专利名称：显微镜成像的校准靶的制作方法
技术领域：
本公开涉及显微镜成像技术，并且具体地涉及用于提高显微镜放大倍率的系统和方法。
背景技术：
在现代科学研究中采用许多不同类型的成像系统来采集小或远的物体的图像，包括极高分辨率电子显微镜、极高分辨率扫描隧道(“STM”)与原子力(“AFM”)成像仪器和许多不同类型的光学显微镜、望远镜与图像生成传感器。如同大多数类型的成像装置、仪器和技术，存在与不同类型的显微镜方法关联的许多不同的折衷和平衡。例如，透射电子显微镜方法对固定和薄切片样品进行，并且因此约束于对基本上二维、无生命样品使用。扫描隧道和原子力显微镜方法是用于获得材料表面的高分辨率图像的非光学技术，但不可以用于获得关于表面下方样品的体积的纳米尺度或微米尺度内含物的信息。所有类型的显微镜方法无论如何受分辨率限制约束，而光学显微镜方法与称为“衍射极限”的可能最有名的分辨率限制关联，其将传统可见光光学显微镜方法限制于大约200nm的分辨率极限。在过去的20年期间，开发了各种超分辨率技术来允许荧光团-标记样品(最经常是生物样品)由光学突光-显微镜方法仪器以显著低于传统光学显微镜方法的衍射-限制分辨率的分辨率的成像。这些技术基于收集从荧光团-标记样品随时间发射的荧光。假如发射荧光团按大于大约200nm的距离彼此分开，或换句话说，假如荧光团在样品中的位置将可由传统光学显微镜方法分辨，可以确定荧光团在样品中的位置，在某些情况下达到IOnm以下的分辨率。然而，因为仅当发射荧光团在样品内稀疏布置时可以解释荧光-发射信号，一般需要从不同组的稀疏布置的荧光团产生大量的中间图像，以便构建荧光团-标记物体的超分辨率最终图像。从而超分辨率图像以积累相对弱的信号来产生更大量的中间图像需要的时间为代价而获得。超分辨率成像需要的时间不利于活细胞的成像，其趋于在收集相对弱的信号(从其构建超分辨率图像)需要的时间段期间移动和改变形状。收集相对弱的信号需要的长时间段还可导致活细胞暴露于有害或致命水平的电磁辐射，其包括紫外光。采集用于超分辨率成像的足够数据需要的时间还可代表显著的实验约束，而不管成像的样品的类型。由于所有这些原因，设计和开发、制造光学显微镜的那些人继续寻找系统和方法来捕捉衍射极限以下的图像。
发明内容
该公开针对光学显微镜校准装置，其可以与光学显微镜一起使用来调节显微镜成像参数使得样品的图像可以在衍射极限以下获得。这些显微镜校准装置包括至少一个校准靶。每个校准靶包括具有显微镜物镜的衍射极限以下的尺寸的多个特征。对特定放大倍率获得校准靶中的一个的单独颜色分量衍射限制的图像。图像处理可以用于组合这些颜色分量图像，并且获得校准靶的聚焦并且无畸变的图像。用于获得校准靶的该聚焦并且无畸变的图像的参数可以用于用相同的参数获得对相同放大倍率的样品的聚焦并且无畸变的图像。
图1A-1C示出光学显微镜校准装置的不同视图。图2示出接收从物面中的点源输出的光并且分散开来在对应像面中产生斑点的光学系统。图3A-3B示出理论点扩散函数的示例表示。图4示出与光学系统关联的衍射极限。图5示出固定到显微镜载玻片的表面的校准装置。图6示出附连到载玻片的表面的校准装置的横截面视图。图7示出具有附连的校准装置的载玻片的横截面视图。图8A示出显微镜内的光学路径，该显微镜具有发射在可见光谱中波长的宽范围上的光的光源。图8B示出从校准靶的子区中的孔输出的光束的一示例。图SC示出与从校准靶的子区中的孔输出的光关联的三个单独颜色分量图像的一示例。图8D示出具有各自发射在可见光谱的不同波长范围中的光的单独光源的显微镜的一示例。图9A-9B示出与校准靶的子区关联的一系列原像的示例表示。图10示出用于校正物镜的色差和衍射极限的图像校准的一假设示例。图11A-11D示出当校准原像来产生校准图像时要确定的校准参数的图形表示。图12示出在与校准靶的子区关联的三维图像空间中的区的假设透视图。图13示出具有六个单独校准靶的光学显微镜校准装置。图14A-14B示出具有校准装置的盖玻片的立体图和俯视图。图15A-15B示出具有固定到显微镜载玻片的校准的盖玻片。图16示出获得衍射极限以下的样品图像的方法的流程图。图17示出执行图像处理步骤的典型电子计算机系统。
