聚合物修饰的合成的蛋白质类的制作方法

专利名称：聚合物修饰的合成的蛋白质类的制作方法
技术领域：
本发明涉及用聚合物，特别是糖基模拟聚合物来修饰生物活性合成肽，多肽和蛋白质，以提高它们的生物活性或药物动力学性质的方法和组合物。本发明还提供了这样的聚合物-修饰的肽，多肽和蛋白质的方法和用途。
相关申请交叉参考本申请是美国专利申请顺序号Nos.60/231,330(2000年9月8日申请)和60/236,377(2000年9月29日申请)的部分继续申请，这两件申请在这里全文并入本文作为参考。
背景技术：
过去30年来，医药方面的注意力越来越转向利用蛋白质作为治疗药物治疗疾病的可能性(参见例如，“Therapeutic Proteins1999”，Datamonitor plc，伦敦，1999)。大多数蛋白质治疗物质是以蛋白质的天然存在的动物或人形式为基础的(例如胰岛素，生长激素，红细胞生成素，白细胞介素-2等)，并且在重组DNA工程细菌或真核细胞中产生。遗憾的是，细菌细胞例如大肠杆菌中制备的重组蛋白质经常缺少翻译后修饰，而一般在蛋白质天然产生形式中发现翻译后修饰。没有这样的修饰则当对患者施用时会对蛋白质的药学性能有明显的负面影响。
糖基化作用是真核细胞常见翻译后修饰的一个例子，其涉及复杂的糖链与蛋白质的酶促连接。因为细菌表达系统中产生的重组蛋白质没有将蛋白质糖基化的能力，所以在需要糖基化形式或“糖蛋白”时使用真核表达系统例如植物，酵母，昆虫或哺乳动物细胞。制备重组糖蛋白的一个显著问题是得到的产物一般由不同糖基化形式的复杂混合物组成，这些不同糖基化形式可能具有大大不同的生理或药学性质。
然而，重组DNA技术已变成商业上生产很多多肽和蛋白质的主要方法，因为可以在细菌和其他宿主细胞中大量生产。重组蛋白质生产包括用编码期望的外源蛋白质的DNA转染或转化宿主细胞，并且在有利于该重组蛋白质表达的条件下培养细胞，大肠杆菌和酵母有力地用作宿主，因为它们可以生产高效价重组蛋白质(参见美国专利5756672)。
有关重组-DNA-编码的蛋白质的一般细菌表达公开过很多美国专利(参见，例如，美国专利4565785；4673641；4738921；4795706；4710473)。遗憾的是，重组DNA技术的应用还没有普遍成功。在某些条件下，细菌宿主中大量表达的某些异源蛋白在细胞内沉淀成密集聚集体，在反相显微镜下在细胞的限内区之内可见亮斑以识别之。这些沉淀的蛋白质的聚集体称作“折射体”，并且可以构成全体细胞蛋白质的重要部分(Brems等，Biochemistry(1985)247662)。
从这些折射体回收蛋白质存在很多问题，例如怎样从细胞材料和含有它们的蛋白质中分离细胞内包住的蛋白质，以及怎样回收生物活性形式的包函体蛋白。有关折射体的一般综述文章参见Marston，上文；Mitraki和King，Bio/Technology，7690(1989)；Marston和Hartley，Methods In Enzymol，182264-276(1990)；Wetzel，“蛋白质体内聚集细菌包函体和哺乳动物淀粉状蛋白”，在蛋白质药学稳定性蛋白质稳定作用降解的体内途径和策略，Ahern和Manning(编著)(Plenum Press，1991)；和Wetzel，“通过体内体外抑制聚集作用而增强蛋白质的折叠和稳定”，蛋白质工程-操作入门，Rees，A.R.等(编著)(IRL Press at Oxford University Press，Oxford，1991)。
完全通过化学合成还制备了用作研究试剂的蛋白质(参见，例如，Wilkin等，Curr.Opinion Biotech.(1999)9412-426)。该方法包括通过各个氨基酸一步一步偶联的蛋白质的化学合成，或者利用肽或多肽片段的分别合成后连接这些片段的集合策略，包括这样的片段的化学连接，以产生全长产物(参见，例如，Dawson等，Ann.Rev.Biochem(2000)69923-960)。在某些情况下可以利用化学合成来制备用简单低分子量糖修饰的小糖蛋白(Shin等，J.Am.Chem.Soc.(1999)12111684-11689)。在其他情况下，化学制备了带有检测标记等的蛋白质(Bolin等，FEBS Letters(1999)451125-131)。遗憾的是，与它们的重组产生的对应物相比，这样的标记蛋白提供极少或不提供治疗利益。但是，通过化学合成制备了表现出治疗潜力的少量蛋白质，关键在于通过利用对靶蛋白质的药核区的小分子型变化提高药效(美国专利6168784)。对治疗药物来说，药效是重要的一方面。其他因素对蛋白质治疗仍存在问题。
开发治疗上有用的蛋白质药物的努力长期苦于体内施用时推定的候选药物的不期望的生物活性，生物利用度和生物动力学(例如清除时间等)。严重限制蛋白质和多肽的应用，特别是作为治疗物质的主要因素是这样的事实，即这些化合物经常激发循环系统中的免疫原反应(参见美国专利4179337(Davis等))。该作用得到两个次结果的一个或两个。第一个是通过激发抗体而对多肽的破坏，第二个更严重，出现变应性反应。例如，相信胰岛素的抗体介导的破坏是胰岛素在人循环系统中极短滞留时间的原因。在酶的情况下，不只是有多肽破坏问题和接下来的生理活性的不存在，而且还有最不期望的变应性反应的激发。相反，某些蛋白质，例如凝血因子，生长因子和细胞因子等，可以激发在体内施用它们时不利地延长的生物半寿期。
