专利名称：扩展的天然化学连接的制作方法
对相关申请的交叉引用本申请要求得益于2000年9月8日登记的美国临时申请60/231,339。致谢本发明部分地受国家卫生研究所博士后研究基金GN190402的支持。美国政府可以享有某些权利。
背景化学连接涉及在第一种化学组分和第二种化学组分之间形成一种选择性的共价键。可以使用存在于第一种组分和第二种组分上的独特的相互反应的官能团来使连接反应具有化学选择性。例如，肽和多肽的化学连接涉及带有相容的独特的相互反应的C-末端和N-末端的氨基酸残基的肽或多肽片断的化学选择性反应。已经有好几种化学方法被用于这种目的，其实例包括天然的化学连接(Dawson等人，Science(1994)266776-779；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434)、形成肟的化学连接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)，11630-34)、形成硫代酸酯的连接(Schnolzer，等人，Science(1992)256221-225)、形成硫醚的连接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、形成腙的连接(Gaertner等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)和形成噻唑烷的连接以及形成噁唑烷的连接(Zhang等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam等人，WO95/00846；US5,589,356)。
在这些方法中，只有天然的化学连接方法能够得到在连接位点处具有天然的酰胺键(即肽键)的连接产物。已经证明，最初的天然的化学连接方法(Dawson等人，supra；和WO96/34878)是一种在连接位点处产生天然的酰胺键的强有力的方法。天然的化学连接涉及具有C-末端α-羧基硫代酸酯部分的第一种肽或多肽片断与具有N-末端半胱氨酸残基的第二种肽或多肽之间的化学选择性反应。硫醇交换反应产生了最初的硫代酸酯连接的中间体，该中间体自发地发生重排，在连接位点处产生天然的酰胺键，同时把半胱氨酸侧链的硫醇再生出来。最初的天然的化学连接法的缺陷是它需要一个N-末端半胱氨酸，即它只允许在连接位点处含有半胱氨酸的肽和多肽片断的连接。
尽管有这种缺陷，但是仍然有含有除半胱氨酸之外的具有N-末端氨基酸的肽的天然化学连接的报道(WO98/28434)。在该方法中，使用含有一个C-末端α-羧基硫代酸酯的第一种肽或多肽片断与含有一个N-末端式HS-CH2-CH2-O-NH-[肽]所代表的N-{硫醇取代的辅助基团}的第二种肽或多肽片断进行连接。连接后，通过断裂HS-CH2-CH2-O-辅助基团而除去N-{硫醇取代的辅助基团}，在连接位点处产生天然的酰胺键。该方法的一个局限是使用巯基乙氧基辅助基团能够成功地只在甘氨酸残基处形成酰胺键。这产生了一种连接产物，该连接产物在断裂反应后，在第二种肽或多肽片断的N-取代的氨基酸的位置处产生一个甘氨酸残基。由于这个原因，只有当希望使反应的连接产物在该位置处含有一个甘氨酸残基时，实施该方法才是合适的，并且在任何情况下，就连接产率、母体的稳定性和除去O-连接的辅助基团的能力方面都是成问题的。然而可以使用其它辅助基团，例如HSCH2CH2NH-[肽]，而不会把反应限制在在甘氨酸残基处的连接上，这样的辅助基团不能从连接产物上除去。
因此，需要一种能够把天然的化学连接扩展到很多种不同的氨基酸残基、肽、多肽、聚合物和其它分子的广泛适用的和强有力的化学连接体系，该化学连接体系利用一种有效的容易除去的含有硫醇的辅助基团，而在连接位点处通过天然的酰胺键把这种分子连接起来。
连接产物是通过把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种下式的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或烷基硫醇的第二种组分HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III或HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中J2、R1、R2和R3如前面所定义，连接，然后选择性地从N-取代的酰胺键合的连接产物中除去C2或C3链烷基或芳基硫醇的方法来生产的。在一种优选的实施方式中，通过在与肽相容的断裂条件下在C1处形成一种共振稳定的阳离子而方便了这种断裂。
从N上除去烷基硫醇或芳基硫醇链，得到下式的最终的连接产物J1-C(O)-HN-J2 V其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定义。本发明还针对用于进行这种扩展的天然的化学连接的组合物和包含它们的药筒和试剂盒。该组合物包含一种完全受保护的、部分受保护的或完全未受保护的酸稳定的N-取代的，优选下式的Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇SX2-C2-C1(R1)-X1 N-CH(Z2)-C(O)-J2VI或SX2-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-X1N-CH(Z2)-C(O)-J2 VII其中X1是H或氨基保护基；X2是H或硫醇保护基；J2、R1、R2和R3如前面所定义；而Z2是与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分(包括但是不限于一种氨基酸侧链)。本发明还针对基本上不含外消旋体或非对映异构体的这些化合物的手性形式。
本发明还针对生产这种完全受保护的、部分受保护的或完全未受保护的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的溶液相和固相的方法。生产这些化合物的方法包括卤素介导的氨基烷基化、还原性氨基化和与固相肽合成法相容的Nα-保护的，N-烷基化的，S-保护的，氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体的制备。
羧基硫代酸酯组分的J1部分可以包括与羧基硫代酸酯和用于扩展的天然的化学连接的反应条件相容的任何化合物部分，而本发明的N-取代的组分可以被单独提供或者把它与很宽范围的化合物部分(包括氨基酸、肽、多肽、核酸或其它化合物部分例如染料、半抗原、糖、脂质、固体载体、生物相容性的聚合物或其它聚合物等)连接。本发明的扩展的天然的化学连接方法是强有力的，可以在一种水性体系中在接近中性的pH条件下在一定的温度范围条件下进行。本发明的生产N-取代的组分的方法也是强有力的，还在于它能以令人惊奇的高而纯的产率给这些新化合物提供很宽范围的合成路线。本发明的Nα-保护的，N-烷基化的，S-保护的，氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体特别可用于使用常规的肽合成和其它有机合成策略进行的快速自动合成中。而且本发明的受保护的N-取代的组分能把化学连接的用途扩展到多组分连接方案中，例如当多肽的生产涉及多种连接策略，例如三种或三种以上的片断连接方案或汇集连接合成方案时。例如，本发明的方法和组合物允许你使用第一对羧基硫代酸酯和N-取代的组分来合成所要分子的第一部分，使用其它对羧基硫代酸酯和N-取代的组分来合成分子的其它部分。然后可以把每个这样合成的连接产物连接起来(在合适的脱保护和/或改性之后)，形成所要的分子。
相应地，本发明的方法和组合物极大地扩大了天然化学连接的范围，并且本发明的原料、中间体和最终产物找到了广泛的用途。
硫醇交换发生在αCOSR硫代酸酯组分和氨基N-{烷基硫醇}组分之间。交换产生一种硫代酸酯键合的中间体连接产物，连接产物自发地发生重排，经过一种5元环中间体，产生一种在连接位点处含有一个可除去的Nα取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2的第一种连接产物。
在连接位点处的Nα取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去，产生一种在连接位点处含有天然的酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)CO-J2的最终的连接产物。
图2通过显示本发明的介导扩展的天然的肽化学连接的能力来详细说明说明本发明；可以使用同样的方案来进行任何合适的分子的连接。如图所示，含有一种式J1-HN-CH(Z1)-αCO-SR的α-羧基硫代酸酯的第一种组分和含有一种式HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-NHαCH(Z2)-C(O)-J2的酸稳定的Nα取代的C3链烷基或芳基硫醇的第二种组分。组分J1和J2可以是与化学选择性的连接反应相容的任何化合物部分，例如一种受保护的或未受保护的氨基酸、肽、多肽、其它聚合物、染料、连接体等。Z1是与αCO-SR硫代酸酯相容的任何侧链基团，例如受保护的或未受保护的氨基酸侧链。Z2是与Nα-取代的氨基酸相容的任何侧链基团，例如受保护的或未受保护的氨基酸侧链。当R1不是H时，R2和R3是H，而R1是未取代的或在C1的邻位或对位被一种给电子基团取代的苯基部分；吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)；甲基硫醇；或亚硫酰甲基。当R2和R3不是H时，R1是H，而R2和R3形成一个在C1的邻位或对位被一个给电子基团取代的苄基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)。
硫醇交换发生在COSR硫代酸酯组分和氨基氨基硫醇组分之间。交换产生一种硫代酸酯键合的中间体连接产物，连接产物自发地发生重排，经过一种6元环中间体，产生一种在连接位点处含有一个可除去的Nα取代的C3链烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的第一种连接产物。
在连接位点处的Nα-取代的C3链芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去，产生一种在连接位点处具有天然酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。
图3详细说明一种多组分的扩展的天然的化学连接方案。按照
图1中所具体描述的那样，使一种多肽α-羧基硫代酸酯与一种式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的Nα-保扩的N-末端多肽Nα-取代的C2链烷基或芳基硫醇与一种含有一个N-末端半胱氨酸残基的肽反应。R1是未取代的或者被一个给电子基团(优选在C1的邻位或对位)取代的苯基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)。保护基(PG1)可以是任何合适的保护基，例如一种烷基羰基保护基(例如苄氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Fmoc等)、一种三苯基甲基保护基(Trt)、一种2-硝基苯基亚磺酰基保护基(Nps)等。在第一步连接反应后除去保护基。