具体实施例方式图1A-1C示出光学显微镜校准装置100的不同视图。在图1A中，校准装置100包括设置在透明板104上的不透明层102。该不透明层102包括位于装置100的近似中心的校准靶106。装置100还可包括设置在该不透明层102外表面上的多个方向箭头108来辅助安置装置100，使得靶106位于显微镜物镜的视场内。图1B示出由特征110的二维方形点阵构成的校准靶106的放大视图。在其他实施例中，特征108可以具有其他二维点阵布置，例如特征的菱形、六边形、矩形、平行四边形或甚至随即分布。特征110可以是在不透明层102中形成的孔。图1C示出沿图1B中示出的线1-1的校准装置100的校准靶106部分的横截面视图。该横截面视图展现设置在透明板104的表面上的不透明层102，并且特征110是位于层102内的孔。图1C包括层102和透明板104的一部分的放大视图112。该放大视图112展现将层102粘附到透明板104的表面的薄粘合剂层114，并且示出跨越不透明层102和粘合剂层114的高度并且具有大致上垂直于表面的侧壁的孔110。也就是说，每个孔110暴露粘合剂层114设置在其上的透明层104表面的一部分。如在图1C中示出的，透明板102的厚度T可以从大约0.1mm变化到大约1.0mm,并且可以由任何适合的透明材料构成，例如玻璃或透明聚合物。不透明层102的厚度t可以从大约20nm变化到大约IOOnm或更大，并且可以由任何适合的不透明材料构成，例如金(“Au”)和银(“Ag”)。粘合剂层114可以由任何适合的材料构成，其将不透明层102附连到透明层104的表面。例如，如果不透明层102由Au构成并且透明板104由玻璃构成，那么铬(“Cr”)可以用于将不透明层102附连到玻璃表面。如图1B的示例示出的,孔110的点阵包括由孔的较不密集方形点阵118环绕的孔的内部密集方形点阵116。回到图1C，邻近的内部点阵孔110之间的距离D可以从大约2μπι变化到大约SMffl，并且邻近的外部点阵孔之间的距离可以从大约5Mm变化到大约15ΜΠ1。孔110的直径d可以从大约50nm变化到大约190nm。注意孔的直径可以选择成小于显微镜的衍射极限，其是大约 λ/2，其中λ是光的波长。例如，在校准装置100的一个实施例中，孔110可具有大约IOOnm的直径，带有5Mm的内部点阵距离和大约IOMm的外部点阵距离。大约IOOnm的直径完全在可见光光学显微镜方法的衍射极限以下,该可见光光学显微镜方法具有大约200nm的分辨率极限。校准装置100可以通过首先在透明板的表面上沉积粘合剂层来制造。该粘合剂可以通过将粘合剂喷射或刷到表面上而沉积。在沉积粘合剂层后，沉积不透明层。如果不透明层是金属或半导体，不透明层可以使用等离子体或化学气相沉积或晶片接合而沉积。孔可以使用聚焦离子束刻蚀在不透明和粘合剂层中形成，来产生具有大致上直的圆柱壁的孔。在备选实施例中，特征108可以是设置在不透明层102上的珠子。这些珠子具有直径d并且可以是反射珠或荧光珠，其当暴露于特定波长的光时发荧光。与下文描述的图像处理组合的校准装置100可以产生在衍射极限以下的样品的微观要素的图像。例如，考虑诸如显微镜的典型的衍射限制光学系统，其可以仅收集入射波阵面的一部分以改造成像面中的图像。通过光学系统的光偏离直线传播并且在像面中稍微分散开。当具有圆孔的光学系统接收从物面中的点源输出的平面波时，光实际上分散成叫做由晕环环绕的艾里斑的微小圆形斑点，而不是在像面中存在对应的像点。该艾里斑的半径确定相邻图像的重叠，并且因此确定分辨率。图2示出光学系统202，其接收从物面206中的点源(X，y)204输出的光并且将光分散开以在对应的像面210中产生斑点208。从点源204输出的光具有辐照度I (X，y)，并且由光学系统202变换成以点(X’，y’)212为中心的斑点208，其具有在斑点208之上由对称点扩散函数214表示的对应辐照度。例如，用于表示例如斑点208的斑点之上的辐照度分布的合适的点扩散函数可以是艾里函数。图3A示出像面内一维中理论点扩散函数的一示例表示。水平轴302是通过例如图2中示出的点212的像面中的点(X’，y’)的像面中的线。理论点扩散函数具有高而相对窄的中央峰304，带有在远离该中央峰的两个方向上延伸的高度减少的二次峰305-314。曲线的高度对应于强度并且水平轴302对应于在输出-像面中离起点的直线距离。图3B提供点扩散函数在三维空间中的表示，其中两个水平轴316和318位于像面的平面中并且在点(X’，I，)相交，并且在点扩散函数的表面上任意点处的高度对应于在像面上的对应位置处观察到的强度。由光学系统产生的脉冲响应函数的图像表现为中央亮斑(对应于点扩散函数的中央峰)，其具有对应于环绕中央峰的环或脊的半径增加的同心环。图4示出与光学系统关联的衍射极限。