一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素m1纳米抗体2014afm-g2的制作方法
【专利摘要】本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2。所述黄曲霉毒素纳米抗体基因库是通过提取免疫黄曲霉毒素M1完全抗原后的羊驼血液中的RNA，并采用反转录PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区基因得到黄曲霉毒素纳米抗体VHH基因，然后与pCANTAB5E（his）载体连接后转化得到。本发明筛选得到的黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2具有耐有机试剂、耐高温、耐酸碱等特点，稳定性好；对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50为0.208ng/mL；与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2交叉反应率分别为9.43%、5.93%、4.87%和6.17%。
【专利说明】一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2
【技术领域】
[0001]本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素Ml纳米抗体 2014AFM-G2。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的剧毒代谢产物，是迄今发现的最强致癌物质之一。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素BI (AFB1),
等。其中黄曲霉毒素BI的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素Ml (AFM1)是AFBl的羟基化代谢产物，哺乳动物摄入AFBl污染的饲料后，在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常当动物摄入了 AFBl污染的食物后，黄曲霉毒素Ml的排出量为AFBl摄入量的1%~3%。大量的研究者对黄曲霉毒素Ml的毒性和致癌性进行了深入的研究，研究结果也促使国际癌症研究机构将黄曲霉毒素Ml的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。黄曲霉毒素Ml性质稳定，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有黄曲霉毒素M1，由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源，因此黄曲霉毒素Ml污染问题引起了世界各国的广泛关注，并对黄曲霉毒素Ml进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素Ml的检测、特别是速测，及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
[0003]现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。免疫分析是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应，以抗原和抗体作为生化反应物对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析，具有灵敏、快速和操作简单的优点。要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制备抗黄曲霉毒素的抗体。
[0004] 免疫分析需要高质量的抗体，随着抗体技术的发展，重组抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉，对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。纳米抗体是采用分子生物学手段，获得骆驼科动物体内的天然重链抗体可变区片段，并能与抗原特异性结合。与传统的重组抗体(如单链抗体)相比，纳米抗体具有体积小、稳定性好、耐高温、耐有机试剂、耐酸碱等优点。目前，尚没有针对黄曲霉毒素Ml的纳米抗体的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是提供一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2。
[0006]为实现本发明目的，本发明采用如下技术方案:
黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于:提取经黄曲霉毒素Ml完全抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E (his)载体连接后转化得到。
[0007]上述方案中，所述pCANTAB 5E (his)载体是通过如下方法构建得到:以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物:p5E Sfi1-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(Sfi I);下游引物:p5E N-P-H-R: 5，- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGG CCGCCCGTTTTC-3，PCR 扩增PCANTAB5E载体质粒上Sf i I到NotI之间的DNA片段，并在Not I酶切位点后引入六聚组氨酸标签，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做Psp0MI单酶切，得p5E-his (Sfil/PspoMI)粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做NotI单酶切，得p5E (Sfil/Notl)粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI)粘性末端和p5E(SfiI/Notl)粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E (his)载体。
[0008]黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，具体操作方法如下:对羊驼免疫黄曲霉毒素Ml完全抗原，提取经免疫后羊骑血液中的RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E (his)载体连接后转化，构建黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
[0009]上述方案中，所述特异性引物的末端需包含根据pCANTAB 5E (his)载体克隆位点附近序列设计的在VHH基因两端分别引入载体pCANTAB 5E (his)同源序列的引物序列，每条特异性引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E (his)同源位点，以在VHH基因两端各引入至少15b p的载体pCANTAB 5E (his)同源序列；所述特异性引物为:
Rl:5’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG _3’
F: 5 ’ -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3，；或
R2:5’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ ；
F:5’ -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中檑线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E (his)同源的位点。
[0010]上述方案中，所述PCR扩增的反应体系为:
10 X Ex taq Buffer5 μl
50mM MgSO42 μ l
10 mM dNTP1μ l
10 mM F 引物1 μ l
10 mM Rl引物(或R2引物)1μlEx taq DNA 聚合酶0.4μ l
cDNA 模板2 μ l
ddH20补至总体系50μl;
所述PCR扩增的程序为:
940C 2min ；
94°C 30s, 55°C 30s, 68°C30 个循环；
68 °C 5min。
[0011]其中，以Rl为引物的PCR扩增反应次数:以R2为引物的PCR扩增反应次数为2:3。
[0012]上述方案中，所述VHH基因与pCANTAB 5 E (his)载体的连接方法为^fpCANTAB5 E(his)载体经Sfi I /Not I双酶切处理，然后与VHH基因进行In-fusion连接；所述的转化为:将前述连接产物加入到大肠杆菌TGl电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件:0.1 cm电转化杯，1.8 kV，200 Ω，25 μ F，电转化后立即在电转化杯中加入2YT液体培养基吹打后转移，37°C缓慢振摇复苏I h。
[0013]上述黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素Ml纳米抗体的应用。
[0014]上述方案中，所述的噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素Ml纳米抗体具体通过如下技术方案实现:将构建成功的黄曲霉毒素纳米抗体基因库通过M13K07辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与黄曲霉毒素Ml特异性结合而不和载体蛋白BSA结合的阳性孔，然后采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择灵敏度较高的克隆，最终筛选获得噬菌体展示的黄曲霉毒素Ml纳米抗体。
[0015]黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，编码基因序列如SEQ ID N0:8所示。其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为:⑶Rl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为ADRl的编码基因序列如SEQID N0:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID N0:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ IDNO:6所示。
[0016]上述黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2在ELISA检测黄曲霉毒素Ml方面的应用。
[0017]本发明的有益效果在于:
(1)本发明所述黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法简单；筛选得到的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2具有耐有机试剂、耐高温、耐酸碱等特性，稳定性好；
(2)本发明提供的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC50为0.208 1^/1^，与黄曲霉毒素則，82，61，62的交叉反应率分别为9.43%,5.93%、
4.87% 和 6.17% ；
(3)本发明提供的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2可应用于对黄曲霉毒素Ml的ELLSA检测，能有效降低样品提取液中有机试剂等其他成分的干扰，从而提高检测准确度。
[0018](4)本发明提供的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2为原核生物大肠杆菌表达，因此，能有效降低抗体生产成本。【具体实施方式】
[0019]实施例1:黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建 1.动物免疫
购买2岁龄的雄性羊骑一只，免疫黄曲霉毒素Ml完全抗原(AFM1-BSA, Sigma公司)。将20(^g黄曲霉毒素Ml完全抗原与弗式不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射。间隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选取效价最高的一次免疫后，取血10mL，提取总RNA。
[0020]2.cDNA文库的构建
(I)提取总RNA:选取羊驼血清效价最高的一次免疫，免疫后7-10天，对羊驼进行静脉取血IOmL,提取总RNA:采用Life Technology公司的LeukoLOCK总RNA分离试剂盒提取羊驼血液中的总RNA。
[0021](2)合成cDNA:以步骤I获得的总RNA为模板，oligo (dT) 15为引物，按照Promega公司的反转录酶说明书进行反转录,合成cDNA第一链,获得cDNA文库。
[0022]3.黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建
(I)以步骤2中合成的cDNA为模板，RU F或R2、F为引物，进行PCR扩增得到羊驼重链抗体可变区基因，即 VHH 基因:取 cDNA 2 μ 1，IOXPCR Buffer 5 μ IjMgSO4 (50mM)2y I,dNTP (1OmmoI/L) I μ 1，F 引物(10 μ mol/L) I μ 1，Rl (或 R2)引物(10ymol/L)ly 1，DNA酶0.1 μ 1，无菌纯水37.9μ I至50μ 1，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为:94°C变性2min后；94°C变性30s，55°C退火30s，68°C延伸lmin，30个循环；68°C延伸5min。
[0023]Rl: 5 ’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3，
R2:5’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ ；
F: 5’ -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中檑线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E (his)同源的位点；以Rl、F为引物进行4个PCR扩增反应，以R2、F为引物进行6个PCR扩增反应。PCR产物经过0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收450bp大小的DNA片段。
