专利名称：一种纳米金和λDNA链连接的自组装材料的制备方法
技术领域：
一种纳米金和A DNA链连接的自组装材料的制备方法，属于材料化学技术 领域。
背景技术：
随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透，利用纳米生物技术研究和解决 其中的重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成为当前一个重要的前沿领域 之一。胶状的金纳米粒子(AuNPs)，由于其特殊的物理、化学性质和生物相容 性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域有很广泛的应用。
聚合酶链反应(PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术，是现代分子生物学 的实验工作基础之一，在生命科学、遗传学和医学等领域发挥着重要作用。PCR 通常在均一的溶液中进行，在固体界面上能否顺利进行PCR是一个具有探索性 的课题。近来，Turner等人利用在微孔表面上的PCR检测了血色素基因的突变； Adessi等人研究了玻璃表面的PCR，探讨了研制DNA芯片的可能性；Lockley 等人对在尼龙表面的PCR做了初步的探索。纳米粒子界面上的PCR还未见报道。 如果在纳米粒子界面上能顺利进行PCR，可以大大拓宽PCR技术的应用范围， 把均相体系中的PCR技术扩展到纳米粒子界面上。因此把引物连接在纳米粒子 界面上，研究纳米粒子界面上的PCR是有意义的。本发明系统研究了金纳米粒 子界面上的PCR。为了减小引物连接在纳米粒子界面上所产生的空间位阻，在 纳米粒子和引物之间连接-(CH2)6-作为缓冲连接臂。通过Au-S键把5'端修饰 -81^-((:112)6-的引物连接在金纳米粒子表面，采用质粒入DNA作为模板，用琼脂 糖电泳和透射电子显微镜(TEM)等技术对PCR产物进行分析和检测，研究了引 物浓度、退火温度和循环次数对PCR的影响。实验结果表明把R、 F两种引 物连接在金纳米粒子界面上，能够顺利进行PCR，且金纳米粒子能被连接形成 纳米粒子聚合体，由于DNA结构高温解链低温复性和碱基互补配对的性质，使 得这种新型纳米材料成为一种具有温度可控性的自组装材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米金和X DNA链连接的自组装材料的制备方 法，此种新型纳米自组装材料同时具有自组装性和温度可控性。
本发明的技术方案: 一种纳米金和A DNA链连接的自组装材料的制备方法，
步骤为(1)胶体金的制备；(2)胶体金与上下游引物的偶联；(3)利用所制 得的连金引物进行PCR，PCR产物进行琼脂糖电泳和TEM电镜扫描证明得到预 期产物；
(1) 胶体金的制备利用Frens法制备15nm左右的胶体金。 所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，烘箱烘千备用；制备时，向洁
净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01%的氯金酸和洁净的搅拌子，中速 搅拌，加热至沸腾，保持5 6分钟，紧接着一次性加入质量浓度为1%的柠檬 酸三钠溶液4mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深 蓝黑色，最后变成酒红色，当颜色不再变化后再继续加热15分钟使反应充分完 全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到100mL， 4'C保藏；
(2) 胶体金与上、下游引物的偶联将所制备的胶体金与引物F、 R分别 进行连接，得金纳米粒子-引物复合物，即AiiNP-F及AuNP-R，处理后备用。
所用上、下游引物(由上海生工合成)为 297bp-F: 5，-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC画3'， 297bp-R: 5'-GGCATAGCGTCCTCACATTTC隱3'，
将所制得的胶体金于11500 rpm离心15min，弃上清，用灭菌水恢复至原体 积的1/10，将上、下游引物浓度稀释至10um，以胶体金上下游引物R或F体 积比1 : 1的比例分别混合，超声10s左右，使之混合均匀，室温静置12h，向 其中加入lM的NaCl，使体系中的NaCl浓度达到0.05M，继续室温静置12h， 反应完毕，先用6500rpm离心15min，弃上清，然后加含0.1 mol/LNaCl pH 7.0 的磷酸盐缓冲溶液离心清洗，重复清洗多次除去未连接在金纳米粒子界面上的 引物，最后用灭菌水定容至胶体金的体积待用，将引物连接在金纳米粒子表面， 构成金纳米粒子-引物复合物，即AuNP-F及AuNP-R， 4'C保藏备用；
(3) PCR:以入DNA为模板，采用制得的引物AuNP-F及AuNP-R进行 PCR。 PCR反应体系dNTPs (购自上海生工)1^L， 0.5个单位的TaqDNA聚 合酶(购自上海生工)，入DNA模板质粒(购自宝生物工程有限公司)0.5 ^L， 反应缓冲液(购自上海生工)5 ixL，取AuNP-F 3 jiL和AuNP-R 3 |uL，加灭菌 水至总体积为50 |uL;
扩增程序为94°C预变性3min; 94'C变性30s， 55'C退火30s， 72'C延伸 30 s， 40个循环；72'C再延伸3min; l(TC保存，得PCR产物；
(4) 琼脂糖电泳取5pLPCR产物，用3%琼脂糖凝胶电泳进行分析，采 用前染，即在溶胶前期加入溴化乙啶(EB)，浓度约为0.5|Lig/mL，电压U=120V， 时间T:30min，进行电泳；
(5) TEM电镜扫描 将得到的PCR产物用移液枪滴加到铜网上，置于灯下烘干半小时，上TEM 电镜，找到合适的结构与放大倍数并拍照。
图l 15nm金的TEM图。 图2胶体金与上下游引物的连接的电泳图。 图3 PCR产物的电泳图。 图4 PCR产物的TEM图。
具体实施例方式