考虑在物面中按距离S1 406分开的两个点(X1, 和(x2, y2>404O从光学系统输出的这两个点的图像是中心在像点(X’D y')和(x’2，y’2)的两个点扩散函数408和410。光从点源402和404扩散成在像面中具有由点扩散函数408和410表示的辐照度分布的斑点，这是衍射有关的现象。当S1足够大使像面中点扩散函数408和410的中心之间的对应距离s’ , 412分开点扩散函数，使得两个点扩散函数的总和(在图4中由曲线414表示)仍然是明显双峰时，像面中的点402和404的图像可以彼此分辨。然而，当物面中的两个点416和418按足够小的距离S2 420分开使像面中的两个点422和424的对应图像重叠，在两个点扩散函数的总和(由曲线426表示)合并成单个峰的情况下，两个点416和418在像面中不能彼此分辨。传统光学显微镜方法的最小间距或最大分辨率一般认作:
其中 Θ是可以进入或离开光学系统的光的最大圆锥的半角； λ是光的波长；
η是光学系统在其中操作的介质的折射率；并且 NA是显微镜物镜的数值孔径。输入图像中的最小间距或最大分辨率对应于右侧点扩散函数的第一左侧零点与左侧点扩散函数的第一侧手零点在其处重合的点扩散函数之间的间距。可以成像的特征的最小分隔或最大分辨率对于光学显微镜方法系统对应于大约200nm。因为点源在像面中的点扩散函数图像由于衍射的结果出现，最小间距或最大分辨率称为“衍射极限”。参照图4讨论的衍射极限不是使用光学显微镜方法获得的样品图像的绝对分辨率极限。在衍射极限以下获得的校准靶100的放大图像可以使用各种成像技术处理来获得图像处理校准参数，其可以进而用于调节具有也在衍射极限以下的放大分辨率的样品图像。现在提供参照图5-11校准靶100如何可以用于确定一组校准参数的描述，所述一组校准参数可以用于调节具有在衍射极限以下的放大分辨率的样品图像。图5示出固定到显微镜载玻片502的表面的校准装置100。在图5中，安置校准装置100使得不透明表面102面向载玻片502的表面504。具有大致上匹配载玻片502和透明板104的折射率的折射率的光学凝胶506设置在不透明表面102和载玻片502的表面504之间。例如，透明板104和载玻片502可以用具有1.52的折射率的玻璃构成，并且光学凝胶506可以用也具有1.52的折射率的材料构成。图6示出使用位于沿校准装置100的边缘的粘合剂602附连到载玻片502的表面的校准装置100的横截面视图。该粘合剂602可以是例如甲苯磺酰胺-甲醛树脂的聚合物粘合剂，其可以粘附到抛光表面，例如载玻片502的抛光表面。
载玻片502和校准装置100然后放置在显微镜台上，其中校准装置100面向显微镜物镜，并且载玻片502面向显微镜光源。图7不出安置用于用光学显微镜的显微镜物镜702观察的具有附连的校准装置100的载玻片502的横截面视图。在图7中，浸油704设置在透明板104和物镜702之间。该浸油704具有大致上匹配透明板104和载玻片502的折射率的折射率。光706从位于物镜702对面的照明源输出。该光706通过载玻片502和校准靶106。如在图7中示出的，物镜702安置使得通过校准靶106的至少一部分的光落在由虚线708和710限定的物镜的视场内。图7不意在限制校准装置100与油浸物镜的使用。校准装置100可以与其他类型的显微镜物镜一起使用，例如在空气介质中工作的物镜和在水介质中工作的物镜。校准装置100可以与许多不同种类的光源一起使用。例如，适合的光源包括白炽灯、卤素照明器或发射在可见光谱中波长的宽范围上的光的任何源。其他的适合光源包括发射在可见光谱中窄的波长段上的光的发光二极管(“LED”)和激光器，例如可见光谱的蓝色、绿色或红色段。图8A示出显微镜内的光学路径，该显微镜具有发射在可见光谱中波长的宽范围上的光的光源，例如卤素照明器。有许多不同类型的显微镜和对应的光学路径。图8A不意在表示显微镜的所有不同的众所周知的变化内的光学路径，图8A也不表示显微镜的所有各种组件。图8A意在示出如应用于显微镜成像的显微镜方法的一般原理，其使用校准装置100来获得可以用于处理在衍射极限以下拍摄的样品图像的图像处理参数。在图8A中，载玻片502和校准装置100设置在台802上，其中透明板104面向显微镜物镜804，并且光源806安置在载玻片502对面。点线方向箭头808表示从光源806发射的光。光源806可以是白炽灯、卤素照明器或发射在可见光谱中波长的宽范围上的光的任何光源。从光源802发射的光通过载玻片502和校准装置100。