[0024](2) pCANTAB 5E (his)载体构建:以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物:p5E Sfi1-F: 5’ -ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’ (SfiI);下游引物:p5E N-P-H-R: 5’ - GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTTTTC-3’ PCR 扩增 pCANTAB5E 载体质粒上 Sfi I到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E_his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his (Sfil/PspoMI)粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E (Sfil/Notl)粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI)粘性末端和p5E (SfiI/Notl)粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E (his)载体。
[0025](3)双酶切处理 pCANTAB 5 E (his):
Sfi I单酶切:
按照如下体系配制反应液:pCANTAB 5 E (his) vector 30 μ I Sfi II μ I
IOXM Buffer10 μ IddH20补至总体系100 μ I
50°C水浴2 h后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。
[0026]Not I 酶切:
按照如下体系配制反应液:
pCANTAB 5 E (his) Sfi I 单酶切回收产物 30 μ I Not II μ I
IOXH Buffer10 μ I ddH20补至总体系100 μ I
37°C水浴4 h后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收；
(4) VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5 E (his)载体的连接 按照如下体系进行In-Fusion连接:
Sfi I /Not I 双酶切处理的 pCANTAB 5 E (his) vector 120ng VHH 基因40ng
5 XIn-Fusion buffer2 μ I
In-Fusion EnzymeI μ I
ddH20补至总体系10 μ I
37°C水浴15min后，放入50°C水浴15min，水浴后立即放在冰上5min，加入40 μ I TE缓冲液，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收，_20°C保存待用。
[0027](5)连接产物的电转化
将上述连接产物取5μ I加入到50μ I疋coli TGl电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的0.1 Cm电转化杯(Bio-RAD)中，冰上放置IOmin,然后放在Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件:1.8 kV，200 Ω，25 μ F，电转化后立即在电转化杯中加入I mL2YT液体培养基吹打后转移至一灭菌后的干净15 mL摇菌管中，37°C缓慢振摇复苏I h。取2μ I菌液倍比稀释后涂布于LB氨苄平板上，37°C倒置过夜，第二天数菌落个数计算库容量。
[0028](6)黄曲霉毒素纳米抗体基因库的拯救:共进行十次上述的电转化，将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37°C 250rpm振摇至0D_值为0.5时，加入lmL，I X IO12Pfu的辅助噬菌体M13K07，37°C静置Ih后，继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70 μ g/mL,并振摇过夜。次日，将过夜菌于4°C 1000Orpm离心15min,将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/4体积的5x PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4°C 12000rpm离心20min,用IOmL无菌的重悬溶液(含IX蛋白酶抑制剂，0.02%似乂和0.5% BSA的PBS缓冲液)溶解沉淀得到拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
[0029]实施例2:黄曲霉毒素Ml纳米抗体的筛选以及序列测定 1.黄曲霉毒素Ml纳米抗体的淘选
用AFM1-BSA (I μ g/孔)及3%的BSA-PBS溶液(用作阴性对照)分别包被ELISA板，4°C过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3%脱脂奶粉封闭I h ;PBST洗板3次，在包被有AFM1-BSA的孔中加入上述拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库50 μ 1，37°C孵育I h ；PBST洗板10次后，每孔加入100 μ I U00ng/mL AFM1溶液，室温(20°C~30°C )震荡30min洗脱。将洗脱液转至包被有3%BSA-PBS溶液的孔中，37°C孵育Ih (去除非特异性吸附);孵育后，取上清侵染2mL生长至对数期的TGl菌液，37°C侵染20min，取I μ I UO μ I分别涂布LB氨苄平板上，并于37°C培养箱中静置过夜，次日数平板上的菌落数确定洗脱液中噬菌体滴度。另将上述剩余的被侵染后的TGl菌液转入6mLSB培养基中，加100mg/mL的氨苄青霉素1.5μ 1，37°C振摇lh，补加氨苄青霉素至终浓度为50 μ g/mL，继续振摇Ih后，加入ImL辅助噬菌体M13K07 (I X 1012pfu/mL), 37°C静置30min,转入IOOmL SB培养基，补加氨节青霉素(100mg/mL)46 μ I,继续振摇2h后,加入卡那霉素至终浓度为70 μ g/mL,并于37°C振摇过夜。次日，将菌液于1000Orpm 4°C离心15min，转移上清，并加入1/4体积5xPEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm 4°C离心20min，用1%BSA_PBS溶液溶解沉淀，得到第一轮淘选扩增产物，并用于下一轮淘选。在随后几轮的淘选中，包被抗原AFM1-BSA的浓度分别为 0.5 μ g/ 孔、0.1yg/ 孔、0.05 μ g/ 孔,洗脱液分别为 500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL 的AFM1溶液。
[0030]2.阳性克隆的鉴定:
经过4轮淘选后，取2 μ I洗脱液倍比稀释后侵染生长至对数期的TGl菌液，涂布LB氨苄平板上，37°C倒置过夜。次日，随机挑取30个克隆分别于3mL SB-氨苄培养基中，37°C震荡培养6-8h，至OD600为0.6左右，加入30 μ I辅助噬菌体Μ13Κ07 (I X 1012pfu/mL), 37。。静置30min后继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70 μ g/mL,并震荡培养过夜；次日，将菌液于1000Orpm 4°C离心15min后,得到菌液上清。
[0031]用包被液配制AFM1-BSA至终浓度0.2 μ g/ml，包被96孔ELISA板，每孔100 μ 1，同时另取ELISA板，其中的32个孔用3%BSA包被，4°C包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3%脱脂奶粉-PBS封闭I h ;取AFM1标准品储存液，用10%甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL的工作液，分别加入到包被有AFM1-BSA抗原的孔中，再每孔加入50 μ I上述菌液上清，每种工作液浓度重复3次；在包被有BSA的孔中加入10%甲醇/PBS和50 μ I上述菌液上清作为对照，轻摇板子混匀后，置37°C温箱反应I h;PBST洗板10次后，每孔加入100 ul用PBS按I:5000比例稀释的HRP/ANT1-M13, 37°C保温I h ；PBST洗板6次，每孔加入100 μ I新鲜配制的TMB底物溶液，37°C保温15 min ;加2mol/L H2SO4,每孔50 μ I中止反应，用酶标仪分别测定OD45tl值；对BSA不吸附，对AFM1-BSA有吸附，并且加入黄曲霉毒素后存在竞争的即为阳性噬菌体克隆，由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，得到噬菌体展示的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2。
[0032]3.黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的特性及测序分析结果如下:
采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下:将AFMkAFBp AFB2、AFG1和AFG2五种不同标准品储存液，用10%甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50%时的标准品浓度，用IC5tl表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率:交叉反应率(％)= (AFM1IC50/类似物IC5tl) X 100%，所述类似物为AFBk AFB2、AFG1或AFG2,得到黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2对于对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为0.208 ng/mL，与黄曲霉毒素BI，B2，G1，G2的交叉反应率分别为9.43%,5.93%,4.87%和6.17%。因此，黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2是一种抗黄曲霉毒素Ml的特异性纳米抗体。经耐受性试验,黄曲霉毒素纳米抗体2014AFM-G2比常规鼠源与兔源抗体耐有机溶剂能力提高35%，耐高温能力提高45%，因此能有效降低检测时样品提取液中有机溶剂等其他成分的干扰，从而提高检测灵敏度。
[0033]同时将筛选到的含有黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物Rl:5’-CCA TGA TTA CGCCAA GCT TTG GAG CC-3’。得到黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的氨基酸序列为SEQID NO:7所示，编码基因序列为SEQ ID NO:8所示，其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为:CDRl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为:CDRl的编码基因序列如SEQ ID N0:4所示、⑶R2的编码基因序列如SEQ ID N0:5所示，⑶R3的编码基因序列如SEQ ID N0:6所示。
[0034]实施例3:黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的制备
Cl)获得能分泌黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的TGl菌液，使用Qiagen的DNA小量提取试剂盒提取质粒，转化到HB2151感受态细胞中，并涂布到LB氨苄平板上；
(2)挑取含有黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2质粒的HB2151菌落于IOOmLSB氨苄液体培养基中，250印111，371:培养至00600 = 0.5-0.8，加入20(^1 0.5M IPTG溶液诱导过夜。
[0035](3) 4°C, 10 000 rpm,冷冻离心15 min,无菌操作台中小心去除上清,菌体沉淀采用渗透休克法进行可溶性蛋白提取，得到上清蛋白。将上清蛋白过0.22Mm滤膜后，用平衡缓冲液(50mM磷酸盐， 300mM氯化钠，20mM咪唑；pH 7.4)透析过夜。
[0036](4)采用His60镍柱(Clontech Technology)纯化抗体:首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤(3)中透析后的上清蛋白进样His60镍柱(ClontechTechnology)进行抗体纯化,用10倍柱体积淋洗缓冲液(50mM磷酸盐,300mM氯化钠,40mM咪唑；pH 7.4)洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸盐，300mM氯化钠，300mM咪唑；pH 7.4)洗脱抗体2014AFM-G2，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M, pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析2-3天后浓缩，分装于-20°C保存备用。
[0037]实验例4:黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的应用 1.样品前处理:
量取10 mL牛奶装入50 mL离心管中在3500 g，4°C下离心10 min，将上层乳脂部分弃去，取中间部分直接用于间接竞争ELISA法检测(牛奶样品)。称取10 g奶粉准确溶于50°C预热纯水中，定容至IOOmL, 3500 g，4°C下离心10 min，将上层乳脂部分弃去，取中间部分直接用于间接竞争ELISA法检测(奶粉样品)。
[0038]2.间接竞争酶联免疫分析