如图1中所示，第一步天然的化学连接反应在含有式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的Nα-保护的N-末端多肽Nα-取代的C2链烷基或芳基硫醇的多肽α-羧基硫代酸酯与N-末端Cys肽之间进行，产生一种式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)C(O)-肽2-肽3的第一步连接产物。然后除去保护基PG1，得到一种式HS-C2-C1(R1)-Nα(H)-CH(Z2)-C(O)-肽2-肽3的连接产物。然后使该物质与含硫代酸酯的第三种组分反应。在COSR硫代酸酯组分与氨基N-{烷基硫醇}组分之间发生硫醇交换。交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，后者自发地发生重排，经过一个5元环中间体，产生一种在第二个连接位点处含有可除去的Nα取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式 肽1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)肽2-Cys-肽3的第二步连接产物。在第二个连接位点处的Nα取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而产生一种在第一个和第二个连接位点处具有天然的酰胺键的式肽1-C(O)-NαH-CH(Z2)-C(O)肽2-Cys-肽3的最终连接产物。
图4详细说明了本发明的一种使用两种不同的1-苯基-2-巯基乙基助剂的通用的连接策略。
图5A和5B显示实施例21中描述的使用一种Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙基助剂进行的细胞色素b562的连接反应的高效液相色谱(HPLC)分析结果。图5A显示时间为0时的连接反应状况。图5B显示反应过夜后连接的状况。图5B中还显示，观察到两种产生于Nα-1-(4-甲氧基苯酚)-2-巯基乙基助剂的C1处的非手性中心的连接产物。
图6A和6B显示通过使用扩展的天然的化学连接和一种Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙醇}改性的N-末端片断形成的连接产物细胞色素b562残基1-106的重建的电雾化质谱(MS)。把带有C-末端硫代酸酯的细胞色素b562残基1-63与带有N-末端N α-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙醇}甘氨酸的细胞色素b562残基的64-106连接起来。图6A显示在连接位点处含有一个可除去的Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙醇}基团的初始连接产物的质谱重建。图6B显示在用氟化氢(HF)处理以除去Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙醇}基团而在连接位点处产生天然的酰胺键后，连接产物的质谱重建。观察到的质量为11948±1Da(在HF处理之前)和11781±1Da(在HF处理之后)，即损失167±2Da，与除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙醇辅助基团的期望损失166Da良好地吻合。
图7A和7B详细说明图6B中所述的线性的细胞色素b562物质的HPLC的典型分析结果(图7A)和折叠后该物质的离子交换色谱图(图7B)。
特定的实施方式的描述本发明针对涉及扩展的天然的化学连接方法和组合物。一般来说，该方法涉及把包含一种羧基硫代酸酯，更优选一种α-羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种酸稳定的N-取代的，优选Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接起来。
第一种组分的羧基硫代酸酯与第二种组分的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇的硫醇之间的化学选择性反应通过一种硫酯键合的中间体进行，分解为一种初始连接产物。更具体地，发生在COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，该连接产物发生自动重排，经过一个5元或6元环中间体而产生一种酰胺键合的下式的第一步连接产物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定义。
在连接位点处的N-取代C2或C3链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而不会对产物产生损害，产生一种下式的最终的连接产物J1-C(O)-HN-J2 V其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定义。最终的连接产物在连接位点处含有一个天然的酰胺键。
更具体地，本发明的扩展的天然的化学连接方法包括对下列组分进行化学连接(i)包含式J1-C(O)SR的α-羧基硫代酸酯的第一种组分，和(ii)包含式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2(I)或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分，其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定义。
选择R1、R2和R3基团以方便在与肽相容的断裂条件下断裂N-C1键，例如可以使用给电子基团，特别是当与C1共轭时，以在C1处形成便于断裂的共振稳定的阳离子。化学连接反应优选包含一种硫醇催化剂作为赋形剂并且在大约中性的pH条件下在水性或有机-水性的混合条件下进行。第一种和第二种组分的化学连接可以通过一种5元或6元环进行，后者自发地发生重排，得到一种N-取代的酰胺键合的连接产物。当第一种和第二种组分是肽或多肽时，N-取代的酰胺键合的连接产物的式为J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2(VIII)或J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2(IX)其中J1、J2以及R1、R2、R3和Z2如前面所定义。
N取代的酰胺键合的连接产物的共轭的给电子基团R1、R2或R3有助于从N-取代的酰胺键合的连接产物中断裂N-C1键和除去C2或C3链烷基或芳基硫醇。在与肽相容的消去条件下除去N的烷基或芳基硫醇链，产生一种在连接位点处含有天然的酰胺键的连接产物。如果第一种和第二种组分是肽或多肽，则连接产物将具有下式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 (X)与以前的化学连接相比，本发明的方法具有多个优点。其中好几个这样的优点涉及本发明的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇组分的精细的协调性。首先，没有连接的N-取代的组分对酸性条件是稳定的，这允许它进行强有力的合成和储藏。其次，它能与羧基硫代酸酯组分发生选择性的反应而产生一种在连接位点处具有一个N-取代的酰胺键的初始连接产物。第三点，在初始连接产物的连接位点的Nα位处再生的烷基或芳基硫醇部分可以在与未受保护的、部分受保护的或完全受保护的肽、多肽或其它部分完全相容的条件下被选择性地消去，即可以消去烷基或芳基硫醇部分而不会损坏所要的连接产物。根据连接所选择的特定的N-取代的烷基或芳基硫醇部分的不同，选择性的断裂反应可以容易地在标准的与肽相容的断裂条件下，例如在酸性、光解或还原性条件下进行。因此，本发明的另一个优点是根据所要的最终用途的不同，位于连接组分的其余部分上的一个或多个基团如果存在的话，可以是未受保护的、部分受保护的或完全受保护的。而且，已知羧基硫代酸酯和N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇的化学选择性和溶解性，连接反应可以快速而干净地进行，在pH7左右在水性条件下在室温左右达到很高的产物收率。这使得本发明用于在温和条件下连接部分或完全未受保护的肽、多肽或其它聚合物时具有特别大的灵活性。
对于包含N-取代的C2链烷基或芳基硫醇组分的本发明的肽组分来说，该化合物具有下式HS-C2-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2 (XI)如下列表1中所示。J2和R2如前面所定义；Z2是与N-取代的氨基酸相容的侧链基团，例如为一种氨基酸的侧链。R1优选为在C1的邻位或对位被一个给电子基团取代的苯基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)。
表I 为了保持与C1碳的电子共轭以促进连接后N-C1键的断裂，把苯基和吡啶甲基的给电子取代基R1′、R3′和R5′定位在邻位或对位是必要的。
优选的R1′、R3′和R5′的给电子基团包括强给电子基团例如甲氧基(-OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)、甲硫基(-SCH3)和中等的电子给体例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)、异丙基(-CH2(CH3)3)。条件是R1′、R3′和R5′中的任何一个或全部可以是H。一个普遍的观点是强给电子基团增强C2链烷基或芳基硫醇在连接后发生断裂的敏感性。当存在单个的给电子基团作为R1′、R3′或R5′取代基时，连接反应可以以更快的速率进行，而断裂则更慢或者需要更加严格的断裂条件。当存在两个或两个以上的给电子基团作为R1′、R3′或R5′取代基时，连接反应将会更慢，而断裂则更快或者需要不太严格的断裂条件。因此，可以相应地选择特定的给电子基团。
本发明的另一种实施方式涉及N-取代的C2链化合物，它包含一个硫醇作为R1′和R5′位的R1的取代基。除了作为与C1共轭的给电子基团外，在这些位置中的一处或两处引入一个硫醇能使化合物经过R1基团介导而连接到一个6元环中(以及通过Nα-C2链烷基硫醇连接到一个5元环中)。它还增大了用于与α-羧基硫代酸酯反应的可利用的硫醇的局部浓度，并且就结构限制来说.提供了其它构象，这可以促进连接。
说到本发明的Nα-取代的C3链烷基或芳基硫醇组分，该化合物具有式HS-C3(R3)-C2(R2)C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2，如下列表II中所示表II 如前面所述，J2可以是与肽的化学合或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分，Z2是与N-取代的氨基酸相容的侧链基团，例如为一种氨基酸的侧链。当R1不是H时，则R2和R3都是H，而R1是未取代的或更优选地在C1的邻位或对位被一个给电子基团取代的苯基部分；或吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)。当R2和R3不是H时，R1是H，而R3和R2形成一个在C1的邻位或对位被一个给电子基团取代的苄基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的邻位或对位被羟基或硫醇取代)。
