后的纤维素材料与戊二醛的磷酸钾缓冲溶液的质量体积比为1g：30ml～90ml；所述的羟基交联反应，反应温度为30～40℃，优选为35℃，反应时间为3～6h，优选为4h。

21、其中，所述的内置式固定化纤维床反应装置内设置有搅拌装置，所述的co2缓释材料经直径为0.3mm的锦纶线串联，固定缠绕在所述搅拌装置中的搅拌轴上，形成圆柱状纤维柱。

22、其中，所述的内置式固定化纤维床反应装置包括co2气体微分散装置、补料装置、co2缓释材料、温度自动控制装置、ph自动控制装置、反应器和抽料装置。

23、其中，所述的co2气体微分散装置、补料装置、温度自动控制装置、ph自动控制装置和抽料装置分别与反应器相连；所述的反应器上留有排气口，搅拌装置中的搅拌轴悬于反应器中。

24、上述内置式固定化纤维床反应装置在微生物固碳合成有机酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。

25、其中，利用基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置进行微生物厌氧固碳合成有机酸，包括如下步骤：

26、(a)将新鲜的发酵培养基加入内置式固定化纤维床反应装置中，接入菌株种子液，通入空气进行发酵，其通气速率0.01～0.05vvm，以5～8mol/l的koh水溶液或naoh水溶液调控ph为6.5～6.8，发酵温度36.5～37.5℃，搅拌速率为80～150rpm；；

27、(b)当菌株生物量od≥3～4时，向内置式固定化纤维床反应装置中通入co2气体置换出全部空气，随后关闭反应器的排气出口，通过调节co2的进气速率为0.01～0.12vvm，维持反应器内绝对压力恒定为0.15-0.18mpa，维持与步骤(a)相同的ph、温度和搅拌转速，进行厌氧发酵；

28、(c)当葡萄糖浓度降至1g/l以下时，在绝对压力恒定条件下泵出所有发酵液再流加新鲜的发酵培养基，在绝对压力恒定条件下进行第2批次发酵；

29、(d)重复步骤(c)进行5～15批次连续发酵。

30、其中，步骤(a)中，所述的菌株为具有固定co2合成有机酸能力的菌株，包括但不限于实施例中所述的产丁二酸或l-苹果酸或富马酸能力的菌株；现有技术中，只要是具有上述能力的菌株，例如经过分子改造可以固定co2产乳酸、丁酸、甲酸的菌株，都可以利用本发明所述的基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置固碳合成相应的有机酸产品，摆脱微生物固碳合成有机酸对碳酸盐或碳酸氢盐的依赖，提高细胞对co2的利用率，实现多批次连续发酵，大幅缩短发酵周期，从而提高微生物厌氧固碳合成有机酸的效率。

31、优选的，所述的菌株包括大肠埃希氏菌escherichia coli和产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes中的任意一种，更优选大肠埃希氏菌escherichia coliber208、大肠埃希氏菌escherichia coli ber108、大肠埃希氏菌escherichia coli jm125或产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113。

32、其中，步骤(a)中，所述的种子液，其生物量od≥4，接种量为5～10％v/v。

33、其中，步骤(a)和步骤(c)中，所述的发酵培养基，当所述的菌株为产丁二酸的大肠埃希氏菌escherichia coli ber208时，其配方为：甜菜碱0.12g/l，(nh4)2hpo4 2.6g/l，kcl0.15g/l，nh4h2po4 0.87g/l，mgso4 0.37g/l，fecl3 2.4g/l，cocl2 0.3g/l，cucl2 0.15g/l，zncl2 0.5g/l，na2moo4 0.5g/l，mncl2 0.5g/l，h3bo3 0.075g/l，葡萄糖40～100g/l；当所述的菌株为产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌actinobacillus succinogenes nj113时，其配方为：酵母粉5g/l，乙酸钠1.36g/l，kh2po4 3g/l，mgcl20.2g/l，cacl2 0.2g/l，nacl 1g/l，nah2po4 1.6g/l，na2hpo4 0.3g/l，玉米浆干粉7.5g/l，葡萄糖40～100g/l；当所述的菌株为产l-苹果酸的大肠埃希氏菌escherichia coli ber108时，其配方为：柠檬酸3g/l，na2hpo4·12h2o4 3g/l，kh2po4 8g/l；(nh4)2hpo48g/l；nh4cl 0.20g/l；(nh4)2so4 0.75g/l；mgso4·7h2o 1g/l；cacl2·2h2o 10mg/l；znso4·7h2o 0.5mg/l；cucl2·2h2o 0.25mg/l；mnso4·h2o 2.5mg/l；cocl2·6h2o 1.75mg/l；h3bo3 0.12mg/l；al2(so4)3 1.77mg/l；na2moo4·2h2o 0.5mg/l；柠檬酸铁(iii)16.1mg/l，甜菜碱1mmol/l，葡萄糖40～100g/l，vb120mg/l；生物素2mg/l；当所述的菌株为产富马酸的大肠埃希氏菌escherichia coli jm125时，其配方为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖20～100g/l卡那霉素30ug/l；氨苄青霉素100μg/l。

34、有益效果：本发明公开了一种基于co2缓释材料的内置式固定化纤维床反应装置，其中内置有co2缓释材料(即延缓水中co2释放的胺基改性纤维素材料)。co2缓释材料具有多级孔隙海绵状结构，在物理吸附co2微纳米气泡的同时，其负载的胺基可将水中co2转化成hco3-，大幅减少了co2气体的溢出，促进了细胞对co2气体的利用。本发明通过将对水中co2微分散供气装置产生的co2微纳米气泡具有缓释作用的co2缓释材料固定在反应装置的搅拌轴上，形成圆柱状纤维柱，延长了co2在水中停留时间。在发酵合成有机酸的应用中，摆脱了微生物固碳合成对碳酸盐或碳酸氢盐的依赖，提高细胞对co2的利用率。与其他固定化厌氧发酵生产有机酸相比，co2缓释材料同时可作为有机酸生产菌株的固定化载体，吸附游离细胞，定殖形成生物被膜，取代液体接种，实现多批次连续发酵，大幅缩短发酵周期，从而提高了微生物厌氧固碳合成有机酸的效率。