用包被缓冲液配制0.25 Pg/mL AFM1-BSA溶液，加入ELISA微孔板中，100 μL7孔，4°C过夜。次日，PBST洗板三次后，用200 μL溶于PBS的1.5% OVA封闭微孔，37°C恒温箱反应lh。PBST洗板三次，每孔加入50 μL黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2 (0.9Pg/mL)和50 μL AFM1S准溶液或待测样品。37°C反应Ih后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL，用PBS按1:5000稀释的兔抗E tag酶标二抗，37°C反应I小时。PBST洗板六次后，每孔加入100μΙ新鲜配制的TMB底物溶液，37°C保温15 min;再加入50μL 2 M硫酸终止反应，立即用酶标仪在450nm下测定吸光值。根据样品测定的吸光值计算样品中AFM1的浓度，判断方法回收率。牛奶样品和奶粉样品的平均回收率分别为90.8%,87.9%，可满足黄曲霉毒素检测对方法准确度的需求。
[0039]综上，黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2能有效识别黄曲霉素Ml，可应用于黄曲霉毒素Ml的ELISA 检测等，对乳制品安全领域黄曲霉毒素Ml监控有重要意义。
【权利要求】
1.黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于:提取经黄曲霉毒素Ml完全抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用反转录PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E (his)载体连接后转化得到；所述pCANTAB 5E(his)载体是通过如下方法构建得到:以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物:p5ESfi1-F: - ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’ (SfiI);下游引物:p5E N-P-H-R: 5，- ATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTTTTC _3’PCR 扩增 pCANTAB5E 载体质粒上 Sf i I 到 NotI之间的DNA片段，并在Not I酶切位点后引入六聚组氨酸标签，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E_his (Sf il/PspoMI)粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得P5E(SfiI/NotI)粘性末端；最后将p5E-his (Sfil/PspoMI)粘性末端和p5E(SfiI/NotI)粘性末端连接后，得到pCANTAB5E (his)载体。
2.权利要求1所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于，具体操作步骤为:对羊§它免疫黄曲霉毒素Ml完全抗原,提取经免疫后羊骑血液中的RNA,反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E (his)载体连接后转化，构得黄曲霉毒素纳米抗体基因库。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述特异性引物的末端包含根据pCANTAB 5E (his)载体克隆位点附近序列设计的在VHH基因两端分别引入载体pCANTAB 5E (his)同源序列的引物序列，每条特异性引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E (his)同源位点，以在VHH基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E (his)同源序列，所述特异性引物为:
Rl:5’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG _3’
F:5， -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’ ； 或
R2:5’ -CGG CGC ACC TGC GGC CGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ ；
F: 5 ’ -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3，， 其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E (his)同源的位点。
4.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应体系为:
5.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述VHH基因与pCANTAB 5 E (his)载体的连接方法为:将pCANTAB 5 E (his)载体经Sfi I /Not I双酶切处理，然后与VHH基因进行In-fusion连接；所述的转化为:将前述连接产物加入到大肠杆菌TGl电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件:0.1 cm电转化杯，1.8 kV，200 Ω，25 μ F，电转化后立即在电转化杯中加入2ΥΤ液体培养基吹打后转移，37 °C缓慢振摇复苏I h。
6.权利要求1所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素Ml纳米抗体的应用。
7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素Ml纳米抗体的应用，其特征在于:它是将构建成功的黄曲霉毒素纳米抗体基因库通过M13K07辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与黄曲霉毒素Ml特异性结合而不与载体蛋白BSA结合的阳性孔，然后采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择灵敏度较高的克隆，最终筛选获得噬菌体展示的黄曲霉毒素Ml纳米抗体。
8.黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2，其特征在于，所述黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码基因序列如SEQ ID N0:8所示。
9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2，其特征在于，其三个互补决定区的氨基酸序列分别为=CDRl的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、⑶R3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为ADRl的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、⑶R2的编码基因序列如SEQID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。
10.权利要求8、所述的黄曲霉毒素Ml纳米抗体2014AFM-G2在ELISA检测黄曲霉毒素Ml方面的应用。
【文档编号】C40B50/06GK103898615SQ201410121773
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】李培武, 何婷, 张奇, 张兆威, 丁小霞 申请人:中国农业科学院油料作物研究所