至于N-取代的C2链化合物，为了保持与C1碳的电子共轭以便于在连接后能有力地断裂Nα-C1键，把苯基和吡啶甲基的给电子取代基R1′、R3′和R5′定位在邻位或对位是必要的。然而，当R2和R3与C2和C3形成一个苄基时，至少R1′和R3′中的一个包含一个强给电子基团，其中R1′或R3′选自甲氧基(OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。对于其中R2和R3都是H的N-取代的C3链硫醇，R1包含一个苯基或吡啶甲基，其中R1′、R3′和R5′包含强或中等的给电子基团或其组合。如同N-取代的C2链烷基或芳基硫醇的情况一样，强给电子基团能够增强C3链烷基或芳基硫醇在连接后发生断裂的敏感性。因此，可以相应地选择特定的给电子基团或其组合。
与N-取代的C2链化合物相似，当硫醇可以用来在令人感兴趣的结构中用于取代时，本发明的N-取代的C3链化合物可以包括一种硫醇作为R1′和R5′位的R1的取代基。同样，给电子的硫醇基团与C1共轭，把它引入到这些位置上使化合物具有两条能形成6元环连接的路线。它还增大了用于与α-羧基硫代酸酯反应的可利用的硫醇的局部浓度，并且就结构限制来说，提供了其它构象，这可以促进连接。
本发明的N-末端的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇氨基酸的合成可以按照这里所说的方法进行，例如按照方案I和方案II、实施例以及按照本领域中已知的标准的有机化学技术进行，参见例如″Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，andStructure，″4th Edition，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1992；″Comprehensive Organic Transformations，AGuide to Functional Group preparations，″R.Larock(Ed.)，VCHPublishers，New York，NY，1989。它们可以在溶液中、通过聚合物负载的合成方法或其组合进行合成。优选的方法使用Nα保护的N烷基化的S-保护的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体。合成所用的试剂可以从多个商业渠道得到。而且，应很好地理解到，可以把原料组分和各种中间体，例如单一的氨基酸衍生物储存起来以备后用，以试剂盒等提供。
在制备本发明的N-末端Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇氨基酸时，采用保护基策略。在各种合成策略中所优选使用的保护基(PG)一般与固相肽合成(″SPPS″)相容。在一些情况下，还有必要使用可以在不同的条件下可被除去的正交保护基。已知有许多适用于这种目的的保护基(参见例如″protecting groups in Organic Synthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″SyntheticPeptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman &Company，New York，NY，1992；″Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principlesof Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and ″protecting groups，″P.J.Kocienski，Ed.，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).实例包括苄氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCI-Z、Br-Z、NSC、MSC、Dde等。对于硫部分，合适的保护基的实例包括但是不限于苄基、4-甲基苄基、4-甲氧基苄基、三苯甲基、Acm、TACAM、呫吨基、二硫化物衍生物、吡啶甲基和苯甲酰甲基。
更具体地，本发明的Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇可以按照方案I(Nα-取代的母体的固相制备)、方案II(Nα-取代的母体的溶液相制备)制备。在方案I中，使用标准的聚合物-负载的有机合成方法把Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇直接装配在固相上，同时使用标准的偶合方法使方案II的Nα-保护的，N-烷基化的，S-保护的氨基烷基或芳基硫醇氨基酸母体与树脂偶合。在方案I中，X是卤素，R1和R2如前面所述并且可以作为受保护的或未受保护的部分进行操作或者精心制作在树脂上，而J2优选与卤素相连作为X-CH(R)-J2-树脂的形式，其中R是H或其它侧链。应当明白，J2可以是多种基团，例如其中卤素X和J2-树脂被一个以上的碳原子分开，例如在β-或γ-氨基酸或类似分子的合成中。其中使用乙醛酸部分(HC(O)-C(O)J2-树脂)，得到的侧链R是H。在方案II中，X是一种卤素，R1和R2如前面所述，可以作为受保护的或未受保护的部分进行操作，或者精心制作在溶液中或树脂上，其中R是H或其它侧链。其中使用乙醛酸部分(HC(O)-C(O)-OH)，产生的侧链R为H。如上述所述，你将会明白，方案I和11可以被用在C3的链烷基或芳基硫醇的合成。当产生外消旋体或非对映异构体产物时，可能有必要在用于扩展的天然的化学连接之前，通过标准方法把这些化合物分离开来。
方案I
方案II 就本发明的扩展的天然的化学连接方法中所用的第一种组分的羧基硫代酸酯部分来说，该组分为式J1-CO-SR。更优选的羧基硫代酸酯组分包含一种式J1-NH-C(Z1)-CO-SR的α-羧基硫代酸酯氨基酸。基团J1可以是与化学选择性的连接反应相容的任何化合物部分，例如为受保护的或未受保护的氨基酸、肽、多肽、其它聚合物、染料、连接体等。Z1是与αCO-SR硫代酸酯相容的任何侧链基团，例如一种氨基酸的侧链。R是与硫代酸酯基团相容的任何基团，包括但是不限于芳基、苄基和烷基。R的实例包括3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯、苄基硫代酸酯和巯基丙酸亮氨酸硫代酸酯(参见例如Dawson等人，Science(1994)266776-779；Canne等人，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434；Ingenito等人，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)961006 8-10073)。其它的实例包括二硫代苏糖醇或烷基或芳基硫代酸酯，它们可以通过intein-介导的生物技术来生产，这样的生物技术也是众所周知的(参见例如Chong等人，Gene(1997)192277-281；Chong等人，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等人，Protein Science(1998)72256-2264；和Cotton等人，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。
α-羧基硫代酸酯可以通过化学或生物学方法按照本领域中已知的标准技术生产，例如这里所述的方法，包括实施例中所述的方法。对于化学合成，可以在溶液中或者从产生硫代酸酯的树脂合成α-羧基硫代酸酯肽，这些技术是熟知的(参见例如Dawson等人，supra；Canne等人，supra；Hackeng等人，supra，Hojo H，Aimoto，S.(1991)BullChem Soc Jpn 64111-117)。例如化学合成的硫代酸酯肽可以从相应的肽α-硫代酸制得，而后者又可以在一种硫代酸酯-树脂上或者在溶液中合成，但是优选树脂方法。可以把肽-α-硫代酸转变为相应的3-羧基-4硝基苯基硫代酸酯、相应的苄基酯或多种烷基硫代酸酯中的任何一种。所有这些硫代酸酯都能给连接反应提供满意的离去基团，其中3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯所表现的反应速率比相应的苄基硫代酸酯高一些，而苄基硫代酸酯的反应性又比烷基硫代酸酯高。作为另一个实例，可以使用能产生三苯甲基缔合的巯基丙酸亮氨酸硫代酸酯的树脂来构建C-末端硫代酸酯(Hackeng等人，supra)。还可以使用一种3-羧酸丙磺酰胺安全捕集连接体，通过用重氮甲烷或碘乙腈活化，然后用一种合适的硫醇取代来进行C-末端硫代酸酯的合成(Ingenito等人，supra；Shin等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121，11684-11689)。
也可以使用生物学方法来制备肽或多肽C-末端α-羧基硫代酸酯。例如可以使用含有或不含有标记物例如亲和标记物的intein表达系统，利用″intein″蛋白拼接元件的可诱导的自断裂活性，在一种合适的硫醇存在下来生产C-末端硫代酸酯肽或多肽片断。特别是，intein在硫醇例如DTT、β-巯基乙醇、β-巯基乙磺酸或半胱氨酸存在下，发生特异性的自断裂，产生一种带有C-末端硫代酸酯的肽片断，参见例如Chong等人，(1997)supra；Chong等人，(1998)supra；Evans等人，Supra；和Cotton等人，supra.
把本发明的N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇组分与第一种羧基硫代酸酯组分连接，产生一种在连接位点处含有N-取代的酰胺键的连接产物，如图1、2和3中所示。选择反应的连接条件以保持硫代酸酯与N-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇部分选择性的反应性。在一种优选的实施方式中，连接反应在一种pH6-8，优选的pH范围为6.5-7.5的缓冲溶液中进行。该缓冲溶液可以是水性溶液、有机溶液或其混合物。连接反应还可以包括一种或多种催化剂和/或一种或多种还原剂、脂质、去污剂、其它变性剂或增溶剂等。优选的催化剂的实例有硫醇和含膦基团，例如硫酚、苄基硫醇、TCEP和烷基膦。变性剂和/或增溶剂的实例包括胍、脲在水或有机溶剂例如TFE、HFIP、DMF、NMP中、混有水的乙腈中的溶液、或混有胍和脲的水溶液。还可以利用温度来调节连接反应的速率，温度通常在5℃与55℃之间，优选温度介于15℃和40℃之间。作为一个实例，在一个含有2％硫酚的6M胍的反应体系中，在6.8-7.8的pH下，连接反应进行得很好。
对于N-取代的C2链烷基或芳基硫醇来说，连接产生于发生在COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换。交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，后者自发地发生重排，通过一个5元环中间体而产生一种在连接位点处含有可以被除去的N取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的连接产物，其中取代基如前面所定义。在连接位点处的N取代的C2链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而产生一种在连接位点处具有天然的酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终的连接产物。
