一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法及系统与流程

本发明属于实验教学领域，更具体地说，是涉及一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法及系统。

背景技术：

急性肾损伤是临床常见危重症之一，主要表现为短期内肾功能的迅速下降，具有较高的发病率和死亡率，且存在着发展为慢性肾病以及加速终末期肾病的风险。虽然目前已有多种治疗手段在急性肾损伤动物模型中进行了验证，但仍无有效药物治疗急性肾损伤的进展，因此，需要在理解其病理生理学的基础上对发病和预防机制进行深入研究。

巨噬细胞是机体最重要的免疫细胞之一，在免疫防御和炎症调节中发挥重要作用，巨噬细胞包括m2型巨噬细胞。小鼠急性肾损伤包括缺血再灌注诱导的急性肾损伤和缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤，经研究发现m2型巨噬细胞对小鼠急性肾损伤具有改善作用，巨噬细胞对小鼠急性肾损伤的干预效果及分子机制复杂，需要操作人员具有较高的实验能力，同时对实验的重现耗时较长、耗资较大，不便于科普及教学。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法及系统，旨在解决现有的巨噬细胞对小鼠急性肾损伤的干预效果及分子机制复杂，需要操作人员具有较高的实验能力，同时对实验的重现耗时较长、耗资较大，不便于科普及教学的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法，包括：

选择小鼠的类型；

模拟巨噬细胞的制备；

构建小鼠肾损伤模型的种类，其中，所述小鼠肾损伤模型包括缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型和缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型；

使用巨噬细胞对选择的小鼠肾损伤模型进行干预；

得到小鼠样本的病理组织检测数据，并给出实验总结。

优选地，模拟巨噬细胞的制备包括以下步骤：介绍巨噬细胞，提供分离巨噬细胞的参考路线和练习模式；从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；模拟获取小鼠腹腔液细胞的手术过程；模拟腹腔单核细胞的诱导分化过程；制定鉴定诱导分化产物的步骤。

优选地，在模拟巨噬细胞的制备的步骤中，若制定的步骤与参考路线不符，则该过程的操作完成后，不会得到结果反馈；此时，需要使用人员重新进行该过程的操作，直到实际操作与参考路线相同，才会得到该过程的结果反馈。

优选地，所述缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型的构建包括以下步骤：提供构建缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型的参考路线和练习模式；从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；模拟构建缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型的实验过程。

优选地，使用巨噬细胞对选择的小鼠肾损伤模型进行干预包括以下步骤：设定缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型再灌注时间；然后将m2型巨噬细胞注入小鼠中，并设计对照试验，经过对比后得到最终结果。

优选地，所述缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的构建包括以下步骤：提供构建缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的参考路线和练习模式；从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；模拟构建缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的实验过程。

优选地，使用巨噬细胞对选择的小鼠肾损伤模型进行干预包括以下步骤：将m2型巨噬细胞注入得到的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型中，并设计对照试验，经过对比后得到最终结果。

优选地，选择小鼠的类型包括以下步骤：在选择界面上罗列若干种小鼠供使用人员进行选择；根据使用人员的选择，分别在显示各种小鼠的资料介绍及使用推荐程度；当使用人员选择6-8周龄，体重20-25g的健康雄性c57bl/6小鼠时，本步骤结束。

本发明还提供一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的系统，包括：如上文任一实施例所述的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法构成的增强现实组件。

优选地，还包括：

模拟工具组件，与所述增强现实组件连接；以及

动作读取组件，用于读取、并将使用人员的手部动作传输给所述增强现实组件。

本发明提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的有益效果在于：与现有技术相比，本发明一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法，能辅助记忆标准的实验步骤，提高使用人员的实验技能，同时也更有利于该实验的科普及教学。

本发明提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的系统的有益效果在于：与现有技术相比，将实验过程通过增强现实技术逐步进行展示，提高使用人员学习的代入感，有利于帮助使用人员熟悉实验流程，减少实验失误，能快速的提高用人员的实验技能，有利于该实验的科普及教学。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的流程图一；

图2为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的流程图二；

图3为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的流程图三；

图4为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的流程图四；

图5为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法的流程图五；

图6为本发明实施例提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验系统的结构示意图。

图7为本发明实施例提供的显微镜下的m0型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的细胞形态图。

图8为本发明实施例提供的流式检测腹腔巨噬细胞表面分子标志物cd86，cd206的结果图。

图9为本发明实施例提供的rt-qpcr检测巨噬细胞因子mr、il-10、tgf-β、arg-1及ccl17mrna水平的表达的结果图。

图中：1、增强现实组件；2、模拟工具组件；3、动作读取组件。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请一并参阅图1至图9，现对本发明提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法进行说明。所述一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法，包括以下步骤：

