一种异养嗜酸菌及利用该菌抑制矿山酸性废水产生的方法
【专利摘要】本发明提供一种异养嗜酸菌，菌种名称为脂环酸杆菌Alicyclobacillus?sp.，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日为：2012年12月26日，保藏登记号为：CGMCC?No.7038。该菌可在酸性环境下生长，利用该菌及外加碳源，可还原环境体系中的三价铁离子并降低环境电位，减少体系硫化矿溶出，从而得以抑制矿山酸性废水产生。
【专利说明】一种异养嗜酸菌及利用该菌抑制矿山酸性废水产生的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】。特别是涉及一种Alicyclobacillus属细菌、其培养方法以及利用该菌抑制矿山酸性废水产生的方法。
【背景技术】
[0002]在中性甚至碱性环境中，只要黄铁矿暴露在空气中或含溶解氧的地下水与矿石接触，矿石就会缓慢氧化产生二价铁离子。此时，由于pH较高，二价铁离子可迅速氧化成为三价铁离子，而三价铁离子的存在，会加速黄铁矿的氧化过程，并使PH迅速下降，当pH进一步下降至3.5以下，在微生物的催化作用下，会进一步源源不断地产生三价铁离子，并使得黄铁矿等硫化矿的氧化速率进一步提高。因此，三价铁离子是氧化硫化矿产生矿山酸性废水的关键因素，抑制三价铁离子的产生，可以降低环境电位并减少矿山酸性废水的产生。
【发明内容】
[0003]本发明的第一个目的是提供一株高效的异养嗜酸细菌菌种，该菌种可显著降低黄铁矿的溶解率。
[0004]本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。
[0005]本发明的第三个目的是提供一种利用该菌及碳源减少硫化矿溶解的方法。
[0006]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
[0007]一种异养嗜酸菌，其特征在于，菌种名称为脂环酸杆菌Alicyclobacillus sp.，保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日为:2012年12月26日，保藏登记号为:CGMCC N0.7038。
[0008]如上所述的异养嗜酸菌是纯菌株，利用16S rDNA克隆文库技术鉴定该菌株表明，该菌株属于Alicyclobacillus属。
[0009]如上所述的异养嗜酸菌可利用碳源还原三价铁为二价铁，降低溶液电位并减少硫化矿溶解。
[0010]用于富集、分离培养如上所述异养嗜酸菌的培养基，其特征在于，取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L，调pH至3.0。
[0011]如上所述异养嗜酸菌的富集、分离培养方法，其特征在于，将所述异养嗜酸菌菌种接种入如上所述的培养基中，在40-50°C的培养温度下，摇床培养。
[0012]一种利用如上所述异养嗜酸菌抑制矿山酸性废水产生的方法，其特征在于，将所述异养嗜酸菌的菌种，采用如上所述的方法进行富集培养后，接种至废弃硫化矿山。
[0013]如上所述的方法，优选地，所述菌种接种至废弃硫化矿山的接种量为每Hi3面积2 ~4L。
[0014]如上所述的方法，更优选地，所述菌种接种至废弃硫化矿山的接种量为每m3面积约3L。[0015]如上所述的方法，优选地，在接种所述菌种后，若所述废弃硫化矿山的环境pH降低0.5，则继续补加培养基，补加量为每m3面积2~4L。
[0016]如上所述的方法，更优选地，补加培养基的补加量为每m3面积约3L。
[0017]如上所述异养嗜酸菌的获得方法为:
[0018](I)按照如上所述的菌种富集分离培养基配方配制培养基，调pH为3.0,121°C下灭菌25分钟，之后每IOOmL培养基倒一块平板。
[0019](2)将IOOmL含所述异养嗜酸菌的水样加入0.3g酵母粉，在45°C下轻轻震荡富集培养I周。通过测量细菌培养液在600nm处的吸光值判断细菌生长情况，当测得的0D600的数值在0.6-0.8之间时，即可进行下一步操作。
[0020](3)将富集的异养嗜酸菌涂布于上述培养基平板，并挑单菌落进行进一步平板划线。分离出的单菌落采用下面(4) (5)所述方法进行进一步鉴定。
[0021](4)纯化后的细菌利用扫描电镜进行菌种形态观察。
[0022](5)采用16S rDNA克隆文库技术对分离纯菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌株属于 Alicyclobacillus 属。
[0023]本发明的有益效果在于:
[0024]本发明提供了一株菌株Alicyclobacillus sp.，该菌可在酸性环境下生长，利用该菌及外加碳源，可还原环境体系中的三价铁离子并降低环境电位，减少体系硫化矿溶出，从而得以抑制矿山酸性废水产生。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明菌种的扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0026]以下通过实施例对本发明作进一步说明。