对于N-取代的C3链烷基或芳基硫醇来说，COSR硫代酸酯组分和氨基烷基硫醇组分之间的硫醇交换产生一种硫酯键合的中间体连接产物，后者自发地发生重排，通过一个6元环中间体而产生一种在连接位点处含有可以被除去的N取代的C3链烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的连接产物。在连接位点处的N取代的C3链芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在与肽相容的条件下除去而产生一种在连接位点处具有天然的酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终的连接产物。
N-取代的烷基或芳基硫醇基团的除去优选在酸性条件下促进断裂N-C1键而进行，在连接位点处得到一种稳定的未取代的酰胺键。″与肽相容的断裂条件″是指适用于从连接产物中断裂N-键合的烷基或芳基硫醇部分的与肽相容的物理-化学条件。与肽相容的断裂条件一般根据所用的Nα-烷基或芳基硫醇部分来进行选择，它可以容易地从合成路线和熟知的方法演绎出来(参见例如″Protecting Groups in OrganicSynthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″Synthetic Peptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″Advanced ChemtechHandbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，Ed.，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
例如，其中的R1′、R2′或R3′取代基包括甲氧基、羟基、硫羟或甲硫基、甲基等，用于消去的更普遍的方法涉及用于肽合成化学中的典型的酸性断裂条件，这包括在强酸性条件下或水-酸条件下，在有或没有还原剂和/或清除剂体系(例如酸，例如无水的氟化氢(HF)、三氟乙酸(TFA)或三氟甲磺酸(TFMSA)等)的情况下断裂N-C1键。
对于给定的结构，可以选择更具特异性的酸性断裂体系来最优化Nα-C1键的断裂，以除去芳基或烷基硫醇部分。这样的条件是熟知的并且是与保持肽的完整性相容的。另一种断裂方法涉及包含一种硫醇清除剂，其中色氨酸存在于肽或多肽序列中以避免色氨酸侧链与游离的芳基或烷基硫醇部分反应。硫醇清除剂的实例包括乙二醇、半胱氨酸、β-巯基乙醇和甲硫酚。因此，本发明的另一种实施方式是在断裂N-C1键而除去芳基或烷基硫醇部分时加入一种硫醇清除剂。
当吡啶甲基作为取代基时，其它具体的断裂条件包括光或还原性断裂条件。作为一个实例，当R1或R2和R3取代基包含一个吡啶甲基部分时，可以使用光解(例如紫外光)、锌/乙酸或电解还原按照标准方法进行断裂。当N-取代的C2链硫醇的R1在R1处含有一个甲硫基时，则可以使用汞(11)或HF进行断裂。还可以使用断裂体系同时从固体载体中断裂并且/或者当第一种和第二种连接组分包含其它保护基时，断裂体系可作为脱保护试剂。例如，可以通过把多肽溶于含有活化的锌(～0.5g/ml)的10％的乙酸/水溶液中来除去N-吡啶甲基。硫代甲基例如2-巯基、1-甲基亚磺酰基乙基(HS-C2-C1(S(O)-CH3)-Nα)可以在连接后通过还原和二价汞、巯基介导的断裂而除去。作为一个实例，通过把多肽溶于含有N-甲基巯基乙酰胺(MMA)的3％的乙酸水溶液(例如1mg多肽在0.5ml乙酸/水和0.05mlMMA中的溶液)中，还原为硫代甲烷形式，然后在反应过夜后冷冻和冷冻干燥该混合物来除去甲基亚磺酰基乙基。然后可以在一种含有乙酸汞(Hg(OAc)2)的3％的乙酸水溶液中除去还原的助剂(例如用0.5ml的乙酸水溶液和10mg Hg(OAc)2处理大约1小时)，然后加入β-巯基乙醇(例如0.2mlβ-巯基乙醇)。然后可以通过标准方法例如反相HPLC(RPHPLC)来纯化产物。
可以理解的是，还可以在断裂体系中使用一种或多种催化剂和/或赋形剂，例如一种或多种清除剂、去污剂、溶剂、金属等。一般来说，特定的清除剂的选择取决于所存在的氨基酸。例如，可以利用清除剂的存在来抑制在断裂过程中产生的碳鎓离子有可能对某些氨基酸(例如Met、Cys、Trp和Tyr)产生的损坏作用。还可以使用其它添加剂如去污剂、聚合物、盐、有机溶剂等通过调节溶解性促进断裂。使用能调节氧化还原体系的催化剂或其它化学试剂也是有利的。还容易明白，可以通过常规方式调节多种其它的物理化学条件例如缓冲体系、pH和温度来最优化给定的断裂体系。
本发明还提供受保护形式的本发明的Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇。这些化合物特别可用于自动的肽合成和正交的以及汇集的连接策略。这些组份包含一种式(PG2)S-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)J2或(PG2)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的完全受保护的、部分受保护的或完全未受保护的酸稳定的Nα-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇，如表III和表IV中所示。尤其是，R1，R2和R3中的一个或多个含有与C1共轭的给电子基团，它在Nα-取代的氨基烷基或芳基硫醇转变为Nα-取代的酰胺烷基或芳基硫醇后，能够在C1处形成一种共振稳定的阳离子而便于在与肽相容的断裂条件下断裂Nα-C1键。PG1和PG2是单独或一起存在的保护基团，或者不存在，并且可以相同或不同，其中Z2是与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分，并且其中J2是与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的任何化合物部分。
PG1(或X1)是一种胺的保护基。PG2(或X2)是一种硫醇的保护基。许多这样的保护基是已知的并且适用于这种目的(参见例如″Protecting Groups in Organic Synthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″Synthetic Peptides，A User′sGuide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & SolidPhase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principles of PeptideSynthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
表III
优选的PG1和X1保护基的实例包括但是不限于[Boc(叔丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2，-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)、Br-Z或C1-Z(Br-或C1-苄基氨基甲酸酯)、Dde(4，4，-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)、MsZ(4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯)、Msc(2-甲基磺基乙基氨基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基乙基磺酰基-乙氧基羰基]。优选的PG1和X1保护基选自″Protective Groups inOrganic Synthesis，″Green and Wuts，Third Edition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最优选Fmoc和Nsc。优选的PG2保护基的实例包括但是不限于[Acm(乙酰氨基甲基)、MeOBzl或Mob(对甲氧基苄基)、MeBzl(对甲基苄基)、Trt(三苯甲基)、Xan(呫吨基)、tButhio(叔丁基硫基)、Mmt(对甲氧基三苯甲基)、2或4-吡啶甲基(2或4-吡啶基))、Fm(9-芴基甲基)、tBu(叔丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)]。优选的PG2和X2保护基选自″Protective Groupsin Organic Synthesis，″Green and Wuts，Third Edition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最优选Acm、Mob、MeBzl、吡啶甲基。
正交保护方案涉及能通过不同的化学机理被除去因而可以在其它类保护基存在的情况下以任何顺序被除去的两类或多类或组保护基。正交方案提供了基本上温和的总体条件的可能性，因为可以根据化学组成和性质而不是反应速率的不同来达到选择性。
表IV 本发明的Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇的受保护形式可以按照上述方案I和II中所述的方法制备。
本发明的化合物可以通过包括卤素介导的氨基烷基化、还原性氨基化在内的多种方法中的任何一种以及通过制备与固相或溶液氨基酸或肽合成方法相容的Nα-保护的，N-烷基化的，S-受保护的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母体来生产。需要时，可以通过标准方法对生产的外消旋体或非对映异构体进行拆分而得到具有可以接受的手性纯度的化合物。
如上述所，在一些情况下，优选具有可以接受的手性纯度的Nα-取代的C2或C3链烷基或芳基硫醇。如实施例21和图5B中所示，把Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙基助剂用于制备细胞色素b562，得到两种具有重叠的纯化曲线的连接产物(非对映异构体)。尽管除去Nα-助剂只得到一种主要产物，但是在最终的产物中将存在很少百分数的不需要的消去产物和副反应产物。例如，在实施例4-6中所述的用于合成细胞色素b562的合成中所用的Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙基助剂的还原性氨基化合成路线本质上会在手性中心C1处产生两种差向异构体。如上所述，需要时，可以通过标准方法对产生的外消旋体或非对映异构体进行拆分而得到具有可以接受的手性纯度的化合物。