较低放大倍率物镜可以用于定位板100的方向箭头108 (在图1中示出)以便将校准靶106的至少一部分沿显微镜物镜的光轴放置。选择较高放大倍率物镜804，并且物镜804和/或台802安置在z_方向810上来获得校准靶106的子区的放大图像。如上文参照图1描述的，构成校准靶106的孔的直径(例如， IOOnm)小于从光源806发射的可见光的波长(即，从大约380nm至大约750nm的可见光范围)并且小于衍射极限(S卩广200nm)。通过校准靶106中的每个孔的光输出为窄光束，其在该束进入物镜804时分散开。从校准靶106中的孔输出的每个光束由物镜804收集并且经历由于物镜804的色差和衍射极限引起的畸变。结果，从校准靶106中的孔输出的每个光束分成发散的有不同颜色的束，其包括从该孔输出的束的光谱。色差是其中透镜不能将通过该透镜的光的波长中的全部聚焦到相同会聚点的光学畸变类型。色差由对于光的不同波长具有不同折射率的透镜引起。典型的物镜包括膜或透镜涂层，其提供对色差的一些校正。图8B示出从校准靶106的子区811中的孔输出的白光束的一示例。该子区811在图1B中由虚线界限120标示，并且表示落入物镜804的视场内的校准靶106的一示例部分。在图8B的示例中，物镜804 (在图8A中示出)由块表示，并且方向箭头812表示从子区811中的孔814输出的光束的方向。当光束812通过物镜804时，构成物镜804的透镜形成色差，其将束812分成有不同颜色的束，其中每个束从束812的原始路径发散，并且每个束是构成束812的光的色谱中的不同颜色分量。例如，不同图案的方向箭头816-818刚好表示束812的蓝色、绿色和红色分量束。由于物镜804的色差和衍射极限，有不同颜色的束816-818从束812的路径发散。回到图8A，显微镜包括三个二向色镜820-822，其配置成将可见光谱中的蓝色、绿色和红色波长范围反射到对应检测器824-826，其连接到例如下文参照图17描述的计算机系统的计算机系统827以用于图像处理。方向箭头828-830表示特定放大倍率的子区811的图像的蓝色、绿色和红色分量。二向色镜820使在红色和绿色波长范围中的光通过并且将蓝色波长范围中的光反射到检测器824的像面；二向色镜821使在红色波长范围中的光通过并且将绿色波长范围中的光反射到检测器825的像面；并且二向色镜822将红色波长范围中的光反射到检测器826的像面。结果，检测器824捕捉子区811的图像的蓝色分量，检测器825捕捉子区811的图像的绿色分量，并且检测器826捕捉子区811的图像的红色分量。这三个单独的图像是从孔输出的光的蓝色、绿色和红色分量的蓝色、绿色和红色图像，对相同的放大倍率捕捉并且发送给计算机系统827以用于图像处理。三个单独的蓝色、绿色和红色图像可以同时或在不同的时间对相同的放大倍率捕捉。例如，如果图像要在不同的时间对相同的放大倍率捕捉，那么每次仅使用二向色镜和对应检测器中的一个来捕捉对应的颜色图像。因为物镜804引起从校准靶106中的孔输出的光束分成发散的颜色分量，如上文关于图8B描述的，在单独的蓝色、绿色和红色图像中表示的孔没有对齐。图SC示出在图SB中示出的子区811的三个单独的蓝色、绿色和红色图像的一示例表示。如上文参照图SB描述的，物镜804引起从每个孔输出的光束分成单独的发散的有色光束。在图SC的示例表示中，蓝色、绿色和红色图像831-833表示如上文参照图8A描述的由检测器824-826对校准靶106的特定放大倍率捕捉的图像。因为对应的有色束发散，单独图像831-833中的斑点没有对齐。例如，如在图8C中示出的，方向箭头834表示从孔814输出的光束812的路径，并且虚线圆圈835-837表示光束812的图像将位于图像831-832中的每个中的地方。然而，由于物镜804的色差和衍射极限，产生在三个单独的蓝色、绿色和红色分量图像中的斑点。从孔814输出的光的蓝色分量由蓝色图像831中的蓝色斑点840表示，从孔814输出的光的绿色分量由绿色斑点841表示，并且从孔814输出的光的红色分量由红色图像833中的红色斑点842表示。三个图像831-833由处理器328求和来产生组合的原像844。该原像844是对特定放大倍率的从子区811的孔输出的每个光束的刚好蓝色、绿色和红色分量的单个图像。例如，虚线圆圈846表示从孔814输出的光将在图像844中出现的斑点，但由于物镜804的色差和衍射极限，从孔814输出的光分成分量颜色，其具有在图像844中表示为蓝色、绿色和红色斑点840-842的分量颜色中的刚好三个。