改良用作治疗物质的蛋白质的一个途径涉及用水溶性聚合物将蛋白质衍生物化。提出这样的偶联是改善施用的蛋白质的体内循环寿命，水溶性或抗原性(参见美国专利4179337(Davis等))。为此目的使用很多不同的水溶性聚合物和连接化学过程，例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)等。聚乙二醇(“PEG”)是在获得治疗有用蛋白质的努力中使用的一种这样的化学部分(Zalipsky，S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6150-165；Mehvar，R.(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.(2000)3(1)125-136))。其主链(CH2CH2O)n是柔性的，两亲性的，不易受蛋白酶的影响，没有免疫原性。还证明了PEG连接保护蛋白质不被蛋白水解(Blomhoff，H.K.等，Biochim Biophys Acta(1983)757202-208)。其也可以改善蛋白质的其他物理化学性质。
例如开发出了用于治疗严重并发的免疫缺陷疾病(SCID)的牛pegademase(Adagen)，一种与PEG聚合物连接的腺苷脱氨酶制剂；临床试验中使用了用于治疗头损伤的带有连接的PEG部分的超氧化物歧化酶；对带有连接的PEG部分的α干扰素进行了治疗肝炎的试验。描述过聚乙二醇化的IL-6(参见EP0442724，和美国专利5264209)。EP0154316报道淋巴因子与聚乙二醇的醛反应。欧洲专利公开出版物EP0401384描述了用于制备连接有聚乙二醇分子的粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)。EP0473268还报道了修饰的G-CSF及其类似物，阐述使用与水溶性聚合物颗粒例如聚乙二醇共价偶联的各种G-CSF和衍生物。美国专利5880255总结了很多用PEG链修饰的蛋白质。
利用各种各样的方法来使聚合物部分例如PEG和相关的聚合物连接蛋白质上的反应基团(参见美国专利4179337(Davis等)，和美国专利4002531(Royer))。有关综述参见Abuchowski等，″酶作为药物″(J.S.Holcerberg和J.Roberts，编著，pp.367-383(1981)和Zalipsky，S.(生物偶联化学(Bioconjugate Chemistry)(1995)6150-165。也讨论过PEG和其他聚合物修饰蛋白质的应用，Cheng，T.-L.等，生物偶联化学(1999)10520-528；Belcheva，N.等，生物偶联化学(1999)10932-937；Bettinger，T.等，生物偶联化学(1998)9842-846；Huang，S.-Y.等，生物偶联化学(1998)9612-617；Xu，B.等，Langmuir(1997)132447-2456；Schwarz，J.B.等，J.Amer.Chem.Soc.(1999)1212662-2673；Reuter，J.D.等，生物偶联化学(1999)10271-278；Chan，T.-H.等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)(1997)623500-3504。蛋白质中典型的连接位点包括伯氨基，例如赖氨酸残基上的那些或者在N-末端处，硫醇基，例如半胱氨酸侧链上的那些，和羧基例如谷氨酸或天冬氨酸上的那些或者在C-末端。一些最常见的连接位点是连接糖蛋白的糖残基，半胱氨酸或者连接N-末端和靶蛋白的赖氨酸。
虽然描述过很多不同的方法用于聚合物与蛋白质的偶联，但是偶联过程并非不复杂。一定要小心限制由于偶联反应引起的生物活性的丧失。例如，一般使用折叠或再折叠蛋白来最大限度地减少连接位点的数目。然而，如果与靶蛋白或多肽连接太多的活性聚合物，则生物活性会严重降低或消失。类似地，如果使用错误的连接聚合物和蛋白质的连接基团或者不足量聚合物连接靶物，则得到的偶联物的治疗价值可能有限，并且可能证明循环寿命的延长不足以补偿其生物活性的损失。由于通过修饰聚合物而保护蛋白质活性位点也能产生问题。该问题难以避免，因为聚合物和蛋白质一般在以溶液为基础的反应中连接。有人曾建议用象磷酸吡哆醛这样的材料预先保护活性位点，但是结果不一致(参见美国专利4,179,337(Davis等))。这些问题在低分子量蛋白质和肽的情况下特别棘手，在这些情况下经常极少有连接位点不与生物活性有关。
例如，常规技术是水溶性聚合物与靶蛋白质的伯胺连接(例如，N-末端氨基和赖氨酸的ε氨基)。也有人使用巯基-反应聚合物偶联物连接聚合物和半胱氨酸的巯基侧链。两种方法都存在一个值得注意的问题，即大多数蛋白质包含多肽主链各个区分布的这样的反应基团的多个拷贝，其在确定蛋白质的活性，折叠，重折叠和稳定性中起着重要的作用。因此尽管被广泛使用，这样的方法苦于蛋白质生物活性或多或少的不完全的或不期望的降低，并且通常复杂的混合物难以分离和鉴定(Delgada等，Pharmaceutical Sciences(1997)359-66)。
在减少随机连接的尝试中，制备了这样的蛋白质，其中去除天然赖氨酸并结合在聚合物连接的期望的位点加入赖氨酸(美国专利No4,904,584)。例如以该方法修饰了G-CSF和IL-2。进行了避免随机连接的其他尝试来制备蛋白质，其中去除天然半胱氨酸并结合在聚合物连接的期望的位点加入半胱氨酸，或者加入半胱氨酸而不去除如果存在的天然半胱氨酸(EP 0 668 353)。例如，用这种方法制备了G-CSF、IL-3和EPO。而这样的半胱氨酸或赖氨酸理论上允许定向聚合物连接，但是仍然没有这样的保证，即能够以控制方式修饰所有的选择位点。
不能用带有相同或相似反应官能团的侧链定点修饰含有多个氨基酸的蛋白质，最近的研究集中于修饰蛋白质的氨基或羧基末端。氨基或羧基末端的修饰依赖于对特异修饰这些位点的一些化学偶联技术的能力(WO 90/02136和WO 90/02135)。例如，利用该项技术使PEG链与G-CSF和趋化因子(chemokine)IL-8的N-末端残基连接(Gaertner等，生物偶联化学(Bioconjug.Chem.)(1996)7(1)38-44；和WO96/41813)。但是，N-或C-末端修饰一般降低蛋白质活性(参见例如，美国专利5,985,265，讨论了PEG与G-CSF的N-末端和赖氨酸侧链的连接)。除了用水溶性聚合物修饰蛋白质的缺点之外，PEG化作用和其他水溶性聚合物与蛋白质的连接有待继续。例如，美国专利5951974和6042822描述了PEG与IF-α中的组氨酸的连接。美国专利5595732描述了PEG与α干扰素中的赖氨酸的连接。也描述过PEG与红细胞生成素(EPO)的糖链和内部氨基酸例如赖氨酸(EP 0 605 963和WO 00/32772)，和N-末端(美国专利6,077,939和WO 00/32772)的连接。