用于得到具有可以接受的手性纯度的本发明的Nα-助剂的标准方法是(1)手性色谱(2)手性合成(3)使用共价键合的非对映异构的共轭体和(4)结晶或其它常规的分离方法来得到对映体纯的手性助剂(参见例如Ahuja，Satinder.′Chiral separations.Anoverview.′ACS Symp.Ser.(1991)，471(Chiral Sep.Liq.Chromatogr.)，1-26；Collet，Andre.″Separation andPurification of Enantiomers by Crystallization Methods″，InEnantiomer(1999)4157-172；Lopata et al.，J.Chem.Res.Minipprint(1984)102930-2962；Lopata et al.，J.Chem.Res.(1984)102953-2973；Ahuja，Satinder.′Chiral separations andtechnologyan overview.′Chiral Sep.(1997)，1-7；ChiralSeparationsApplications and Technology.Ahuja，Satinder；Editor.USA.(1997)，349pp.Publisher(ACS，Washington，D.C.))。所有这些标准方法都可用于拆分外消旋体或非对映异构体而得到具有可以接受的手性纯度的化合物。例如，可以使用结晶来对对映体进行旋光拆分。对于手性色谱，众所周知，可以通过制备性的色谱使用手性介质把外消旋体混合物分离为手性纯的对映体。因此，可以使用在手性Nα-助剂的总合成中所用的还原性氨基化路线所生产的外消旋体混合物来制备每种手性纯的对映体，例如如下所述的氨基酸助剂(例如其中R是氨基酸侧链) ～摩尔比大约1∶1每一种对映体都可以以手性纯的形式得到，或两种对映体都可以以手性纯的形式得到。每一种对映体都可用于形成手性纯的助剂改性的组分，例如肽片断(即两种手性纯的差向异构体)，它们可以是严格纯化的，不受其它差向异构体和杂质的存在的干扰。注意，除非准备使用两种对映体，否则助剂总量中的50％将会被浪费掉。例如，然后可以把这两种手性纯的助剂改性的肽片断用于分离ENCL的反应中，得到手性纯的助剂改性的连接产物混合物。在分离纯化后，从差向异构体连接产物中除去助剂基团(单独进行或者在合并后进行)，得到具有同样的天然结构的连接产物，然后把连接产物纯化。
对于手性合成，优选的方法使用一种对映体纯的手性原料，如下所示的对甲氧基苯基取代的Nα-C2助剂 [PG1＝Boc或Fmoc；PG2＝(4-甲基)苄基或(4-甲氧基)苄基]然后可以使用所得的手性纯的母体化合物来制备一种受保护的(N-取代的)氨基酸，即 或者直接用于“亚单体”肽合成路线，即 在聚合物载体上形成助剂改性的肽。然后脱保护/断裂，得到手性纯的助剂改性的肽片断，即 可以从易于得到的已知具有手性的对位取代的苯基甘氨酸来制备本发明的手性纯的Nα-助剂，因而预先确定了所得的助剂的手性和手性纯度。
另外，另一种优选的实施方式使用具有对映体选择性的使用不对称还原的合成方法来生产助剂，例如如下所示 R＝-H，或-CH3，或-CH2COOH(或相对的对映体)还可以把不对称还原用于对映体选择性合成中来生产Nα-助剂改性的氨基酸，例如对于如下所示的甘氨酸，即 (或其它对映体)虽然以一种合适的方式实施的不对称合成会产生大大过量的一种对映体(相对于另一种)，然而预期将会存在一定数量的其它对映体。可以使用一种手性纯化步骤来对付这种情况以得到纯粹的主要对映体。对映体选择性的合成路线的主要优点是手性色谱分离更加容易，并且不会扔弃(浪费)大量的物质。
另一种优选的标准技术是使用共价的非对映异构的共轭体进行拆分。一般来说，这种方法使用手性的氨基酸(例如Ala)来对外消旋体助剂混合物进行改性，并且通过标准的(非手性的)色谱方法分离所得的非对映异构体，如下所示。例如，通过共价掺入第二个手性中心可以把外消旋的助剂1转变为非对映异构体的混合物 对映体 非对映异构体(外消旋体混合物)在这种情况下，通过使外消旋体混合物与(R)2-Br-丙酸发生一种SN2亲核反应(反转)，得到图中所示的一对非对映异构体。事实上，我们使用一种N-键合的含有硫醇的手性助剂制得了L-Ala。
作为非对映异构体，这两种化合物在非手性的色谱条件下将典型地具有不同的色谱行为，因而能在实际的制备条件下分离而得到纯粹的不同的差向异构体。
在对Nα部分进行合适的保护后，可以使用每一种化合物来生产含有N-末端Ala残基的未受保护或部分受保扩的手性纯的助剂改性的肽片断。
本发明的受保护的Nα-取代的组分特别可用于采用常规的肽合成和其它有机合成策略的快速自动合成。它们还把化学连接的用途扩大到多组分连接方案，例如当生产一种涉及正交连接策略例如三个或更多个片断连接方案或汇集的连接合成方案的多肽时。
例如，可以把本发明的扩展的天然的化学连接方法和组合物与生产亲核性的稳定的硫代酸酯的方法和硫代酸酯的安全捕集方法结合起来使用，例如于2001年8月31日登记的共同未决申请PCT申请号[还未指定]和于2000年9月1日登记的美国临时专利申请号60/229,295(在此引入供参考)中所述的原硫醇酯和羧酸酯硫醇。简单地说，能产生亲核性的稳定的硫代酸酯的化合物包括一种原硫醇酯或羧酸酯硫醇；这些化合物在有机合成中具有广泛的用途，包括生产肽-、多肽-和其它聚合物-硫代酸酯。能产生亲核性的稳定的硫代酸酯的化合物特别可用于从在使用强亲核性物质的条件下制备的母体生产活化的硫代酸酯，例如使用Fmoc SPPS以及需要(得益于使用)给感兴趣的特异性连接反应定向的相容的选择性保护方法的多步连接或共轭方案制备的肽或多肽。亲核性的稳定的原硫醇酯式为X-C(OR′)2-S-R，其中X是选择性地包含一个或多个可断裂的亲核性保护基的感兴趣的目标分子，R′是一个可以在非亲核性的断裂条件下断裂的亲核性的稳定的保护基，而R是与原硫醇酯-C(OR′)-S-相容的任何基团。还提供能生产亲核体-稳定的原硫醇酯硫代酸酯的树脂，该树脂式为X-C(OR′)2-S-R-连接体-树脂或X-C((OR1′-连接体-树脂)(OR2′))-SR，其中X、R′和R如前面所述，并且其中连接体和树脂是适用于固相有机合成的任何亲核体-稳定的连接体和树脂，包括随后能转变为亲核体-不稳定的用于断裂的安全捕集连接体。可以通过多种非亲核性的条件例如酸水解条件把亲核体-稳定的原硫醇酯转变为活性的硫代酸酯。亲核性稳定的羧酸酯硫醇式为X-C(O)-O-CH(R″)-(CH2)η-S-R，其中X是包含一个或多个亲核体不稳定的保护基的感兴趣的目标分子，R″是一个非亲核体稳定的基团，n是1或2，优选n＝1，而R″′是H、保护基或一种与树脂相连的酸-或还原-不稳定的或安全捕集的连接体或可在非亲核条件下除去的保护基团。还提供了基于亲核体-稳定的羧酸酯硫醇的生产硫代酸酯的树脂，该树脂式为X-C(O)-O-CH(R″)-CH2η-S-连接体-树脂或X-C(O)-O-CH(R″-连接体-树脂)-CH2η-S-R″′，其中X、R″、n和R″′如前面所定义，而其中的连接体和树脂是任何适用于固相有机合成的亲核体-稳定的连接体和树脂。可以通过加入一种硫醇催化剂例如硫酚把亲核体-稳定的羧酸酯硫醇转变为活性的硫代酸酯。因此，可以把本发明的扩展的天然的化学连接方法和组合物用于多片断的汇集连接技术中，其中靶化合物的一个末端可以带有本发明的受保护的或未受保护的Nα-C2或C3链烷基或芳基硫醇，而另一个末端带有一个原硫醇酯或羧酸酯硫醇部分，用于随后转变为活性的硫代酸酯和连接。
还应当明白，可以把本发明的Nα-C2或C3链烷基或芳基硫醇与其它连接方法结合使用，例如为天然的化学连接(Dawson，等人，Science(1994)266776-779；Kent，等人，WO96/34878)、扩展的通用化学连接(Kent，等人，WO98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)，形成硫代酸酯的连接(Schnlzer，等人，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)和形成噻唑烷的连接以及形成恶唑烷的连接(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等人，WO95/00846)或其它方法(Yan，L.Z.and Dawson，P.E.，″Synthesis of Peptide and Proteins without CysteineResidues by Native Chemical Ligation Combined withDesulfurization，″J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入供参考；Gieselnan等人.，Org.Lett.20013(9)1331-1334；Saxon，E.等人，″Traceless″Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.2000，2，2141-2143)。本发明还考虑用硒取代本发明的Nα-C2或C3链烷基或芳基硫醇中的硫醇硫。
本发明的方法和组合物有许多用途。本发明的方法和组合物特别可用于连接肽、多肽和其它聚合物。能够对包括天然氨基酸和非天然氨基酸及其衍生物在内的实际存在的任何氨基酸进行天然的化学连接的能力将天然的化学连接扩大到了缺乏合适的半胱氨酸连接位点的靶分子。除了用于连接肽或多肽片断外，本发明还可用于连接聚合物，当需要在连接位点处通过一个含有Nα取代的或全天然的酰胺键来连接这样的部分时。本发明还在用于表达蛋白连接(EPL)的很广泛的肽标记物的生产中找到了用途。例如，可以根据所要的最终用途的不同，通过一个Nα-取代的烷基或芳基硫醇的酰胺键或全天然的酰胺键把生产EPL的硫代酸酯多肽与很广泛的肽连接起来。还可以利用本发明来生产在肽和多肽发生环化的位点处具有天然的酰胺键的多种环状的肽和多肽。例如这很重要，因为大多数环状的肽例如按照工业标准生产的抗生素和其它药物在环化(即头-尾相接)的连接位点处不含有可用于形成天然酰胺键的半胱氨酸残基。
在本说明书中提到的所有出版物和专利申请已收入本文供参考，达到同样的程度，似乎每个单个的出版物或专利申请都具体而单独地表明是供参考引入的。
实施例给出下列制备和实施例为的是让本领域技术人员能更清楚地理解和实施本发明。不应把它们看作是对本发明的范围的限制，而应当仅仅是说明性的和代表性的。
缩写Acm 乙酰氨基甲基Aloc 烯丙氧基羰基BOP 苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐Br，ClZ Br，Cl苄基氨基甲酸酯DCM 二氯甲烷DDE 4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基DIPCDI N，N-二异丙基碳酰二亚胺DIPEA N，N-二异丙基乙胺DMAP4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO二甲基亚砜EtOH 乙醇Fmoc 9-芴基甲氧基羰基FM9-芴基甲基HATU (N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物)HBTU 前面所命名的N-[(1-H-苯并三唑-1-基)(二甲基胺)亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐-N-氧化物的0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐HF 氢氟酸HMP树脂 4-羟基甲基苯氧基树脂；对烷氧基苄基醇树脂；或Wang树脂HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑HOBt 1-羟基苯并三唑Mbh 二甲氧基二苯甲基MBHA树脂 4-甲基二苯甲基胺树脂Meb 对-甲基苄基MMA N-甲基巯基乙酰胺Mmt 对-甲氧基三苯甲基Mob 对-甲氧基苄基Msc 2-甲基磺基乙基氨基甲酸酯Msz 4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基NMM N-甲基吗啉NMP N-甲基吡咯烷酮，N-甲基-2-吡咯烷酮Nsc 4-硝基苯基乙基磺酰基-乙氧基羰基OPfp 五氟苯基酯OtBu 叔丁基酯PAC 肽酸连接体PAL 肽酰胺连接体Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基PEG-PS聚乙二醇-聚苯乙烯Picolyl 吡啶甲基Pmc 2，2，4，6，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基PyAOP 7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐S-tBu 叔丁基硫基Tacam 三甲基乙酰氨基甲基tBoc 叔丁氧基羰基TBTU 0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐tBu 叔丁基TFA 三氟乙酸Tis 三异丙基硅烷Tmob 2，4，6-三甲氧基苄基TMOF 三甲基原甲酸酯Troc 2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯Trt 三苯基甲基实施例1一般原料和方法以逐步的方式，通过SPPS采用用于Boc化学的原位中和/HBTU活化方法，在PAM树脂或生产硫酯的树脂上按照标准方法(Hackeng等人，supra；Schnolzer等人，(1992)Int.J.Pept.Prot.Res.