尽管蓝色、绿色和红色斑点在单独的图像831-833中没有对齐，每个斑点是对特定放大倍率的从对应孔输出的光的颜色分量的聚焦和无畸变图像。例如，图像831-833中的蓝色、绿色和红色斑点840-842各自是束812的刚好蓝色、绿色和红色分量的聚焦和无畸变的单独图像。如上文描述的，校准装置可以与使用由LED和/或激光器的组合构成的光源的显微镜一起使用，其中每个LED或激光器发射在可见光谱的不同窄波长范围中的光。图8D示出具有由单独的蓝色、绿色和红色光源构成的光源850的显微镜的一示例。在图8D中示出的显微镜与上文参照图8A描述的显微镜相似，除了三个二向色镜820-822由部分镀银镜851、半镀银镜852、镜853和对应的蓝色、绿色和红色滤光器855-857代替。源850输出在可见光谱的窄蓝色、绿色和红色波长段中的光，其通过校准板100的校准靶中的每个孔，并且由物镜804收集和聚焦，如参照图8A和8B描述的。部分镀银镜851将从物镜804输出的光的近似1/3朝滤光器855反射，其仅使窄蓝色波长段中的光通过，而光的近似2/3通过镜851到半镀银镜852。镜852将透射通过镜851的光的近似一半朝滤光器856反射，其仅使窄绿色段通过。透射通过镜852的光由镜853朝滤光器857反射，其仅使窄红色段中的光通过。检测器824-826捕捉子区811的蓝色、绿色和红色图像，如上文参照图8A和SC描述的。在图8A-8D的示例中，因为蓝色、绿色和红色分量是可以用不同辐照度组合来生成多种不同颜色图像的原色，使用从物镜804输出的光的蓝色、绿色和红色分量。备选地，可以使用生成、反射和透射除蓝色、绿色和红色外的颜色的其他类型的光源、二向色镜和滤光器，来捕捉从物镜输出的光的不同颜色分量图像。显微镜常常用于将样品和显微镜物镜之间的一系列物面成像。该操作可以用于产生一组像面，其一起表示由物镜形成的图像的三维图像空间。图9A示出与校准靶106的子区811关联的一系列原像901-908的一示例表示。这些原像901-908中的每个使用子区811的不同聚焦获得，并且这些原像901-908形成从子区811中的孔的每个输出的分量光束的三维图像空间。方向箭头910和911 (指示为X-和y_轴)表示子区811的平面，并且方向箭头914表示原像901-908在子区域811上的升高，其中每个原像与子区811的不同物面关联。图像空间展现物镜804将从子区811中的每个孔输出的光的蓝色、绿色和红色光分量聚焦在哪里。图9B示出使用物镜804形成的图像空间中的区916 (在图9A中示出)的假设透视图。斑点918-920表示从子区811中的孔输出的单个光束的单独蓝色、绿色和红色分量的单独蓝色、绿色和红色焦点。斑点918-920表示物镜804如何将蓝色、绿色和红色分量聚焦成中心在与物镜804关联的三维图像空间中的不同点的单独焦点。校准靶106的原像然后可以使用各种成像技术处理来获得校准图像和关联的图像校准参数，其可以进而用于处理具有在衍射极限以下的放大分辨率的样品图像。可以用于获得校准参数的适合的显微镜成像技术的一示例是在2010年3月31日提交并且由Applied Precision有限公司(GE Healthcare公司)所有的美国专利申请12/751，816中描述的密集随机采样成像(“DSSI”)，其通过引用结合于此。因为DSSI的细节在12/751,816专利申请中描述，现在提供如应用于校准靶100的原像的使用DSSI获得的图像校准参数的概观。图10示出图像校准如何可以用于校正物镜的色差和衍射极限的一假设示例。在图10中，图像1002表示子区811的特定放大倍率的原像，其如上文描述的参照图8获得。不同阴影化斑点的每个三元组表示对特定放大倍率的物镜804的蓝色、绿色和红色斑点。例如，图10包括蓝色、绿色和红色斑点1006-1008的放大视图。蓝色、绿色和红色斑点1006-1008表示从子区811中的孔输出的单个光束的蓝色、绿色和红色分量颜色的图像。尽管物镜804的色差和衍射极限引起从校准靶中的孔输出的每个光束分成颜色分量束，与颜色分量关联的每个斑点是从孔输出的光的该颜色分量的放大、聚焦并且无畸变的图像。例如，蓝色、绿色和红色斑点1006-1008各自是对特定放大倍率的从子区811中的对应孔输出的光的蓝色、绿色和红色分量的放大、聚焦并且无畸变的图像。由于物镜804的色差和衍射极限，这三个单独的分量放置在由图像1002表示的像面中的不同空间位点中。图像校准调节图像1002的空间参数，以便将与从每个孔输出的光关联的颜色分量斑点组合来产生子区811的校准图像1010。