另一个问题是所有上面讨论的聚合物是高度不同源的，这使得聚合物修饰的蛋白质的混合物的分析表征和纯化困难(Delgada等，Pharmaceutical Sciences(1997)359-66)例如，用来制备PEG或PEG-基链，甚至相对十分低的分子量例如3400的那些的技术，包括不好控制的聚合步骤，这导致链长是大约平均值的制备；即包括(CH2CH2O)n聚合物制备，其中n不是分散值而是一个大约平均值的范围。得到的衍生化蛋白质的不均匀性常常与一些性质相关，而这些性质人们不易鉴定更不易分离。尽管可以认为多肽加成物的使用原理上提供了可能的溶液，但是多肽的使用是不利的，因为它们容易蛋白水解裂解并且使得衍生化的蛋白质呈免疫原性。
然而，遗憾的是，目前用于治疗用途的所有的蛋白质都是从重组DNA技术衍生的这一事实使得鉴定和使用合适的聚合物的问题更为严重。重组DNA技术的应用严重限制性能增强部分和重组产生的蛋白质之间形成的键合的类型和特异性。这首先因为只有非常有限数目的适合键合的官能团，其次一般在修饰的蛋白质中有反应官能团的几个拷贝，因此排除修饰的任何特异性。例如，已经证明超氧化物歧化酶与PEG的非选择性偶联的情况，几种修饰的酶的级分是完全失活的(P.McGoff等，Chem.Pharm.Bull.(1988)363079-3091)。还有，如果随机连接不同数目的这样的部分，则不能精确地预测治疗性蛋白质的药物动力学，使得剂量成为大问题。没有连接控制可以进一步导致(a)降低的药效，(b)分离衍生物的大量混合物的详细纯化方案的需要和(c)修饰部分的可能的不稳定结合。本领域公知的几种键合，例如tresylchloride-基键合也已知是免疫原性的。
因此为了改善循环半寿期，减少蛋白水解和免疫原性并且改善生物学产生的蛋白质的其他性质性，可以连接水溶性聚合物例如PEG，但是附带结果带来以控制方式连接他们的困难和使用者确定的精确性的困难。还有，已知因为以精确使用者确定的位点连接聚合物的有限成功，关于一般来说可用于蛋白质的连接的优选位点知之甚少。另外，因为连接的随机性质，和目前用于这样的目的的PEG和其他水溶性聚合物的杂分散性质，PEG-蛋白质偶联物的纯化和分析鉴定是困难的。因此可重复连接和聚合物不均匀性的不好控制的联合问题严重妨碍了聚合物修饰的蛋白质作为治疗物质的常规方法(迄今为止只有少数用于治疗用途，尽管在二十世纪七十年代早期它就出现了)。
因此，存在对于与重组DNA技术截然不同的生成生物活性蛋白质的方法的需要，并且它可以用于形成能聚合物修饰的蛋白质。还存在对于可以用来生成衍生化蛋白质的优选的聚合物的需要，所述衍生化蛋白质具有确定结构的聚合物加成物而不是不同长度链的混合物。也需要可以用来生成带有具有定做来模拟期望的天然蛋白质的性质的结构的聚合物加成物的衍生化蛋白质的聚合物。此外，存在对于对很多蛋白质一般适用的衍生化蛋白质的需要。本发明满足这些和其他需要。
发明概述本发明涉及聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质，含有它们的药物组合物和它们的制备方法和用途。本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质全部或部分通过化学合成制备，因此大大不同于生物学制备的蛋白质。
更详细地，本发明提供具有大于大约25千道尔顿(“kDa”)的单体分子量的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。本发明进一步提供具有一个或多个不规则氨基酸残基的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。本发明特别提供具有模拟与核糖体特异性的蛋白质例如天然哺乳动物蛋白质(例如人，猴，牛，鼠，猪，绵羊，或马，鸟或鱼蛋白质)相关的生物活性的的生物活性的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。本发明更特别提供具有模拟生物活性相关核糖体特异性的蛋白质的生物活性的这种聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质，所述核糖体特异性的蛋白质选自蛋白质受体或者其片段，蛋白质受体配体或者其片段，和细胞因子。
在优选的实施方案中，本发明涉及下式的分子同质聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质蛋白质-Un-s1-B-s2-聚合物-s3-J*
其中蛋白质包括核糖体特异性蛋白质的多肽链，其中多肽链包括通过一个或多个化学连接位点共价键合的一个或多个不重叠的肽片段，U是与一个或多个不重叠的肽片段的一个或多个氨基酸的侧链n的相互反应独特官能团共价键合的独特官能团的残基，其中n是1-6的不连续的整数，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是当存在B时可以是相同或不同的基本上非抗原性水溶性聚合物，J*是在生理条件下具有选自负电荷，正电荷和中性的净电荷的侧基的残基，并且其中s1，s2和s3是可以是相同或不同的并且可以分别存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。优选的本发明分子同质聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质是具有大于25kDa的单体分子量的单分散性的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有包括核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列的多肽链的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质，其中多肽链具有与之连接的一个或多个水溶性聚合物。在更优选的实施方案中，在相应于核糖体特异性糖蛋白的糖基化位点的多肽链的一个或多个位点共价连接一个或多个水溶性聚合物。优选的水溶性聚合物是聚氧化烯，聚酰胺氧化烯和糖基模拟水溶性聚合物的其衍生物。最优选的是包括细胞因子糖蛋白的多肽链的聚合物修饰的合成蛋白质。