，40180-193；and Kent，S.B.H.(1988)Ann.Rev.Biochem.57，957-984)在一种改进的ABI 430A肽合成器上进行肽的合成。在链装配好以后，把肽脱保护，同时通过用含有5％对甲基苯酚的无水氟化氢(HF)处理进行断裂，冷冻干燥，通过制备性的HPLC纯化。从PeptidesInternational and Midwest Biotech得到Boc保护的氨基酸。三氟乙酸(TFA)由Halocarbon得到。其它化学试剂从Fluka或Aldrich得到。分析和制备性的HPLC在一个Rainin HPLC体系上进行，使用分析或制备性的Vydac C4在214nm处进行紫外线检测。肽和蛋白质质谱在一台Sciex API-I电雾化质谱仪上进行。实施例22(4′-甲氧基苄基硫基)苄基溴的制备使10mmol，1.4g的2-羟基甲基硫酚在10ml DMF中与10mmol的4-甲氧基苄基氯和1.75ml DIEA在室温下反应。反应在10分钟之内完成，加入50ml pH＝3的水。用乙酸乙酯萃取产物，在硫酸钠上干燥。然后使得到的粗油与11mmol四溴化碳(3.64g)和11mmol三苯基膦(2.88g)在20ml THF中反应。反应过夜后，蒸发THF。通过硅胶色谱法纯化产物，用6/1的己烷/乙酸乙酯作为流动相。回收到1.8g。实施例3Nα(2-巯基苄基)甘氨酸-肽的制备向与树脂结合的含有N-末端的Boc-保护的Ala(78mg)的肽中加入纯TFA以除去Boc基团。使用标准的化学方法把Boc-甘氨酸-O-丁二酰亚胺偶合到树脂上。偶合完成后，除去Boc基团，用10％二异丙基乙胺的DMF溶液洗涤两次进行中和，然后用DMF和DMSO洗涤树脂。然后加入9mg2-(4′-甲氧基苄基硫基)苄基溴在0.2ml DMSO和0.01ml二异丙基乙胺中的溶液，混合物在室温下反应12小时。使用标准方法在HF条件下对肽进行断裂和脱保护。校正质量为2,079Da的峰大约占所有肽物质的12％(通过HPLC测定)。用标准的半制备性的HPLC来纯化校正的肽。实施例44′-甲氧基-2-(4′-甲基苄基硫基)苯乙酮的制备把4mmol，0.542ml的4-甲基苄基硫醇和4mmol，916.3mg的4′-甲氧基-2-溴代苯乙酮溶于4ml DMF中。然后加入4mmol0.7ml的二异丙基乙胺。在室温下搅拌混合物1小时。把混合物倒入稀盐酸中，用乙酸乙酯萃取，在硫酸钠上干燥。把油状物溶于乙酸乙酯中，加入石油醚进行沉淀，回收到450mg白色固体。实施例51-氨基-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄硫基)乙烷的制备把1.44mmol，411mg的4′-甲氧基-2-(4′-甲基苄硫基)苯乙酮和4.3mmol，941mg的氨氧基乙酸溶于20ml TMOF中，在室温下加入0.047ml甲磺酸作为催化剂催化剂。48小时后，蒸去溶剂，在乙酸乙酯中浸取残留物，用1M硫酸氢钾洗涤，在硫酸钠上干燥。用硅胶色谱法纯化粗产物，得到200mg肟配合物。把200mg 0.556mmol的这种肟配合物溶于2ml THF中，然后加入1.67ml 1M BH3/THF配合物。27小时后，没有留下原料。加入3ml水和1.5ml 10N氢氧化钠。回流混合物1小时。然后用乙酸乙酯萃取(4次)混合物，在硫酸钠上干燥，然后使用硅胶色谱法纯化最终产物(40mg)。实施例6Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的制备向与树脂结合的含有N-末端的Boc-保护的Ala(78mg)的模板肽中加入纯的TFA以除去Boc基团。使用标准的化学方法使溴乙酸与树脂偶合。然后向树脂中加入17mg1-氨基-1-(4甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.010ml二异丙基乙胺中的溶液。反应过夜后，洗涤树脂，使用标准的HF方法对肽进行断裂和脱保护。然后使用半制备性的HPLC纯化所要的产物。另一种Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的制备使用标准的偶合方法使0.1mmol序列为S-Y-R-F-L-聚合物的模板肽树脂、溴乙酸偶合。偶合后，用DMSO洗涤树脂，然后加入32.5mg，0.12mmol 1-氨基-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.025ml二异丙基乙胺中的溶液，让混合物反应过夜。使用标准的HF方法对肽进行断裂和脱保护。粗断裂产物的HPLC显示，所要的产物(MW 2，122)占所有产物的60％。发现正烷基乙硫醇基在HF中97％是稳定的。实施例72′，4′-二甲氧基-2-(4′-甲基苄基硫基)苯乙酮的制备把3.94mmol，0.534ml 4-甲基苄基硫醇和3.86mmol，1g 2′，4′-二甲氧基-2-溴苯乙酮溶于4mL DMF中。然后加入3.94mmol0.688moL二异丙基乙胺。在室温下搅拌混合物24小时，把混合物倒入1M硫酸氢钾溶液中，用乙酸乙酯萃取，在硫酸钠上干燥。蒸发后，把残留的油溶于乙酸乙酯中，通过加入石油醚进行沉淀，得到616mg白色固体。实施例81-氨基-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷的制备把0.526mmol，166mg 2′，4′-二甲氧基-2-(4′-甲基苄基硫基)苯乙酮和1.59mmol，345mg氨基氧基乙酸溶于6ml TMOF中，在室温下加入0.034ml甲磺酸作为催化剂。3小时后，蒸去溶剂，用乙酸乙酯浸取，用1 M硫酸氢钾洗涤，在硫酸钠上干燥。用硅胶色谱法纯化粗产物，得到126mg(产率61％)肟配合物。把126mg，0.324mmol这种肟配合物溶于1.5ml THF中，然后加入0.973ml 1M BH3/THF配合物。
54小时后还能发现原料，加入0.5ml 1M BH3/THF配合物。再反应3天后，总共反应6天，加入3ml水和1ml 10N氢氧化钠。回流混合物1h。然后用乙酸乙酯萃取(4次)混合物，在硫酸钠上干燥。然后用硅胶色谱法纯化最终的产物(43mg)。实施例9Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的制备使用标准的偶合方法使0.1mmol序列为S-Y-R-F-L-聚合物的与树脂结合的肽、溴乙酸偶合。偶合后，用DMSO洗涤树脂，然后加入36mg，0.12mmol 1-氨基-1-(2’，4’-二甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.025ml二异丙基乙胺中的溶液，让混合物反应过夜。使用标准的HF方法对肽进行断裂和脱保护。粗断裂产物的HPLC显示，所要的产物(MW938)占所有产物的42％。发现正烷基乙硫醇基在HF中92％是稳定的。实施例10C-末端SDF1-丙氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-(2-巯基苄基)甘氨酸-肽的Ala-Gly化学连接为了进行6元重排连接，把1mg SDF1-α的C-末端丙氨酸硫代酸酯片断(MW4429)和0.6mg SDF1-α的N-末端Nα-(2-巯基苄基)甘氨酸片断(MW2079)溶于100μl 6M，pH7.0的胍缓冲剂中，加入1μl硫酚。在室温(大约25℃)下反应2天后，通过ES-MS证实形成了所要的连接产物(MW5472)。然后在40℃下把反应混合物再培育24小时，基于通过HPLC积分而测得的产物和未反应的C-末端片断的比例确定所要的连接产物的产率。观察到的产率大约为40％。实施例11C-末端SDF1-丙氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的Ala-Gly化学连接为了进行5元重排连接，把1mg SDF1的C-末端丙氨酸硫代酸酯片断(MW4429)和1mg含有一个末端甘氨酸的带有一个Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2巯基乙烷基团的N-末端肽模板(MW2122)溶于100μl6M，pH7.0的胍缓冲剂和1μl硫酚中。在室温(大约25℃)下培育反应混合物，监测连接反应。8小时后，通过ES-MS证实形成了所要的连接产物(MW5515)。3天后，基于产物和未反应的C-末端片断的比例所确定的所要的连接产物的产率大约为45％。在室温下培育3天后，在40℃下再培育24小时，产率为65％。在室温下培育3天后，在40℃下再培育48小时，产率增加到大约70％。
为了进行5元重排连接，把0.5mg SDF1-α的C-末端丙氨酸硫代酸酯片断(MW4429)和0.5mg含有一个末端甘氨酸的带有一个Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2巯基乙烷基团的N-末端肽片断(MW2122)溶于100μl6M，pH8.2的胍缓冲剂和1μl硫酚中。在室温(大约25℃)下培育反应混合物，6小时后再加入1μl硫酚，24小时后，所要产物的产率大约为60％。实施例12C-末端甘氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-(2-巯基苄基)甘氨酸-肽的Gly-Gly化学连接为了进行6元重排连接，把3.5mg的一种十聚体模板肽的C-末端甘氨酸硫代酸酯片断(MW1357)和2mg含有三个HisDnp的一种模板肽的N-末端Nα-(2巯基苄基)甘氨酸片断(MW2079)溶于200μl6M，pH7.9的胍缓冲剂，加入2μl硫酚。将该混合物在33℃培育60小时。通过ES-MS证实形成了所要的连接产物(MW2631)。基于产物和未反应的N末端片断的比例，观察到产率大约为40％。
