精子芯片的制作方法
【专利摘要】提供一种制备高通量男性不孕相关的人类精子芯片的技术和方法。收集5例已婚已育男性自愿捐精者、以及60例临床诊断为男性不孕（排除输精管阻塞等非精子缺陷因素）患者自愿捐精者的精液，待精液自然液化后收集固定精子细胞、脱水透明、浸蜡。利用组织芯片仪制备精子石蜡芯、精子石蜡块阵列，石蜡切片制备精子芯片。结合免疫组化、分子原位杂交等实验分子研究技术，所制备的精子芯片可用于导致人类男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
【专利说明】精子芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于生物芯片领域，涉及一种用于制备微阵列精子芯片的生物芯片及制备方法。
【背景技术】
[0002]生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的高通量微阵列。利用高通量生物芯片，通过特异性分子杂交及染色技术，对受检样本进行检测，可准确、快速获取大量的分子检测信息。目前已广泛应用于生命科学研究、临床医学分子诊断、以及生物抗体靶向药物筛查和验证等领域。
[0003]人类精子是承载人类繁衍生息重任的男性生殖细胞，本质上属于单细胞生物体。人类精子基因或功能缺陷是不孕症的直接原因之一。一项研究不孕的临床荟萃分析(超过20个研究小组)发现，由于男性精子/精液异常导致不孕者，占二位，25%。其他原因诊断依次为:排卵障碍27%、输卵管异常22%、不明原因的不孕17%、子宫内膜异位症5%、其他如免疫学不孕4%。
[0004]作为生物芯片家族成员之一，目前尚没有人类精子芯片制备技术及应用的产品、专利及文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种制备高通量男性不孕相关的人类精子芯片的技术和方法。所制备的精子芯片可用于导致人类男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
[0006]本发明通过以下技术方案实现发明目的。收集5例已婚已育男性自愿捐精者、以及60例临床诊断为男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精液，待精液自然液化后收集固定精子细胞、脱水透明、浸蜡。利用组织芯片仪制备精子石蜡芯、精子石蜡块阵列，石蜡切片制备精子芯片。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是精子阵列空心石蜡块蜡模的示意图:其中，1:为5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蜡芯预留的石蜡孔；2:为60例男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蜡芯预留的石蜡孔。所有孔径为1mm，孔间距为1mm。
[0008]图2是精子阵列石蜡块的示意图:其中，1:为5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蜡芯柱；2:为60例男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蜡芯柱。精子石蜡芯柱直径为1_，精子石蜡芯柱间距为1_。
[0009]图3是精子芯片的示意图:其中，1:为5例已婚已育男性自愿捐精者的精子石蜡芯片，同时也可整体作为本精子芯片的定判断位点；2 --为60例男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精子石蜡芯片。精子石蜡芯片点直径为1_，精子石蜡芯片点间距为1mm。3:为精子芯片固相载体(粘附载玻片)上的磨沙标记区域。【具体实施方式】
[0010]实施例:在充分知情的基础上，自愿捐精者签署知情同意书。收集5例已婚已育男性自愿捐精者以及60例男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精者的精液，制备精子芯片。
[0011]1.1精液收集:收集5例已婚已育男性自愿捐精者以及60例男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者的精液约1ml。
[0012]1.2精子固定:待精液自然液化后加入10倍精液体积的精子固定溶液，充分混匀，室温固定I小时。
[0013]1.3脱水包埋:离心收集精子，中性PBS缓冲液洗涤精子2次。酒精梯度脱水后，脱脂透明，离心收集处理好的精子。将精子加入50ul预热融化的石蜡中，混匀。冷却固定成精子石蜡块。
[0014]1.4精子蜡芯:利用组织芯片制备仪石蜡芯取样器，钻取直径为1mm的精子蜡芯。
[0015]1.5受体蜡模:制备空白石蜡块，利用组织芯片制备仪定位钻取孔径为Iml的空心受体蜡模，如附图1。
[0016]1.6精子阵列:依照精子芯片的设计，将总共65例精子石蜡芯逐一安放到空心受体蜡模中相应的空白孔位点，以阵列表面齐平为基准，如附图2。
[0017]1.7阵列融合:将精子阵列置于干燥箱中，调节干燥箱温度与时间，确保所有精子石蜡芯与受体蜡模充分融合且精子石蜡芯不移位变形。
[0018]1.8石蜡切片:利用石蜡切片机切片制作石蜡切片，片厚4um。将石蜡切片平铺与粘附载玻片上，如附图3。在载玻片标记区`域作好标记。
[0019]1.9精子芯片制作完毕。结合免疫组化、分子原位杂交等实验分子研究技术，所制备的精子芯片可用于导致人类男性不孕的精子基因或功能缺陷等的研究。
【权利要求】
1.一种精子芯片的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 第一步，精液收集。收集已婚已育男性自愿捐精者以及男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精的精液约lrnl。 第二步，精子固定。待精液自然液化后加入10倍精液体积的精子固定溶液，充分混匀，室温固定I小时。 第三步，脱水包埋。离心收集精子，中性PBS缓冲液洗涤精子2次。酒精梯度脱水后，脱脂透明，离心收集处理好的精子。将精子加入50ul预热融化的石蜡中，混匀。冷却固定成精子石蜡块。 第四步，精子蜡芯。利用组织芯片制备仪石蜡芯取样器，钻取直径为1mm的精子蜡芯。 第五步，受体蜡模。制备空白石蜡块，利用组织芯片制备仪定位钻取孔径为1mm的空心受体蜡模，小阵列内孔间距为1mm。 第六步，精子阵列。依照精子芯片的设计，将精子石蜡芯逐一安放到空心受体蜡模中相应的空白孔位点，以阵列表面齐平为基准。 第七步，阵列融合。将精子阵列置于干燥箱中，调节干燥箱温度与时间，确保所有精子石蜡芯与受体蜡模充分融合且精子石蜡芯不移位变形。 第八步，石蜡切片。利用石蜡切片机切片制作石蜡切片，片厚4um。将石蜡切片平铺与粘附载玻片上。在载玻片标记区域作好标记。
2.根据权利要求1所述的一种人类精子芯片的制备方法，其特征在于:所述精子芯片包含已婚已育男性自愿捐`精者以及男性不孕(排除输精管阻塞等非精子缺陷因素)患者自愿捐精的精子。
3.根据权利要求1所述的一种人类精子芯片的制备方法，其特征在于:精子经过脱水包埋处理后，直接用于精子石蜡芯的制备。
4.根据权利要求1所述的一种人类精子芯片的制备方法，其特征在于:精子芯片为矩形阵列组成，精子石蜡芯片点直径为(但不限于)1mm，也可为1.5mm、或2mm等不同规格，精子石蜡芯片点间距为(但不限于)1mm。
5.根据权利要求1所述的一种人类精子芯片的制备方法，其特征在于:以已婚已育男性自愿捐精者的精子作为阳性对照，同时也可作为该张精子芯片的定位判断点。
【文档编号】C40B50/06GK103866402SQ201210533770
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2012年12月12日
【发明者】郜恒骏, 张可浩, 张新, 朱华玉, 张明飞, 马小慧, 颜虹 申请人:泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司