本发明进一步涉及含有本发明这样的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的药物组合物。本发明进一步提供治疗人疾病或症状的方法，该方法包含对需要这样的治疗的个体施用有效量的含有一种或多种本发明的这样的药物组合物的药物组合物。
本发明还涉及本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的制备方法。制备本发明合成的生物活性蛋白质的优选的方法包括化学连接包括聚合物-修饰的合成的蛋白质的多肽链的非重叠氨基酸序列的肽片段，其中一个或多个用于连接的肽片段具有在使用者确定的预先选择的位点处与之连接的水溶性聚合物。然后聚合物修饰的多肽链可以折叠产生本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
制备本发明合成的生物活性蛋白质的另一个优选的方法包括化学连接包括本发明合成的生物活性的聚合物修饰的蛋白质的多肽链的非重叠氨基酸序列的肽片段，并且在其一个或多个化学连接位点使一个或多个水溶性聚合物与氨基酸侧链连接。然后聚合物修饰的多肽链可以折叠产生本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
本发明还涉及制备聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的方法，该方法包含(1)化学连接包括合成的生物活性蛋白质的多肽链的非重叠氨基酸序列的肽片段，以生成相应于合成的生物活性蛋白质的全长多肽链，其中至少一个肽片段包括具有第一个化学选择性官能团的不规则氨基酸，(2)折叠多肽链，和(3)与之连接包括与第一个化学选择性基团特异性相互反应的第二个化学选择性基团的水溶性聚合物。
本发明另一个实施方案涉及式U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*的分子同质糖基模拟的水溶性聚合物，其中U是独特官能团残基，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是具有大于大约5000道尔顿的分子量的式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-50的不连续整数，其中X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的基本上非抗原性的水溶性重复单元，J*是在生理条件下具有选自负电荷，正电荷和中性的净电荷的基本上非抗原性的侧基的残基，并且其中s1，s2和s3是可以是相同或不同的并且各自可以存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。
本发明进一步涉及式U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*的分子同质的水溶性聚合物，其中U是独特官能团残基，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是具有大于大约5000道尔顿的分子量的式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-50的不连续整数，其中X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的基本上非抗原性的水溶性重复单元，J*是在生理条件下具有选自负电荷，正电荷和中性的净电荷的基本上非抗原性的侧基的残基，并且其中s1，s2和s3是可以是相同或不同的并且各自可以存在或不存在的间隔基团或连接基团部分，并且如果存在则优选包括1-18个碳原子。
本发明特别涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中U是选自丙烯酸酯，醛，酮，氨基氧基，胺，羧酸，酯，硫酯，卤素，硫醇，氰基乙酸酯，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，环氧化物，酰肼，叠氮化物，异氰酸酯，马来酰亚胺，甲基丙烯酸酯，硝基苯基碳酸酯，正吡啶基(orthopyridyl)二硫化物，硅烷，巯基，乙烯基砜，戊二酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸，tresylate和可活化的官能团的官能团的残基。