s1、选择小鼠的类型；

本步骤具体的实现可以为：

s1.1、在选择界面上罗列若干种小鼠供使用人员进行选择；

s1.2、根据使用人员的选择，分别在显示各种小鼠的资料介绍及使用推荐程度；当使用人员选择6-8周龄，体重20-25g的健康雄性c57bl/6小鼠时，本步骤结束。

s2、模拟巨噬细胞的制备；

本步骤具体的实现可以为：

s2.1、介绍巨噬细胞，提供分离巨噬细胞的参考路线和练习模式；

练习模式为一种自主编辑模式，当使用人员路线编辑完成，提交后，会将参考路线与编辑的路线进行对比，并给出评价；自主编辑模式的设置，有效的锻炼并提高使用人员对巨噬细胞分离路线的熟练程度。

s2.2、从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；

s2.3、模拟获取小鼠腹腔液细胞的手术过程；

在步骤s2.3依次制定小鼠麻醉、手术操作、固定缝合、常规抗感染、饲养、获取腹腔液、腹腔单个核细胞的获取过程的操作步骤，并通过3d投影技术，实现实践与理论的结合。需要说明的是，在进行各过程的实际操作时，若制定的操作步骤与参考路线不符，该过程完成后，不会得到结果反馈；此时，需要使用人员重新进行该过程的操作，直到实际操作与参考路线相同，才会得到该过程的结果反馈。

在本步骤中，小鼠麻醉的参考路线为：c57bl/6小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(10mg/kg)进行麻醉，麻醉后将小鼠呈俯卧位固定，小鼠颈部和右侧腹中部备皮，碘伏消毒铺巾。手术操作的参考路线为：c57bl/6小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(10mg/kg)进行麻醉，麻醉后将小鼠呈俯卧位固定，小鼠颈部和右侧腹中部备皮，碘伏消毒铺巾。固定缝合的参考路线：先埋根线在腹膜上直接打结将腹膜透析管固定在腹部，再将背部软管与皮肤缝合在一起。常规抗感染的参考路线为：腹腔注射青霉素抗感染，肝素帽封闭。饲养参考路线为：待小鼠麻醉清醒后将小鼠送入spf级饲养室单笼饲养，自由进食水。获取腹腔液的参考路线从术后第三天开始上午通过腹膜透析管注射6-8ml预热(37℃)的透析液，四小时后轻轻按摩腹部，抽取腹腔液并注射6ml预热的透析液，四小时后同样的方法抽取腹腔液。腹腔单个核细胞的获取的参考路线：腹腔液350g离心5min后用pbs清洗一次，将分离的腹腔液细胞冻存待用。

s2.4、模拟腹腔单核细胞的诱导分化过程；

该步骤的参考路线为：选用cd11b⁺microbeads对分离的腹腔单核细胞进行纯化，筛选出的cd11b⁺m0型巨噬细胞用1640培养基(含10％fbs，50u/ml青霉素，50μg/ml链霉素和10ng/mlm-csf)重悬，调整胞密度接种于t25培养瓶内，置于5％co2，37℃孵箱内培养使巨噬细胞贴壁，孵育过夜后弃掉培养基并用pbs清洗除去悬浮细胞，剩余贴壁细胞即为m0型巨噬细胞。随后在上述1640培养基中加入il-4/il-13(20ng/ml)继续培养48h后将m0体外诱导为m2型巨噬细胞。

s2.5、制定鉴定诱导分化产物的步骤。

该步骤的参考路线为：对诱导分化产物通过形态学鉴定或/和流式表型鉴定，并判断腹腔单核细胞是否成功诱导为m2型巨噬细胞。

示例性的，m2型巨噬细胞的鉴定标准为：

在m-csf诱导下，收集到的腹腔单核细胞接种于t25培养瓶内培养，孵育过夜后弃掉培养基，pbs清洗除去悬浮细胞，剩余贴壁细胞即为m0型巨噬细胞。倒置显微镜下可观察到m0刚贴壁时偏圆形或类似鹅卵石状，随后伸出伪足，铺开呈三角形或长条形，细胞体积较大；再经il-4/il-13诱导48h后将m0诱导为m2型巨噬细胞，镜下可见大部分细胞呈椭圆形、梭形、不规则形等。

cd86及cd206分别为m1和m2型巨噬细胞的标志物。流式表型鉴定结果表明：m0及m2型巨噬细胞中cd86的表达基本相同，无显著差异；但m2相较于m0而言高表达表面标记物cd206。同时，与m0相比，m2能够高表达细胞因子甘露糖受体(mannosereceptor,mr)、il-10、tgf-β、arg-1及ccl17。

需要说明的是，在模拟巨噬细胞的制备的步骤中，若制定的步骤与参考路线不符，则该过程的操作完成后，不会得到结果反馈；此时，需要使用人员重新进行该过程的操作，直到实际操作与参考路线相同，才会得到该过程的结果反馈。通过倒逼机制，提高使用人员获取小鼠腹腔液细胞的技能，提高了学习效率，节省了学习时间。

s3、构建小鼠肾损伤模型的种类，其中，所述小鼠肾损伤模型包括缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型和缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型；

缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型包括以下步骤：

s3.1、提供构建缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型的参考路线和练习模式；

在该步骤中参考路线为：

小鼠腹腔按10mg/kg的剂量注射1％戊巴比妥钠进行麻醉；

剃毛刀剔除小鼠腹部毛发，并用碘伏急性消毒备皮；

对操作台紫外消毒后，用医用胶带将小鼠固定在操作台上的加热毯上，进行二轮消毒；

小鼠开腹暴露肾脏，找到肾蒂后用动脉夹夹住动脉，观察到肾脏变白继而变黑紫色；

双肾持续夹闭30min后，取走动脉夹。

s3.2、从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；

s3.3、模拟构建缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型的实验过程。

缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的构建包括以下步骤：

ss3.1、提供构建缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的参考路线和练习模式；

在本实施例中，参考路线为：

c57bl/6小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于碘伏中浸泡10min，然后将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于预冷的dme/f12培养基中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剥离肾皮质部分后切成1mm3的小块；将组织碎块放入前期配好的collagenaseiv溶液中，置于37℃水浴锅中消化40min，每隔10min用移液枪吸打混匀一次；消化完成后分别通过80目和100目滤网过滤去除未消化组织和肾小球，得到细胞悬液；细胞悬液经1250rpm，3min离心后弃上清，加入含10％fbs的dme/f12培养基重悬，在37℃，5％co2培养箱中培养，约3天更换培养基一次，直至细胞生长到培养瓶面积的80％即可得到纯化的原代肾小管上皮细胞。

取生长状态良好的ptecs细胞接种于6孔板，放入缺氧小室chamber中，充入混合气体(含94％n2,1％o2,5％co2)，将小室完全封闭，置于37℃细胞培养箱中缺氧培养24h后，从小室中取出孔板，放入常氧培养箱中(74％n2,21％o2,5％co2)复氧培养2h，收取细胞进行后续实验。

ss3.2、从提供的药剂及工具中选择出所要使用的药剂及工具；

ss3.3、模拟构建缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的实验过程。

该步骤具体的是，规划获得原代肾小管上皮细胞的路线；对根据路线产生的产物进行鉴定；待产物通过鉴定后，根据产物制定缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型的生成路线；对根据生成路线得到的结构进行鉴定。

s4、使用巨噬细胞对选择的小鼠肾损伤模型进行干预；

设定缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型再灌注时间；然后将m2型巨噬细胞注入小鼠中，并设计对照试验，经过对比后得到最终结果。

示例性的，缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型再灌注时间10nin，然后给予巨噬细胞干预，缝合关闭腹腔。然后根据实验设计方案进行对照实验的再现。

将m2型巨噬细胞注入得到的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤模型中，并根据实验设计方案设计对照试验，经过对比后得到最终结果。

s5、得到小鼠样本的病理组织检测数据，并给出实验总结。

具体的是，通过图片、音频及文字方式将小鼠样本的病理组织检测数据进行展现。

针对缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型展出以下结论：

m2型腹腔巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤的肾功能；

m2缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤的肾脏损伤；

m2减少缺血再灌注诱导的急性肾损伤的肾脏炎症反应；

m2减少缺血再灌注诱导的急性肾损伤的肾脏炎症因子及t细胞表达；

m2促进缺血再灌注诱导的急性肾损伤的后肾小管再生修复。

针对缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型展出以下结论：

m2减轻缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤的炎症反应；

m2抑制缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤的细胞凋亡；

m2抑制缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤细胞活性的损伤；

m2通过促进tgf-β/smad7通路改善缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞氧化损伤；

m2通过调控tgf-β/smad7通路改善缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞凋亡；

m2促进缺氧再复氧诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞的增殖。

本发明提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的方法，与现有技术相比，能辅助记忆标准的实验步骤，提高使用人员的实验技能，同时也更有利于该实验的科普及教学。

作为本发明提供的一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的系统的一种具体实施方式，请一并参阅图1至图9，一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的系统，包括：基于上文任一实施例构成的增强现实组件1。

将实验过程通过增强现实技术逐步进行展示，提高使用人员学习的代入感，有利于帮助使用人员熟悉实验流程，减少实验失误，能快速的提高用人员的实验技能，有利于该实验的科普及教学。

在本实施例中，一种模拟巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的系统还包括模拟工具组件2以及动作读取组件3，模拟工具组件2与增强现实组件1连接；动作读取组件3用于读取、并将使用人员的手部动作传输给增强现实组件1。增强现实组件1先将小鼠全息投影，然后使用模拟工具组件2在小鼠的全息投影上进行操作，动作读取组件3会实时读取使用人员的动作，并在使用人员的操作合格后，增强现实组件1相应的也相应改变小鼠全息投影的状态。

在本实施例中，增强现实组件1包括演示模块、路线编辑模块、资料数据模块以及引导模块，路线编辑模块用于用户的对实验过程的编辑：演示模块用于根据路线编辑模块提供路线，展现相应的实验演示；资料数据模块分别与路线编辑模块、演示模块电连接，用于储存巨噬细胞改善小鼠急性肾损伤实验的数据资料；引导模块与数据库电连接，用于在实验过程中展现各步骤的参考步骤。

需要说明的是，这只是腹腔来源的巨噬细胞的一种实用，还可以在体外诱导成m1型巨噬细胞，dc细胞等的应用，均应包含在本发明的保护范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。