(1)胶体金的制备 所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，烘箱烘干备用。制备时，向洁 净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01%的氯金酸和洁净的搅拌子，中速 搅拌，加热至沸腾，保持5 6分钟，紧接着一次性加入质量浓度为1%的柠檬 酸三钠溶液4mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深 蓝黑色最后变成酒红色，当颜色不再变化后再继续加热15分钟使反应充分完全。 最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到100mL， 4。C保藏。 (2)胶体金与上下游引物的偶联 所用上、下游引物为 297bp-F: 5,-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC画3，， 297bp國R: 5'-GGCATAGCGTCCTCACATTTC國3'， 将所制得的胶体金11500 rpm离心15min，弃上清，灭菌水恢复至原体积的 1/10，将上下游引物浓度稀释至10um，以胶体金上下游引物(R或F)体积 比l:l的比例分别混合，超声10s左右，使之混合均匀，室温静置12h，向其 中加入lM的NaCl，最后体系中的NaCl浓度达到0.05M，继续室温静置12h， 反应完毕，先用6500rpm离心15min，弃上清，然后加磷酸盐缓冲溶液(含O.l mol/LNaClpH7.0)离心清洗。用上述多次清洗的方法除去未连接在金纳米粒子 界面上的引物。最后用灭菌水中定容至胶体金的体积待用。将引物连接在纳米 粒子表面，构成金纳米粒子-引物复合物，即AuNP-F及AuNP-R， 4"C保藏备用。 (3) PCR:以ADNA为模板，采用制得的引物AuNP-F及AuNP-R进行
PCR。
PCR反应体系包括lpL dNTPs， 0.5个单位的Taq DNA聚合酶，0.5 |liL入DNA 模板质粒，5 |uL反应缓冲液，取AuNP-F 3 pL和AuNP-R 3 pL，最后加灭菌水 至总体积为50 pL。
扩增程序为94°C预变性3min; 94°C变性30 s, 55°C退火30 s， 72°C延 伸30s， 40个循环；72°C再延伸3min。 l(TC保存。
(4) 琼脂糖电泳
取5pLPCR产物，用3%琼脂糖凝胶电泳进行分析。釆用前染，即在溶胶 前期加入EB，浓度约为0.5ug/mL,电压U-120V，时间T=30min。进行电泳。
(5) TEM电镜扫描 将得到的PCR产物用移液枪滴加到铜网上，置于灯下烘干，约半小时左右，
上TEM电镜，找到合适的结构与放大倍数并拍照。
权利要求
1.一种纳米金和λDNA链连接的自组装材料的制备方法，其特征是步骤为(1)胶体金的制备；(2)胶体金与上下游引物的偶联；(3)利用所制得的连金引物进行PCR，PCR产物进行琼脂糖电泳和TEM电镜扫描证明得到预期产物；(1)胶体金的制备利用Frens法制备15nm的胶体金；所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，烘箱烘干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸和洁净的搅拌子搅拌，加热至沸腾，保持5～6分钟，紧接着一次性加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液4mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色，最后变成酒红色，当颜色不再变化后再继续加热15分钟使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到100mL，4℃保藏；(2)胶体金与上、下游引物的偶联将所制备的胶体金与引物F、R分别进行连接，得金纳米粒子-引物复合物，即AuNP-F及AuNP-R，处理后备用；所用上、下游引物为297bp-F5’-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC-3’，297bp-R5’-GGCATAGCGTCCTCACATTTC-3’，将所制得的胶体金于11500rpm离心15min，弃上清，用灭菌水恢复至原体积的1/10，将上、下游引物浓度稀释至10um，以胶体金∶上下游引物R或F体积比1∶1的比例分别混合，超声10s，使之混合均匀，室温静置12h，向其中加入1M的NaCl，使体系中的NaCl浓度达到0.05M，继续室温静置12h，反应完毕，先用6500rpm离心15min，弃上清，然后加含0.1mol/L NaCl pH7.0的磷酸盐缓冲溶液离心清洗，重复清洗多次除去未连接在金纳米粒子界面上的引物，最后用灭菌水定容至胶体金的体积待用，将引物连接在金纳米粒子表面，构成金纳米粒子-引物复合物，即AuNP-F及AuNP-R，4℃保藏备用；(3)PCR以λDNA为模板，采用制得的引物AuNP-F及AuNP-R进行PCR；PCR反应体系dNTPs1μL，0.5个单位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，反应缓冲液5μL，取AuNP-F3μL和AuNP-R3μL，加灭菌水至总体积为50μL；扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃再延伸3min；10℃保存，得PCR产物；(4)琼脂糖电泳取5μL PCR产物，用3％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入溴化乙啶，浓度为0.5μg/mL，电压U＝120V，时间T＝30min，进行电泳；(5)TEM电镜扫描。
全文摘要
一种纳米金和λDNA链连接的自组装材料的制备方法，属于材料化学技术领域。本发明主要内容是在金纳米粒子界面上的PCR，步骤为(1)胶体金的制备；(2)胶体金与上下游引物的偶联；(3)利用所制得的连金引物进行PCR，产物进行琼脂糖电泳和TEM电镜扫描证明得到预期产物；首先制备出所需粒径的AuNPs，与经过-SH修饰的上、下游引物分别进行连接，构成金纳米粒子-引物复合物，再以λDNA为模板，利用制得的金纳米粒子-引物复合物进行PCR，得到AuNPs和λDNA链连接的自组装材料。由于DNA结构高温解链低温复性和碱基互补配对的性质，使得这种新型纳米材料成为一种具有温度可控性的自组装材料，在诸多领域有应用潜力。
文档编号B22F9/16GK101368198SQ20081015672
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者刘丽强, 哲 李, 杜静洁, 胥传来, 许定花, 爱 边, 伟 陈 申请人:江南大学