一种基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种结构照明显微系统，可以实现高速彩色三维层析成像，可广泛应 用于生物学、医学、材料科学及微电子学等领域的研宄。
【背景技术】
[0002] 以共聚焦、双光子显微为代表的点扫描显微成像技术具有三维层析成像能力，因 而在生物医学和材料科学研宄中得到了广泛的应用。点扫描技术通过扫描高度汇聚的激光 焦点来获取物镜焦面处的二维图像，并通过轴向逐层移动扫描，获得样品的三维层析图像。 随着各种新型荧光分子探针的出现，多色扫描显微技术使得人们可以同时观测活体细胞中 多种蛋白质之间的相互作用，另外，多色荧光标记也提高了成像的对比度和解析度。目前市 场上的高端彩色共聚焦显微镜都是基于多通道融合的原理，即使用多个波长的激发光源激 发多色荧光标记的样品，用光电倍增管分别收集每个彩色通道（红，绿，蓝）的信号，然后合 并为代表样品真实色彩的单幅彩色图像。虽然激光共聚焦扫描系统具有高空间分辨率和轴 向切片的能力，但是逐点扫描完整个三维样品需要较长的时间，同时高强度的激光也会对 活细胞和组织产生较强的光损伤和光毒性。
[0003] 与激光扫描成像方式不同，宽场成像使用面阵CCD或者CMOS相机，一次曝光就可 以得到像面的全部二维信息，但是由于成像物镜有一定的景深，因此CCD相机得到的图像 实际上是像面信息和非像面背景的叠加。正是由于非像面背景的影响，图像的信噪比和空 间分辨率受到了很大的限制。因此普通的宽场成像无法实现三维层析成像。近年来出现的 结构照明显微技术是一种宽场光学显微技术，但是它却具有良好的三维成像能力。结构照 明显微技术使用高空间频率的结构光场对样品照明，通过图像处理算法能将宽场图像中的 像面信息和非像面背景有效地分离。通过使用位移平台在物镜光轴方向逐层扫描，可以得 到样品的三维层析图。与激光扫描技术相比，结构照明显微具有更快的成像速度和简单的 结构，光损伤和光毒性效应也要小很多，更适用于活体生物组织的实时成像研宄。但是目前 大多数结构照明显微系统都使用单色的CCD或者CMOS相机采集图像，无法得到样品的彩色 信息。然而对于一些研宄领域而言（例如表面形貌测量，材料科学等领域），复原样品的彩 色信息是非常重要的。虽然采用类似彩色共聚焦显微镜的多波长激发多色荧光标记样品和 多通道融合的原理，也可以获得彩色层析图，但成像速度也受到限制，而且得到的也非真实 彩色，只是多色合成的结果。
【发明内容】
[0004] 针对目前结构照明显微无法快速获得样品色彩信息的问题，本发明提出了一种基 于结构照明的彩色三维层析显微成像系统及方法。
[0005] 本发明的技术解决方案是：
[0006] -种基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统，包括照明光源1、设置在照明光 源光路上的分光棱镜2、设置在分光棱镜2的反射光路上的结构光产生器3、设置在分光棱 镜2的透射光路上的透镜4、设置在透镜光路上的分光镜5、设置在分光镜5上方光路上的 显微物镜6和载物台7、设置在分光镜5下方光路上的反光镜8和筒镜9、设置在筒镜后方 的C⑶相机10,其特殊之处在于：
[0007] 所述C⑶相机10为彩色(XD相机；
[0008] 所述照明光源1为非相干单色LED光源或白光LED光源；
[0009] 所述结构光产生器3为数字微镜器件DMD。
[0010] 上述分光镜5为长波通分光镜。
[0011] 上述分光镜5为50:50宽带分束器。
[0012] 一种基于结构照明的彩色三维层析显微成像方法，其特殊之处在于，包括以下步 骤：
[0013] 1)产生结构照明光场：
[0014] 由单色LED或白光LED照明，通过数字微镜器件DMD产生三个空间方向相同、相位 分别为0°、120°、240°的结构照明光场，结构照明光场经过显微物镜照射载物台上的样品；
[0015] 2)彩色(XD相机采集图像：
[0016] 对应于三个相位的结构照明光场，彩色C⑶相机分别采集得到三幅彩色二维图像 I0(RGB)、I120(RGB)和I240 (RGB);
[0017] 3)图像处理：
[0018] 3. 1)将步骤2)中采集的三幅不同相位的彩色二维图像I。(RGB)、I12Q (RGB) 和I24〇 (RGB)，按照下面的转换公式⑴从RGB彩色空间转换到HSV彩色空间，得到在 HSV彩色空间的三幅不同相位的二维图像：I。(HSV)、I12Q (HSV)和I24Q (HSV)，其中max= max{R,G,B},min=min{R,G,B}；