本发明特别涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中U是能形成选自碳酸酯，酯，尿烷，原酸酯，酰胺，胺，肟，酰亚胺，脲，硫脲，硫醚，硫代尿烷，硫酯，醚，噻唑烷(thaizolidine)，腙，和噁唑烷的键的官能团的残基，特别是其中U被保护的这样的聚合物。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中所述聚合物具有大于大约10000Da，更优选大于大约15000Da的分子量。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中B包括四个或多个臂，和/或其中B包括通过一个或多个酰胺键与s2或聚合物连接的支化核心，和/或其中B包括通过酰胺键与聚合物连接的支化核心。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷；和/或其中X，Y，或X和Y选自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中n1是1-6的不连续整数，n2是2-50的不连续整数，和/或其中X或Y之一选自苯基，C1-C10亚烷基部分，C1-C10烷基，含有杂原子的苯基，含有杂原子的C1-C10亚烷基部分，含有杂原子的C1-C10烷基，和它们的组合。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中X是-(CH2-CH2)-，或-X’-NH-或-NH-X’-。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)n-，其中n是6-36；或者-Y’-NH-或-NH-Y’-，特别是其中X’和Y’中至少一个包括其中n是2-50的式(-CH2-CH2-O-)n或(O-CH2-CH2-)n的聚氧化乙烯。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中J*是被保护的，或者包括(i)生理条件下具有净中性电荷的非可离子化(ionizable)基团，或(ii)生理条件下具有净正电荷的可离子化基团，或(iii)生理条件下具有净负电荷的可离子化基团。
本发明进一步涉及这样的分子同质水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物是单分散性的。
附图的简要描述

图1A-1E图解说明本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的制备方法。
图2A-2C图解说明本发明的合成的生物活性蛋白质的制备方法。
图3A-3B图解说明多片段连接方法，包括三个或多个不重叠的肽片段的化学连接，即至少一个片段是相应于最终全长连接产物的中间片段。
图4A-4C详细说明得到的侧链硫醇的天然化学连接和化学修饰。
图5A-5B描述产生本发明的水溶性聚合物U-B-聚合物-J*的支化核心(B)和独特的化学选择性官能团(U)的固相方法。
图6A-6D描述产生用于接着与U-B核心连接的本发明优选的基本上非抗原性的水溶性聚酰胺聚合物-J*成分的固相方法。
图7描述U-B成分与聚合物-J*成分偶联产生式U-B-聚合物-J*的本发明优选的合成聚合物构建体的方法。
图8描述水溶性聚合物与可用于本发明的生物活性合成的蛋白质的连接和制备的肽片段的精确连接的另一条途径。
图9详细说明制备本发明的合成的生物活性蛋白质的整套方法。
图10描述优选类型的合成的红细胞生成刺激蛋白质的基本结构。pPEG＝″精密PEG″。
图11说明具有重新安置的氨基和羧基末端的循环变更的SEP类似物的一般结构。
图12说明合成的生物活性GCSF蛋白质的基本结构。在该图中，“J”表示具有疏水性侧链的非天然编码残基。
图13说明优选的合成RANTES类似物的结构。在该图中，NNY＝壬酰基，X＝具有疏水性侧链的非天然编码的氨基酸，并且FA＝脂肪酸。
图14说明优选的水溶性聚合物和其各种直链或支链构建体的结构。
图15图解说明支链pPEG聚合物的生成。
图16说明称为SEP1-L30的合成的细胞因子的合成，它是根据实施例2描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图17说明称为SEP1-L30的合成的细胞因子，它是根据实施例2描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图18说明称为SEP1-L26的合成的细胞因子，它是根据实施例3描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图19图示说明与称为SEP1-B50的合成的细胞因子连接的优选的支链水溶性聚合物的形成，它是根据实施例4描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图20说明称为SEP1-B50的合成的细胞因子，它是根据实施例4描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图21说明称为SEP3-L42的合成的细胞因子的合成，它是根据实施例5描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图22说明称为SEP3-L42的合成的细胞因子，它是根据实施例5描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图23说明与称为SEP1-B51的合成的细胞因子连接的优选的水溶性聚合物的合成，它是根据实施例7描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图24说明称为SEP1-B51的合成的细胞因子，它是根据实施例7描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图25说明与称为SEP1-B52的合成的细胞因子连接的优选的水溶性聚合物的合成，它是根据实施例8描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图26说明称为SEP1-B52的合成的细胞因子，它是根据实施例8描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图27说明根据实施例2-5和7-8描述制备的人EPO的精确聚合物修饰的合成的类似物的代表性分析数据。如所示的，代表性等电点聚焦凝胶(IEF)和非还原性SDS-PAGE凝胶证明折叠的纯化的SEP1-B51的相对单体分子量。