校准图像1010表示子区811的放大图像，其中例如斑点1012的每个斑点表示从子区811中的每个孔输出的光的放大、聚焦并且无畸变的图像。图像1010中的每个斑点可以使用DSSI组合原像1002中的对应颜色分量斑点而生成。例如，图10包括斑点1012的放大1014，其在校准图像1010中表现为无畸变的白斑并且通过组合蓝色、绿色和红色斑点1006-1008产生。也就是说，原像1002中的每组颜色分量斑点被组合以产生校准图像1010中的单个斑点，其中校准图像1010中的每个斑点显得焦点对准(即，没有由于物镜804的色差和衍射极限引起的畸变)，即使校准图像1010中的斑点是从具有在物镜804的衍射极限以下的直径的孔输出的光的放大视图。图11A-11D示出被调节以便从原像1002产生校准图像1010的校准参数的图形表示。校准包括图像平移、图像旋转、放大和非线性几何畸变的组合，其进而用于组合与子区811中的每个孔关联的颜色分量斑点。图1lA示出校准如何组合与三个单独的蓝色、绿色和红色图像关联的蓝色、绿色和红色斑点1101-1103来形成单个聚焦的无畸变斑点1104的一示例标示，该单个聚焦的无畸变斑点1104表示透射通过校准装置100中的孔的光的图像。如在图1lA中示出的，斑点1101-1103具有分别由高斯分布1105-1107表示的强度轮廓。校准是使用平移、旋转、放大和几何畸变来调节强度峰的坐标和大小的过程，使得强度峰对齐来产生具有关联的强度轮廓1108的斑点1104。图11B-11C示出关于由X、Y和Z坐标表征的三维笛卡尔坐标参考系的图像平移和旋转的示例。图1lB表示将单独的原像蓝色、绿色和红色分量图像1110-1112中的每个在参考系内平移来对齐与校准靶中的相同孔关联的颜色分量斑点的一示例。例如方向箭头1114-1116的方向箭头表示颜色分量图像中的每个可以在参考系中平移的三个不同方向。图1lC表示将单独的原像蓝色、绿色和红色分量图像1110-1112中的每个关于参考系坐标旋转来进一步对齐与相同孔关联的颜色分量斑点的一示例。方向箭头1118-1120表示与像面1110关联的正交x、y和z局部坐标，它们已经相对于参考系旋转来进一步对齐与相同孔关联的颜色分量斑点。非线性几何畸变是数字图像处理技术，其中数字操作颜色分量图像的部分来进一步对齐与相同孔关联的颜色分量斑点。在图1lD的示例中，图像1110-1112的三个重叠子区1122-1124的非线性畸变被畸变以对齐与相同孔关联的斑点并且可以是焦深依赖的。例如，子区1122-1124的平移、旋转、放大倍率调节和畸变对齐与相同孔关联的斑点1125-1127。形成三维图像空间的原像可以平移、旋转和局部翘曲来将颜色分量的焦点偏移到共同焦点。图12示出在图9B中示出的区916的假设透视图。校准可以用于将蓝色、绿色和红色焦点918-920偏移到单个焦点1202，其对应于在没有由物镜804的色差和衍射极限引起的畸变的情况下从子区811中的孔输出的光束的焦点。在备选实施例中，校准装置可以包括任何数量的校准靶，对于每个校准靶具有变化的或相同的特征，而不是将校准装置限制于仅一个校准。图13示出具有六个单独校准靶1301-1306的光学显微镜校准装置1300。校准靶的每个邻近对由例如隔离装置1308的隔离装置分开，该隔离装置涂在装置1300的不透明层1310上或蚀刻到装置1300的不透明层1310中。校准靶1301-1306可以具有特征尺寸，或者校准靶1301-1306可以具有特征尺寸的任意组合。例如,校准靶1301-1303可以由具有大约90nm直径的不透明层1310中的孔构成，而校准靶1304-1306可以由具有大约IlOnm的直径的孔构成。也可以在盖玻片中形成一个或多个校准装置以能够实现校准参数的确定，之后通过简单地将样品滑入显微镜物镜的视场而将样品在衍射极限以下成像并且使用校准参数来处理样品的图像。图14A-14B示出具有在盖玻片的一部分中形成的校准装置1402的盖玻片1400的立体图和俯视图。校准装置1402包括校准靶1406和方向箭头1408，其采用与上文描述的校准装置100相同的方式配置，但与包括透明板104的校准装置100不同，校准装置1402包括相对更大的透明板1404。板1404的第一区专用于校准装置1402，并且板1404的第二区1410不覆盖来收容样品。校准装置1402采用与校准装置100相同的方式使用，但盖玻片1400的剩余未覆盖区1410可以放置在要使用显微镜观察的样品上。