[0027]本发明所涉及的异养嗜酸菌已进行保藏，菌种名称为脂环酸杆菌Alicyclobacillus sp.,保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日为:2012年12月26日，保藏登记号为:CGMCC N0.7038。
[0028]本发明所述异养嗜酸菌的培养方法如下:
[0029]首先配制富集培养异养嗜酸菌菌的培养基:称取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、
0.25g NaCl和1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L。调pH为3.0,121°C下灭菌25分钟,之后每IOOmL培养基倒一块平板。
[0030]本发明所获得的含异样嗜酸菌的水样，是取自福建紫金山铜矿含铜酸性废水与江西德兴铜矿含铜酸性废水混合样。将IOOmL水样加入0.3g酵母粉，在45°C轻轻震荡培养I周。通过测量细菌培养液在600nm处的吸光值判断细菌生长情况，当测得的0D600的数值在0.6-0.8之间时，进行下一步操作。采用膜过滤将上述培养液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5%的接种量分别接种于多个IOOmL培养基中，45°C度进行培养，并设置不接种对照(CK)。IOOrpm培养两周后观察细菌生长情况。将培养液梯度稀释成培养基
1、2、3、4、5(10' 10-2，10-3，1θΛ 10-5)，分别取100 μ L稀释液涂平板，45°C下培养三天。得到单菌落。
[0031]用扫描电镜观察菌体形态，菌体形态如图1所示。
[0032]用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将ImL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T_easy载体连接，转化大肠杆菌DH5 α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株系Alicyclobacillus 属细菌。
[0033] 用两个300mL烧瓶分别装入150mL矿山酸性废水及15g黄铁矿，其中一个烧瓶中接入异养嗜酸菌Alicyclobacillus sp.,另一个为空白对照。摇床培养30天测试黄铁矿溶出率，结果发现接种Alicyclobacillus sp.A细菌的烧瓶比起空白对照烧瓶，黄铁矿溶出率降低20%，电位降低10%，三价铁离子浓度低14%。证明本发明菌种确实具有还原环境体系中的三价铁离子、降低环境电位、减少体系硫化矿溶出的功能。
【权利要求】
1.一种异养嗜酸菌，其特征在于，菌种名称为脂环酸杆菌Alicyclobacillus sp.,保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日为:2012年12月26日，保藏登记号为:CGMCC N0.7038。
2.用于富集、分离培养如权利要求1所述异养嗜酸菌的培养基，其特征在于，取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸馏水，混匀后添加结冷胶30g/L，调pH至3.0。
3.权利要求1所述异养嗜酸菌的富集、分离培养方法，其特征在于，将所述异养嗜酸菌菌种接种入如权利要求2所述的培养基中，在40-50°C的培养温度下，摇床培养。
4.一种利用权利要求1所述异养嗜酸菌抑制矿山酸性废水产生的方法，其特征在于，将权利要求1所述异养嗜酸菌的菌种，采用如权利要求3所述的方法进行富集培养后，接种至废弃硫化矿山。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌种接种至废弃硫化矿山的接种量为每m3面积2~4L。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌种接种至废弃硫化矿山的接种量为每m3面积3L。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在接种所述菌种后，若所述废弃硫化矿山的环境PH降低0.5，则继续补加培养基，补加量为每m3面积2~4L。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在接种所述菌种后，若所述废弃硫化矿山的环境PH降低0.5，则继续补加培养基，补加量为每m3面积3L。
【文档编号】C22B3/18GK103898001SQ201210584735
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】刘兴宇, 陈勃伟, 温建康, 张跃红 申请人:北京有色金属研究总院