C-末端甘氨酸-硫代酸酯肽和Nα-1-(4-甲氧基苯基)2-巯基乙烷甘氨酸-肽的化学连接为了进行5元重排连接，把2mgC-末端甘氨酸硫代酸酯片断(MW1357)和2.5mg具有3个HisDnp含有一个Nα-μl(4-甲氧基苯基)2-巯基乙烷基的模板肽的N-末端片断(MW2122)溶于100μl含1μl硫酚的6M，pH为7.0的胍缓冲剂中。在室温(～25℃)下培育反应混合物，监测连接反应。通过ES-MS证实所要的连接产物的生成(MW2675.9g)。24小时后，其于产物和未反应的N-末端片断的比例，所要连接产物的产率约为40％.然后通过加入固体碳酸氢钠把pH升高到8.2，再培育反应混合物24小时，使产率达到88％。实施例13Larc-丙氨酸-硫代酸酯与Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的Ala-Gly化学连接把3mg小鼠Larc1-31的丙氨酸C末端肽硫代酸酯(MW3609)和1mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.15ml6M，pH8.2的胍缓冲剂和0.03ml硫酚中，搅拌过夜后，连接完成了81％，在40小时后，连接完成了92％(根据肽硫代酸酯的消耗计)。预期的连接产物的分子量为4312Da，测定值为4312Da.实施例14Larc1-31-丙氨酸-硫代酸酯与Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸肽的Ala-Gly化学连接把3mg小鼠Larc1-31的丙氨酸C末端肽硫代酸酯(MW3609)和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.15ml6M，pH8.2的胍缓冲剂和0.03ml硫酚中，搅拌过夜后，连接完成了73％，在40小时后，连接完成了85％(根据肽硫代酸酯的消耗计)。连接产物的分子量的计算值和试验值都是为4342Da.实施例15C-末端三肽甘氨酸硫代酸酯和N-末端Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的Gly-Gly化学连接把0.8mg肽片断FGG-硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.1ml6M，pH8.2的胍缓冲剂和0.02ml硫酚中。搅拌过夜后，反应定量地完成。连接产物的分子量的计算值和试验值分别为1199.4Da和1195.5Da。实施例16从连接产物中除去1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷1mg实施例15的纯净连接产物溶于0.95ml TFA和0.025ml水及0.025ml TIS中。1小时后，蒸去溶剂，加入50％水/乙腈溶液，把混合物冷冻干燥。通过HPLC测得断裂完成了95％以上。分子量的计算值和试验值为1003Da。实施例17C-末端三肽甘氨酸硫代酸酯和N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的Gly-Gly化学连接把一种三肽的肽片断硫代酸酯、1.6mg FGG-硫代酸酯和2mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.2ml6M，pH8.2的胍缓冲剂中，加入0.04ml硫酚，搅拌过夜后，反应定量地完成。连接产物的分子量的预期值为1169.4Da，测定值为1169.5Da.实施例18连接后，1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷基团的消去在-2℃下，用含有5％HF的对甲基苯酚处理实施例17的纯净连接产物1小时。蒸去HF后，用乙醚沉淀连接产物。用含有0.1％TFA的50％的水/乙腈浸取粗肽，喷射到HPLC上。主峰＞80％，表明是经过断裂的肽的预期分子量(预期质量为1003Da，测定值为1003Da)。实施例19C-末端组氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的His-Gly化学连接把4mg肽片断TBP-A1-67CαHis硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.1ml6M，pH8.2的胍缓冲剂和0.02ml硫酚中。搅拌过夜后，根据肽硫代酸酯的消耗计反应完成了87％。连接产物的预期分子量为9220Da，测定值为9220Da。实施例20连接后，1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巯基乙烷基团的除去把2mg经过H-G连接并且纯净的肽片断溶于0.95ml TFA和0.025ml水及0.025ml TIS中。1小时后，蒸去溶剂，向残留物中加入50％的水/乙腈溶液，把混合物冷冻干燥。通过HPLC测得断裂完成了90％。预期的分子量为9023Da，测定值为9024Da.实施例21通过扩展的天然的化学连接合成细胞色素把3mg细胞色素1-63的C-末端硫代酸酯(MW7349，0.4μmol)和1.5mg N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸细胞色素b562的残基64-106(MW4970，0.3μmol)溶于0.1ml含有0.002ml硫酚催化剂的6M，pH7的胍连接缓冲剂中，参见图5A。24小时后，向混合物中加入0.025ml2-巯基乙醇，持续反应45分钟，然后加入15mg TCEP。再搅拌30分钟后，把连接混合物装载到半制备性的HPLC中。在把漏出组分洗脱下来并对混合物脱盐后，通过把梯度倾斜到65％B来把连接混合物的所有组份都洗脱下来，收集在唯一的一个瓶子中。对脱盐后的物质进行的HPLC分析表明，根据C末端肽的消耗计连接完成了90％以上。HPLC显示了具有计算和预期的分子量11,946Da的两个主峰(非对映异构体)，参见图5B和6A。
细胞色素b562(1-106)的氨基酸序列如下所示ADLEDNMETL NDNLKVIEKA DNAAQVKDAL TKMRAAALDAQKATPPKLED KSPDSPEMKD FRHGFDILVG QIDDALKLANEGKVKEAQAA AEQLKTTRNA YHQKYR(SEQ ID NO1)分子量的计算值(平均同位素组成)为11780.3DaN-末端基团HC-末端基团游离酸MH+单同位素分子量＝11774.0088原子单位HPLC指标＝249.80MH+平均分子量＝11781.2781原子单位Bull & Breese值＝1.5360元素组成C508 H830 N147 O168 S3
用户规定的氨基酸残基B-HisDNP实施例22从连接后的细胞色素b562的残基1-106中除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷基团并且产生天然的蛋白质在除去1-(4甲氧基苯基)-2-巯基乙烷基团之前，把脱盐后的溶液冷冻干燥。在-2℃下，用含有5％苯甲醚的95％HF和1mmol半胱氨酸(121mg)对冷冻干燥的物质处理1小时。使用标准方法蒸去HF，然后加入100ml50％的缓冲剂B，把混合物冷冻干燥。然后使用半制备性的HPLC纯化混合物，得到2mg纯化的只有一个峰的天然的细胞色素1-106(纯化后，产率为56％)，分子量的计算值和测定值为11,780Da，参见图6B和7A。
还以同样的方式合成了野生型的细胞色素b562的类似物，命名为S1m7 cyt b562。S1m7 cyt b562突变体不同于野生型，它用一种硒代甲硫氨酸(甲硫氨酸的硫被其同族的硒替换)代替了7-位的甲硫氨酸。进行了圆二色性测定，表明在远缘野生型b562和远缘S1m7 b562中α-螺旋的含量都很高(数据没有显示出来)。ESMS也表明，远缘野生型b562和远缘S1m7 b562都具有预期的分子量(数据没有显示出来)。用血红素(血红素pH7 NaPi，过夜，室温)重建远缘蛋白质，通过离子交换FPLC(FPLC纯化Resource Q，Tris HCL pH8，NaCl梯度)纯化所得的蛋白质，例如参见图7B。已发现，经过血红素重建后的蛋白质的紫外-可见光谱与硫或硒对Fe的配位一致(数据没有显示出来)。还以同样的方式制备了一种含有等位的异量氨酸的非配位的cyt b562变异体。这样就使用扩展的天然的化学连接制得了合成的细胞色素，对它们的血红素活性位点进行了重建，并且通过生物物理方法完全进行了表征。因此，该实施例进一步表明，没有适用于原始的天然的化学连接方法的半胱氨酸的肽和蛋白质可以通过扩展的天然的化学连接方法和引入其中的非标准氨基酸制得。例如，已经对许多cyt b562突变体的折叠和反应性进行了研究，但是远缘非天然的轴向配位体还仍然没有开发出来。结合扩展的天然的化学连接，巨大数目的可得到的非天然氨基酸应当允许对这些蛋白质和其它蛋白质的性能进行系统性的协调。实施例23MCP1-35-赖氨酸-硫代酸酯与Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-肽的Lys-Gly化学连接把3mg MCP1-35赖氨酸C末端肽硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)2-巯基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.15ml6M，pH7的胍缓冲剂中，通过加入三乙胺和0.03ml硫酚调节到pH7.2。搅拌过夜后，连接完成了69％。40小时后，根据肽硫代酸酯的消耗计连接完成了76％。连接产物的预期分子量为4893Da，测定值为4893Da实施例24连接后，除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷基团把冷冻干燥的脱盐后的实施例23的粗产物(Lys-Gly连接)溶于1mg TFA、25μl乙二硫醇、50μl TIS中，然后加入150μl溴代三甲基硅烷。在室温下让反应进行2小时。在真空下蒸去挥发性组分，用6M，pH7.5的胍缓冲剂浸取残留的油状物。用氯仿萃取有机物质，HPLC显示不再有原料，因此，助剂基团已经成功地除去了。
天然序列的预期分子量为4726Da，而测定值为4725Da。实施例25对GSYRFL肽的连接进行的比较研究对实施例13-20和24的GSYRFL肽的5元重排连接进行了比较研究，如下列表V中所归纳的。
表V对GSYRFL肽的连接的研究结果
注意N-末端助剂I＝Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-SYRFL，而N-末端助剂II＝Nα-1-(2，4-甲氧基苯基)-2-巯基乙烷甘氨酸-SYRFL实施例26Boc甘氨酸N-1-(4′-甲氧基苯基)-2-(4′-甲基苄基硫基)乙烷的制备把2mmol，572mg 4′-甲氧基-2-(4′-甲基苄基硫基)苯乙酮和2mmol，139.5mg甘氨酸乙酯盐酸盐悬浮于15ml DCM中。缓慢加入6mmol，1g DIEA，在氮气氛下加入1ml四氯化钛(1M溶液)。在室温下持续反应2天。然后加入6mmol，0.4g氰基硼氢化钠在2.5ml无水甲醇中的溶液。TLC显示出一个大约40％的一种新产物的斑点，纯化后通过NMR鉴定为N-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷甘氨酸乙酯。
然后把1mmol 374mg N-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苄基硫基)乙烷甘氨酸乙酯溶于2ml THF中，向溶液中加入2mmol，83mg LiOH水合物。搅拌过夜后，该酯已经被完全水解。在真空下除去THF，用2ml DMF浸取产物，加入5mmol，1.1g重碳酸二丁酯，最后加入3mmol DIEA，0.45ml。反应过夜后，加入稀的盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取(三次)最终产物。
现在已经对本发明作了充分的说明，本领域技术人员将会明白，可以在不偏离所附的权利要求书的精神或保护范围的情况下对本发明作许多改变和改进。
序列表<110>格莱风科学公司Botti，PaoloBradburne，James A.
Kent，Stephen B.H.