图28说明SEP化合物SEP0，SEP1-L26，SEP1-L30，SEP1-B50，SEP1-B51和SEP3-L42的因子依赖性细胞系的体外活性。
图29说明代表性药物动力学曲线，对以小时表示的时间比较SEP3-L42和SEP1-B50以纳克/毫升(ng/ml)表示的血浆浓度。
图30说明通过对SEP1-B51和低氧血大鼠模型CHO-细胞(″rhEPO″)中产生的重组糖基化人红细胞生成素的72-小时血红细胞(RBC)-59Fe摄取(作为剂量的％)测定的体内活性的线性回归分析。
图31说明大鼠清除率的代表性药物动力学曲线，施用单一IV剂量的5微克/千克的各种化合物之后对小时表示的时间比较SEP1-B51和rhEPO的以ng/ml表示的血浆浓度。
图32说明称为RANTES G1755-01的合成的趋化因子，它是根据实施例18描述制备的RANTES的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图33说明称为RANTES G1755的合成的趋化因子，它是根据实施例19描述制备的RANTES的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图34说明称为RANTES G1805的合成的趋化因子，它是根据实施例20描述制备的RANTES的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图35说明称为RANTES G1806的合成的趋化因子，它是根据实施例21描述制备的RANTES的精确聚合物修饰的合成的类似物。
图36说明实施例18-21中制备的合成的趋化因子类似物的代表性分析数据。如图所示，还原(R)和非还原(N)条件下，代表性的SDS-PAGE凝胶比较野生型(Wt)RANTES的相对分子量与合成的趋化因子类似物RANTES G1806的相对分子量。
图37说明大鼠清除率的药物动力学曲线，施用单一IV剂量的等摩尔量/千克(kg)各种动物重量的各种化合物之后，对分钟表示的时间比较合成的Rantes类似物G1755，G1806，和G1805的以皮克/毫升(pg/ml)表示的血浆浓度。
图38说明循环中更新的聚合物修饰的SEP构建体。
优选实施方案的描述本发明涉及聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质，制备方法和应用。本发明还涉及糖基模拟水溶性聚酰胺聚合物。
I.本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质尽管先前有人描述过聚合物修饰的蛋白质，但是本发明可能的聚合物-修饰作用的性质和方式大大不同于现有技术。例如，全部化学合成本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。另外，在一个或多个特定的使用者选择和使用者确定的位点用水溶性聚合物修饰本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
此外，本发明中蛋白质的合成制备使得人们确认在制备中每一个分子的每一个使用者选择和使用者确定的位点存在这样的修饰作用。合成的这样的一致性和控制将本发明与使得利用现有技术方法的随机修饰作用显著区别开来。显著地，本发明使人设计合成蛋白，其中可以将任何不关键的残基衍生物化以包含聚合物加成物。此外，对于每一个使用者选择和使用者确定的位点，使用者可以确定精确的键合(酰胺，硫酯，硫醚、肟等)，通过该键，这样的加成物与多肽或蛋白质主链键合。另外，期望在特定位点存在的特定聚合物加成物可以是不同的和可控的，这样获得终产物，其中每一个蛋白质或多肽精确地在相同的衍生化位点精确包含相同的衍生化加成物。因此，本发明能够生成聚合物-修饰的多肽和蛋白质的均匀制备产物。
除了提供水溶性聚合物可以键合的连接位点的不同位置和数目的方法之外，本发明使人得以改变键合的聚合物的性质。可以在任何使用者选择和使用者确定的特定的位点插入的聚合物加成物可以是任何确定的长度。同样，与本发明的方法相一致，在不同位点可以使用不同长度的聚合物。因此，在一个实施方案中，本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质可以是用水溶性聚合物加成物一处或多处修饰的。在特定多肽或蛋白质引入一个以上聚合物加成物的情况下，使用的聚合物可以是“单特异性的”，“多特异性的”，“均匀特异性的”或“分散特异性的”。如这里使用的，“单特异性的”意指用单一种类的聚合物修饰多肽或蛋白质。相反，术语“多特异性的”意指用一种以上聚合物修饰多肽或蛋白质。据说如果在多肽或蛋白质的各个修饰位点存在相同的单一品种的聚合物，则这样的多特异性的多肽或蛋白质是“均匀特异性的”。相反，如果在多肽或蛋白质的修饰位点修饰有不同品种的聚合物，则这样的多特异性的多肽或蛋白质是“分散特异性的”。
此外，可以在使用者确定的位点中使用者选择的每一位点变化聚合物加成物的线性或支化度程度。因此聚合物加成物可以是线性的，支化的，或均匀支化的。术语“均匀支化”意指在特定位点聚合物的所有的支化具有相同的结构和长度。正如我们所期望的，本发明使得人们独立地变化任何各自支化的长度，以及这样的支化点上存在的聚合物的结构。
总之，本发明使得人们确定(1)位置和(2)多肽或蛋白质主链中聚合物修饰的使用者选择和使用者确定的位点的频率，以及控制(3)各个这样的位点处存在的支化的(3)长度，(4)种类和(5)程度。另外，关于具有多个聚合物修饰的多肽和蛋白质，本发明使得人们独立地确定对于每一个位点的上面确定的5个变量的每一个。此外，关于具有多个支化聚合物修饰的多肽和蛋白质，本发明使得人们独立地确定对于每一个支化位点的上面确定的5个变量的每一个。这对于合成具有存在任何或所有的20种遗传编码的氨基酸侧链的多个拷贝而且没有不期望的聚合物连接的精确的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的均匀组合物是可能的。