图15A示出要固定到显微镜载玻片1502的表面的校准装置1402和盖玻片1404。在图15A中，安置校准装置1402使得校准装置1402的不透明表面面向载玻片1502的表面1504。具有大致上匹配载玻片1502和盖玻片1404的折射率的折射率的光学凝胶1506设置在不透明表面和表面1504之间，并且样品1508放置在盖玻片1404的未覆盖区1410上。图15B示出附连到载玻片1502的表面1504的盖玻片沿图15A中示出的线I1-1I的横截面视图。可以使用位于沿盖玻片1400的边缘的粘合剂1510来将盖玻片1400固定到载玻片1502。该粘合剂1510可以是例如甲苯磺酰胺-甲醛树脂的聚合物粘合剂，其可以粘附到抛光表面，例如抛光表面1504。图16示出获得衍射极限以下的样品图像的方法的流程图。在框1601中，校准靶如上文参照图8A和8D描述的使用光源照射。在框1602中，从校准靶的子区输出的光如上文参照图8A和8D描述的使用显微镜物镜收集。在框1603中，生成从物镜输出的光的某些颜色分量的靶的单独颜色图像，如上文参照图8A和8C描述的。在框1604中，单独的颜色图像被组合来形成原像，如上文参照图8C描述的。在框1605中，生成使用例如DSSI的视频处理基于原像的校准图像。存储用于调节校准靶的原像(例如原像1002)来产生校准靶的校准图像(例如校准图像1010)的放大倍率和图像校准参数。保存校准靶的图像放大倍率和关联的校准参数使得当实际样品使用特定的放大倍率成像时，关联的校准参数可以用于调节样品的衍射限制的图像。图17示出执行DSSI或另一个适合的图像处理方法的图像处理步骤的典型电子计算机系统。该计算机系统包含一个或多个中央处理单元(“CPU”)1702-1705、通过CPU/存储器子系统总线1710或多个总线与CPU互连的一个或多个电子存储器1708、将CPU/存储器子系统总线1710与另外的总线1714和1716互连的第一桥1712、或其他类型的高速互连介质，包括多个高速串行互连。这些总线或串行互连进而将CPU和存储器与例如图形处理器1718的专用处理器连接，并且与一个或多个另外的桥1720连接，所述桥与高速串行链路或与例如控制器1727的多个控制器1722-1727互连，其提供对各种不同类型的计算机可读介质的访问，例如计算机可读介质1728、电子显示器、输入装置和其他这样的组件、子组件和计算资源。计算机可读介质1728可以是参与向CPU提供指令以用于执行的任何适合的介质。例如，计算机可读介质1728可以是非易失性介质，例如固件、光盘、闪速存储器、磁盘或磁盘驱动器。图像处理也可在分布式计算机系统上实现并且也可以部分在硬件逻辑电路中实现。前面的描述为了解释的目的使用特定命名法来提供本公开的全面理解。然而，为了实践本文描述的系统和方法而不需要特定细节，这对于本领域内技术人员将是明显的。为了图示和描述的目的呈现特定示例的前面的描述。它们不意为详尽的或将本公开限于描述的确切形式。明显地，鉴于上文的教导许多修改和变化是可能的。示出并且描述这些示例以便最好地解释本公开的原理和实际应用，由此使本领域内其他技术人员能够最好地利用本公开和具有如适合于预想的特定使用的各种修改的各种示例。意图是本公开的范围由随附权利要求和它们的等同物限定。
权利要求
1.一种校准装置，包括: 至少一个校准靶，其中每个校准靶包括具有小于显微镜物镜的衍射极限的尺寸的多个特征，所述显微镜物镜用于将所述至少一个校准靶的子区成像。
2.如权利要求1所述的装置，进一步包括: 透明板；以及 附连到所述透明板的表面的不透明层，所述不透明层包括所述至少一个校准靶。
3.如权利要求2所述的装置，进一步包括设置在所述不透明层和所述透明层的第一表面之间来将所述不透明层附连到所述表面的粘合剂。
4.如权利要求2所述的装置，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括暴露所述表面的所述不透明层中的孔。
5.如权利要求2所述的装置，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括所述不透明层中的荧光珠。
6.如权利要求2所述的装置，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括所述不透明层中的反射珠。
7.如权利要求1所述的装置，其中，具有小于所述衍射极限的尺寸的所述特征进一步包括每个特征具有小于所述显微镜物镜的所述衍射极限的直径。