Low，Donald W.<120>扩展的天然的化学连接<130>GRFN035/01 WO 03504.291<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<160>1<170>专利(版本2.1)<210>1<211>106<212>PRT<213>人类<400>1Ala Asp Leu Glu Asp Asn Met Glu Thr Leu Asn Asp Asn Leu Lys Val15 10 15Ile Glu Lys Ala Asp Asn Ala Ala Gln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys20 25 30Met Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Thr Pro Pro Lys Leu35 40 45Glu Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro Glu Met Lys Asp Phe Arg His Gly50 55 60Phe Asp Ile Leu Val Gly Gln Ile Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn65 70 75 80Glu Gly Lys Val Lys Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Leu Lys Thr
85 90 95Thr Arg Asn Ala Tyr His Gln Lys Tyr Arg100 10权利要求
1.下式的N-取代的酰胺化合物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1和J2独立地为具有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的该给电子基团。
2.权利要求1的N-取代的酰胺化合物，其中所说的化合物具有所说的式I。
3.权利要求2的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)选自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′包含可以相同或不同的给电子基团。
4.权利要求1的N-取代的酰胺化合物，其中所说的化合物具有所说的式II。
5.权利要求4的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)-C2(R2)C3(R3)选自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
6.权利要求1-5任意一项的N-取代的酰胺化合物，其中所说的取代的N是一个Nα-取代的酰胺。
7.权利要求3或5的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个强给电子基团。
8.权利要求7的N-取代的酰胺化合物，其中所说的强给电子基团选自甲氧基(-OCH3)、巯基(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
9.权利要求3或5的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个中等的给电子基团。
10.权利要求8的N-取代的酰胺化合物，其中所说的中等的给电子基团包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和异丙基(-CH2(CH3)3)。
11.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是具有一个或多个选择性地受保护的氨基酸侧链的肽或多肽，或者是这样的肽或多肽部分。
12.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种聚合物。
13.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种染料。
14.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种官能化的表面。
15.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一个连接体或可检测的标记物。
16.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J2是具有一个或多个选择性地受保护的氨基酸侧链的肽或多肽，或者是这样的肽或多肽部分。
17.权利要求1、2或4任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J2是一种聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分。
18.一种式HS-C2-C1(R1)-HN-J2(III)或式HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2(IV)的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇化合物，其中J1和J2独立地为含有一个或多个选择性地被保扩的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的给电子基团。
19.权利要求18的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的化合物具有式III。
20.权利要求19的酸稳定的N-取代的化合物，其中C1(R1)选自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
21.权利要求18的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的化合物具有所说的式IV。
22.权利要求21的酸稳定的N-取代的化合物，其中C3(R3)C2(R2)-C1(R1)选自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
23.权利要求18-22任一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的取代的N是一种Nα-取代的化合物。
24.权利要求20或22任一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中至少R1′，R3′和R5′中的一个包含一个强给电子基团。
25.权利要求24的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的强给电子基团选自甲氧基(OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
26.权利要求20或22任一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个中等的给电子基团。
27.权利要求26的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的中等的给电子基团包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和异丙基(-CH2(CH3)3)。
28.权利要求18、19或21任一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中J2是含有一个或多个选择性地受保护的氨基酸侧链的肽或多肽，或者是这样的肽或多肽部分。
29.权利要求18、19或21任一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中J2是一种聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分。
30.一种式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2(I)或式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)J2(II)的N-取代的酰胺化合物，其中J1和J2独立地为含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的该给电子基团；该酰胺化合物是通过把包含式J1-C(O)SR的α-羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种下式III或IV的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接的方法生产的HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III或HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的给电子基团。
31.权利要求30的N-取代的酰胺化合物，其中所说的酸稳定的N-取代的化合物具有式III。
32.权利要求31的N-取代的酰胺化合物，其中所说的酸稳定的N-取代的化合物的C1(R1)选自A、B和C。 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
33.权利要求30的N-取代的酰胺化合物，其中所说的化合物具有式IV。
34.权利要求33的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)-C2(R2)C3(R3)选自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
35.权利要求30-34的任意一项的N-取代的酰胺化合物，其中所说的取代的N是一种Nα-取代的化合物。
36.权利要求32或34的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个强给电子基团。
37.权利要求36的N-取代的酰胺化合物，其中强给电子基团选自甲氧基(OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
38.权利要求32或34的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个中等的给电子基团。
39.权利要求38的N-取代的酰胺化合物，其中所说的中等的给电子基团包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和异丙基(-CH2(CH3)3)。
40.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分。
41.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种聚合物。
42.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种染料。
43.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种官能化的表面。
44.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种连接体或可检测的标记物。
45.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分。
46.权利要求30、31或33任一项的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一种聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分。
47.一种式J1-C(O)-HN-J2(V)的化合物，其中J1和J2独立地为具有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；该化合物是通过下列方法生产的(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种下式III的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III其中R1是一种与C1共轭的给电子基团；从而形成一个下式的N-取代的酰胺键合的连接产物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 (I)，和(B)通过断裂N-C1键而从该N取代的酰胺键合的连接产物中除去C2链烷基或芳基硫醇。
48.一种式J1-C(O)-HN-J2(V)的化合物，其中J1和J2独立地为含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；该化合物是通过下列方法生产的(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种下式IV的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2IV其中R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的给电子基团；从而形成一个下式II的N-取代的酰胺键合的连接产物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)，和(B)通过断裂N-C1键而从所说的N取代的酰胺键合的连接产物中除去C3链烷基或芳基硫醇。
49.权利要求47的化合物，其中所说的酸稳定的N取代的化合物的C1(R1)选自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
50.权利要求48的化合物，其中所说的酸稳定的N取代的化合物的C3(R3)-C2(R2)C1(R1)选自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
51.权利要求47-50的任意一项的酸稳定的N-取代的化合物，其中所说的N-取代的化合物是一种Nα-取代的化合物。
52.权利要求49或50的化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个强给电子基团。
53.权利要求52的化合物，其中所说的强给电子基团选自甲氧基(OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
54.权利要求49或50的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个中等的给电子基团。
55.权利要求54的化合物，其中所说的中等的给电子基团包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和异丙基(-CH2(CH3)3)。
56.权利要求47或48的化合物，其中J1是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽。
57.权利要求47或48的化合物，其中J1是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的多肽。
58.权利要求47或48的化合物，其中J1是一种聚合物。
59.权利要求47或48的化合物，其中J1是一种染料。
60.权利要求47或48的化合物，其中J1是一种官能化的表面。
61，权利要求47或48的化合物，其中J1是一种连接体或可检测的标记物。
62.权利要求47或48的化合物，其中J2是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分。
63.权利要求47或48的化合物，其中J2是一种聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分。
64.一种生产式J1-C(O)-HN-J2(V)化合物的方法，其中J1和J2独立地为含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；其中所说的方法包括下列步骤(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酯的第一种组分与包含一种下式III的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接HS-C2-C1(R1)-HN-J2III其中R1是一种与C1共轭的给电子基团从而形成一个下式的N-取代的酰胺键合的连接产物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2I(B)通过断裂Nα-C1键而从所说的N-取代的酰胺键合的连接产物中除去C2链烷基或芳基硫醇。
65.一种生产式J1-C(O)-HN-J2(V)化合物的方法，其中J1和J2独立地为含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分；其中所说的方法包括下列步骤(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一种组分与包含一种下式IV的酸稳定的N-取代的C2或C3链氨基烷基或芳基硫醇的第二种组分连接HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中R1、R2和R3独立地为H或一种与C1共轭的给电子基团；条件是至少R1、R2和R3中的一个包含一个与C1共轭的给电子基团；从而形成一个下式的N-取代的酰胺键合的连接产物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)(B)通过断裂Nα-C1键而从所说的N取代的酰胺键合的连接产物中除去C3链烷基或芳基硫醇。
66.权利要求64的方法，其中所说的酸稳定的N-取代的化合物的C1(R1)选自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
67.权利要求48的方法，其中所说的酸稳定的N-取代的化合物的C3(R3)-C2(R2)C1(R1)选自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一个或多个包含一个可以相同或不同的给电子基团。
68.权利要求64-67的任意一项的方法，其中所说的N-取代的化合物是一种Nα-取代的化合物。
69.权利要求66或67的方法，其中至少R1′、R3′和R5′中的一个包含一个强给电子基团。
70.权利要求66的方法，其中所说的N-取代的化合物的所说的强给电子基团选自甲氧基(OCH3)、硫羟(-SH)、羟基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
71.权利要求66或67的方法，其中所说的N-取代的化合物的R1′、R3′和R5′中至少一个包含一个中等的给电子基团。
72.权利要求71的方法，其中所说的N-取代的化合物的所说的中等的给电子基团包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和异丙基(-CH2(CH3)3)。
73.权利要求66或67的方法，其中J1是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽的部分。
74.权利要求66或67的任意一项的方法，其中J1是一种聚合物。
75.权利要求66或67的方法，其中J1是一种染料。
76.权利要求66或67的任意一项的方法，其中J1是一种官能化的表面。
77，权利要求66或67的任意一项的方法，其中J1是一种连接体或可检测的标记物。
78.权利要求66或67的任意一项的方法，其中J2是一种含有一个或多个选择性地被保护的氨基酸侧链的肽或多肽或这样的肽或多肽部分。
79.权利要求66或67的任意一项的方法，其中J2是一种聚合物、染料、官化的表面、连接体或可检测的标记物或与肽的化学合成或扩展的天然的化学连接相容的其它化合物部分。
80.权利要求66或67的任意一项的方法，其中所说的化合物是在溶液中合成的。
81.权利要求66或67的任意一项的方法，其中所说的化合物是通过固定到一种固体载体上来合成的。
全文摘要
本发明针对用于对组分进行化学连接，从而得到一种在连接位点处具有N－取代的酰胺键的连接产物方法和组合物，其中组分包括含有一个羧基硫代酸酯。优选α－羧基硫代酸酯部分的第一种组分和含有一个N－取代的，优选Nα－取代的C2或C3的链烷基或芳基硫醇。本发明的反应物是化学选择性的，和烷基和芳基硫醇可以从连接产物中除去。除去烷基或芳基硫醇，在连接位点处产生一种天然的酰胺键。本发明的方法和组合物特别用于连接肽和多肽。本发明的连接体系可用于很多种分子，因而可用于生产肽、多肽和其它含有氨基酸的在连接位点处具有天然的酰胺键的聚合物。
文档编号C07K5/087GK1452632SQ01815351
公开日2003年10月29日 申请日期2001年9月7日 优先权日2000年9月8日
发明者P·博蒂, J·A·布拉德博尼, S·B·H·肯特, D·W·罗 申请人:格莱风治疗公司