因此，本发明在聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质特别是细胞因子，生长因子等的靶受体的设计，合成和使用中提供了极大的灵活性。例如，本发明的合成的生物活性蛋白质的氨基酸序列可以包括相对于其以之为基础的遗传编码蛋白质的氨基酸序列的一处或多处缺失，插入或取代。所述氨基酸序列可以被一个或多个不规则氨基酸取代，所述不规则氨基酸是例如假氨基酸和/或携带非天然侧链等的其他氨基酸，例如经修饰而带有用于与其连接水溶性聚合物加成物的特异化学选择性官能团的氨基酸。因此，水溶性聚合物可以通过不规则氨基酸或者遗传编码氨基酸来连接。水溶性聚合物可以是线性或支化的，并且其可以有包括例如羧酸，脂族，酰胺或胺的化学部分的末端基团。此外，水溶性聚合物可以是单分散性的，即其可以制备成包括精确确定的结构和组成的单一分子种类。因此，可以设计水溶性聚合物，使其修饰的靶蛋白具有精确程度的半寿期，免疫原性，效力，贮存稳定性，剂量，送递能力等。
在优选的实施方案中，本发明涉及分子同质的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。这些蛋白质具有下式蛋白质-Un-s1-B-s2-聚合物-s3-J*在该结构式中，蛋白质包括核糖体特异性蛋白质的多肽链，所述多肽链包括通过一个或多个化学连接位点共价键合的一个或多个不重叠的肽片段。
所谓“核糖体特异性蛋白质”意指在细胞中核糖体产生的蛋白质。在优选的实施方案中，聚合物修饰的多肽链具有模拟与这样的核糖体特异性蛋白质例如天然哺乳动物蛋白质(例如人，猴，牛，鼠，猪，绵羊，或马，鸟或鱼蛋白质)相关的生物活性的生物活性。更优选地是模拟核糖体特异性蛋白质相关的生物活性的生物活性，所述核糖体特异性的蛋白质选自蛋白质受体或者其片段，蛋白质受体配体或者其片段，和细胞因子。核糖体特异性蛋白质的生物活性多肽链包括新的和从各种基因或蛋白质数据库可获得的那些多肽链。这样的数据库的例子包括但不限于GeneBank(Benson等，Nucleic AcidsRes(1998)26(1)1-7；美国国家生物技术信息中心，国家医药图书馆，国家健康研究中心，Bethesda，MD，USA)，TIGR Database(基因组研究中心，Rockville，MD，USA)，Protein Data Bank(Brookhaven国家实验室，USA)，ExPASy和Swiss-Protein数据库(瑞士生物信息研究所，Genève，瑞士)。最优选的核糖体特异性蛋白质是细胞因子，其多肽链和它们的特异性氨基酸序列是公知的(参见，例如，“细胞因子手册”，第三版，A.Thomas编著，Associated Press，1998；“细胞因子”，A.Mire-Sluis和R.Thorpe编著，科学出版社，1998；和“细胞因子索引”，第一卷，配体，细胞因子和宿主防御的其他介体概要，J.J.Oppendheim和M.Feldmann编著，科学出版社，2001))。
所谓″化学连接位点″意指第一个肽或多肽的N-末端氨基酸和第二个肽或多肽的C-末端氨基酸，它们之间通过化学连接形成或者能够形成不可逆转的共价键。如这里使用的，″化学连接″指涉及两个化学部分共价连接的化学选择性反应，所述每个化学部分带有相互反应的官能团，该官能团能特异性彼此形成不可逆共价键。化学连接包括共价连接(1)带有特异性反应C-末端基团的第一个肽或多肽和(2)带有特异性反应N-末端基团的第二个肽或多肽，其中C-末端和N-末端反应基团之间形成不可逆共价键。特别地，化学连接包括可以适用没有保护的肽片段的连接的任何化学选择性反应化学。
U是与一个或多个非重叠肽片段的一个或多个氨基酸的侧链n的相互反应特异性官能团共价键合的特异性官能团残基，其中n是1-6的不连续整数。最优选地，侧链n是1-4的不连续整数。这里使用的术语″氨基酸″意指包括20种遗传编码氨基酸，自然界发现的罕见的或不常见的氨基酸，和任何非天然存在的氨基酸，例如不规则氨基酸；在肽，多肽或蛋白质的上下文中有时指作氨基酸残基。U和侧链n的优选实施方案是特异性相互反应基团形成的共价键，其中这样的键选自肟，酰胺，胺，尿烷，醚，硫醚，酯，酰肼，噁唑烷，噻唑烷，硫醚，醚和酯。最优选的U和n键是其中U通过化学连接形成的选自酰胺，肟，硫酯，腙，噻唑烷，噁唑烷的键与侧链n共价键合的U和n键。
B是具有可以相同或不同的并且可以存在或不存在的三个或多个臂的支化核心。最优选地，B是存在的并且包括三个或多个臂，甚至更优选四个或多个臂。特别地，B的一个臂连接U(任选地通过间隔基团或连接基团s1)，B的第二个臂连接聚合物(任选地通过间隔基团或连接基团s2)。有利的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质是其中B部分的至少一个支化臂包括选自肟，酰胺，胺，尿烷，硫醚，酯，酰肼，噁唑烷和噻唑烷的键的残基。本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的优选的支化基团B包括选自氨基，羧酸酯和混合的氨基-羧酸酯的支化核心。优选的氨基支化核心包括赖氨酸，优选羧酸酯支化核心包括谷氨酸或天冬氨酸，优选的混合氨基-羧酸酯支化核心包括γ-谷氨酸或者其衍生物。