8.如权利要求1所述的装置，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一个校准靶的光的波长的直径。
9.一种显微镜盖玻片,包括: 包含第一部分和第二部分的透明板； 设置在所述第一部分上的不透明层；以及 在所述不透明层中形成的至少一个校准靶，其中每个校准靶包括具有小于显微镜物镜的衍射极限的尺寸的多个特征，所述显微镜物镜用于将设置在所述第二部分与载玻片之间的样品和所述至少一个校准靶成像。
10.如权利要求9所述的盖玻片，进一步包括设置在所述盖玻片和所述不透明层之间以将所述不透明层附连到所述表面的粘合剂。
11.如权利要求9所述的盖玻片，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括暴露所述表面的所述不透明层中的孔。
12.如权利要求9所述的盖玻片，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括所述不透明层中的荧光珠。
13.如权利要求9所述的盖玻片，其中，所述至少一个校准靶的所述特征进一步包括所述不透明层中的反射珠。
14.如权利要求9所述的盖玻片，其中，具有小于所述衍射极限的尺寸的所述特征进一步包括每个特征具有小于所述显微镜物镜的所述衍射极限的直径。
15.如权利要求9所述的盖玻片，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一个校准靶的光的波长的直径。
16.一种用于校准 衍射-限制的显微镜图像的方法，所述方法包括: 照射校准靶，其包括具有小于显微镜物镜的衍射极限的尺寸的多个特征； 使用所述物镜收集从所述校准靶的子区输出的光，所述物镜将从每个特征输出的所述光分成颜色分量； 生成对某些颜色分量的单独颜色图像，每个颜色图像表示所述靶的不同颜色图像； 组合所述单独颜色图像以形成所述子区的原像；以及 基于所述原像生成校准图像，所述校准图像示出所述子区的聚焦并且无畸变的特征。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述校准靶进一步包括: 透明板；以及 附连到所述透明板的表面的至少一部分的不透明层，所述不透明层包括所述校准靶。
18.如权利要求16所述的方法，其中，照射所述校准靶进一步包括用光源照射所述校准靶，所述光源发射在与可见光谱中的不同颜色关联的多个波长范围上的光。
19.如权利要求16所述的方法，其中，照射所述校准靶进一步包括用多个光源照射所述校准靶，每个光源发射在与可见光谱中的不同颜色关联的波长范围上的光。
20.如权利要求16所述的方法，其中，生成对某些分量的单独颜色图像进一步包括将每个颜色分量分别弓I导到检测器的像面，同时使其他颜色分量通过。
21.如权利要求16所述的方法，其中，生成对某些分量的单独颜色图像进一步包括将所述单独颜色图像存储在计算机可读介质中。
22.如权利要求16所述的方法，其中，基于所述原像生成所述校准图像进一步包括对所述单独颜色图像执行图像平移、图像旋转、放大和非线性几何畸变以获得所述校准图像。
23.如权利要求22所述的方法，进一步包括将与以下关联的参数数据存储在计算机可读介质中:图像平移、图像旋转、放大和非线性几何畸变，其与所述单独颜色图像关联。
24.如权利要求16所述的方法，其中，具有小于所述衍射极限的尺寸的所述特征进一步包括每个特征具有小于所述显微镜物镜的所述衍射极限的直径。
25.如权利要求16所述的方法，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一个校准靶的光的波长的直径。
全文摘要
该公开针对光学显微镜校准装置，其可以与光学显微镜一起使用来调节显微镜成像参数使得样品的图像可以在衍射极限以下获得。这些显微镜校准装置包括至少一个校准靶。每个校准靶包括具有显微镜物镜的衍射极限以下的尺寸的多个特征。对特定放大倍率获得校准靶中的一个的单独颜色分量衍射限制的图像。这些颜色分量图像可以被组合并且图像处理来获得校准靶的聚焦并且无畸变的图像。用于获得校准靶的该聚焦并且无畸变的图像的参数可以用于通过使用相同的参数获得对相同放大倍率的样品的聚焦并且无畸变的图像。
文档编号G02B21/34GK103119496SQ201180046755
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者P.C.古德温 申请人:应用精密公司