[0020] V=max
【主权项】
1. 一种基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统，包括照明光源（1)、设置在照明 光源光路上的分光棱镜（2)、设置在分光棱镜（2)的反射光路上的结构光产生器（3)、设置 在分光棱镜（2)的透射光路上的透镜（4)、设置在透镜光路上的分光镜（5)、设置在分光镜 (5)上方光路上的显微物镜（6)和载物台（7)、设置在分光镜（5)下方光路上的反光镜（8) 和筒镜（9)、设置在筒镜后方的CCD相机（10)， 其特征在于： 所述CCD相机（10)为彩色CCD相机； 所述照明光源（1)为非相干单色LED光源或白光LED光源； 所述结构光产生器（3)为数字微镜器件DMD。
2. 根据权利要求1所述的基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统，其特征在于： 所述分光镜（5)为长波通分光镜。
3. 根据权利要求1所述的基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统，其特征在于： 所述分光镜（5)为50:50宽带分束器。
4. 一种基于结构照明的彩色三维层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 产生结构照明光场： 由单色LED或白光LED照明，通过数字微镜器件DMD产生三个空间方向相同、相位分别 为0°、120°、240°的结构照明光场，结构照明光场经过显微物镜照射载物台上的样品； 2) 彩色CCD相机采集图像： 对应于三个相位的结构照明光场，彩色CCD相机分别采集得到三幅彩色二维图像I0(RGB)、I120(RGB)和I240 (RGB); 3) 图像处理： 3. 1)将步骤2)中采集的三幅不同相位的彩色二维图像IJRGB)、I12CI(RGB)和 I24CI(RGB)，按照下面的转换公式⑴从RGB彩色空间转换到HSV彩色空间，得到在HSV 彩色空间的三幅不同相位的二维图像：I。(HSV)、I12Q (HSV)和I24Q (HSV)，其中max= max{R,G,B},min=min{R,G,B}；
V=max 3. 2)根据下面公式（2)计算出H、S、V三个通道的宽场图Iwide(i);根据公式（3)计算 出H、S、V三个通道的层析图Iz(i)，其中i=H，S，V;
3. 3)将步骤3. 2)中得到的H、S、V三个通道的层析图合成并转换到RGB彩色空间，得 到IZ(RGB);将三个通道的宽场图合成并转换到RGB彩色空间，得到Iwid6(RGB);从HSV彩色 空间转换到RGB彩色空间，按照下面的转换公式（4)计算；其中11^=mod(H/60° );
3. 4)将步骤3. 3)中得到的IZ(RGB)归一化得到IzNOTm(RGB)，并和Iwide(RGB)相乘，得到 这一层的彩色二维层析图IZMSUlt(RGB); 4)根据样品的厚度多次重复步骤2)和3)，得到样品Z方向一系列的彩色二维层析图， 最终重构出样品完整的彩色三维图像I_ult(RGB)。
5. 根据权利要求4所述的基于结构照明的彩色三维层析显微成像方法，其特征在于： 所述单色LED光源为非相干单色LED光源。
6. 根据权利要求5所述的基于结构照明的彩色三维层析显微成像方法，其特征在于： 所述单色LED光源为波长450nm的蓝光LED光源。
【专利摘要】本发明提供一种基于结构照明的彩色三维层析显微成像系统及方法，包括照明光源、设置在照明光源光路上的分光棱镜、设置在分光棱镜的反射光路上的结构光产生器、设置在分光棱镜的透射光路上的透镜、设置在透镜光路上的分光镜、设置在分光镜上方光路上的显微物镜和载物台、设置在分光镜下方光路上的反光镜和筒镜、设置在筒镜后方的CCD相机；CCD相机为彩色CCD相机；照明光源为非相干单色LED光源或白光LED光源；结构光产生器为数字微镜器件DMD。本发明在HSV彩色空间进行图像处理，复原样品的彩色信息。与传统的RGB彩色空间相比，HSV彩色空间避免了R、G、B三个通道之间的相互串扰，可以更加准确地获得样品的真实彩色信息。
【IPC分类】G02B21-06, G02B21-36
【公开号】CN104570315
【申请号】CN201410849425
【发明人】雷铭, 姚保利, 千佳, 但旦, 周兴, 杨延龙, 严绍辉, 闵俊伟
【申请人】中国科学院西安光学精密机械研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日