聚合物成分是在B存在的情况下可以是相同或不同的基本上没有抗原性的水溶性聚合物。所谓“水溶性聚合物”意指在水中可溶解并且具有大于大约1,000道尔顿原子分子量的基本上没有抗原性的聚合物。所述聚合物优选具有大于1,000道尔顿，更优选大约20,000-500,000道尔顿，最优选大约40,000-300,000道尔顿的有效流体动力学分子量。所谓″有效流体动力学分子量″意指根据以水为基础的大小排阻色谱(SEC)测定的聚合物链的有效水-溶剂化物大小。当所述水溶性聚合物包含具有聚氧化烯重复单元例如环氧乙烷重复单元的聚合物链时，优选的是各条链具有大约200至大约80,000Da之间，优选大约1500至大约42,000Da之间的原子分子量，2,000至大约20,000Da是最优选的。除非具体说明，否则分子量意指原子分子量。
聚合物组分可以具有很宽的分子量和聚合物亚单元。这些亚单元可以包括生物聚合物、合成聚合物或者它们的组合。这样的水溶性聚合物的例子包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括葡聚糖硫酸盐，P-氨基交联糊精，和羧甲基糊精，纤维素和纤维素衍生物，包括甲基纤维素和羧甲基纤维素，淀粉和糊精，和淀粉的衍生物和水解产物(hydroylactes)，聚亚烷基二醇及其衍生物，包括聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇，聚乙二醇均聚物，聚丙二醇均聚物，乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述均聚物和共聚物是未取代的或者在一个末端取代有烷基，肝素和肝素片段，聚乙烯醇和聚乙烯基乙基醚，聚乙烯基吡咯烷酮，天冬酰胺，和聚氧乙基化多元醇，葡聚糖和葡聚糖衍生物，糊精和糊精衍生物。要领会也包括具体提到的水溶性聚合物的各种衍生物。
例如上面描述的那些水溶性聚合物是公知的，特别是以聚氧化烯为基础的聚合物，例如聚乙二醇“PEG”(参见，例如，″聚(乙二醇)化学生物技术和生物药物应用″，J.M.Harris，编著，Plenum Press，纽约，NY(1992)；和″聚(乙二醇)化学和生物学应用″，J.M.Harris和S.Zalipsky，编著，ACS(1997)；和国际专利申请WO 90/13540，WO 92/00748，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO94/18247，WO 94/28937，WO 95/11924，WO 96/00080，WO 96/23794，WO98/07713，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/30727，WO 99/32134，WO99/33483，WO 99/53951，WO 01/26692，WO 95/13312，WO 96/21469，WO97/03106，WO 99/45964，和美国专利Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966).
更优选的聚合物成分包括聚氧化烯，聚酰胺氧化烯，或者其衍生物。甚至更优选的聚合物成分是分子量大于大约1,000道尔顿的式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支化或线性的二价基团，并且n是2-100的不连续整数，更优选2-50的不连续整数，并且其中X和Y之一或两者包括生物学适应的基本上没有抗原性的可以是线性或支化的水溶性重复单元。最优选的水溶性重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷。这样的水溶性重复单元的数目可以显著地变化，但是更优选的这样的单元的数目是2-500、2-400、2-300、2-200、2-100、最优选2-50。最优选的实施方案的例子是其中X和Y之一或两者选自如下-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中n1是1-6、1-5、1-4，最优选1-3，并且其中n2是2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，并且最优选2-5。高度优选的实施方案的一个例子是其中X是-(CH2-CH2)-，并且其中Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。
聚合物成分或者一个或多个间隔基团或连接基团当存在时可以包括生物学稳定或者生物可降解的多肽链或单元。例如，具有重复键合的聚合物根据键的易变性在生理条件下有不同的程度的稳定性。以已知的低分子量类似物的水解速度，以它们在生理条件下的相对水解速度将具有这样的键的聚合物归类，例如从较不稳定至更稳定依次是聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(-O-C((OR)(R′))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。类似地，连接水溶性聚合物和靶分子的键合体系可以包括生物学稳定或者生物可降解的，例如，从较不稳定至更稳定依次是碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞尿烷(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R′))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。以举例的方式提出这些键，并不意味着限制本发明水溶性聚合物的多肽链或键合系统中可使用的键的类型。
成分J*是生理条件下带有选自负电荷，正电荷和中性的净电荷的侧基的残基。这包括烷基，芳基，杂烷基，杂芳基，芳基烷基，酰基，烷氧基，链烯基，炔基，酰胺(amideo)，氨基，羰基等，它们是取代的或未取代的，和它们的盐。中性基团优选是烷基或烷氧基，包括但不限于可以是直链或支链的具有1-18个碳原子的部分。当是带电荷的基团时，J*包括可离子化官能团。官能团的例子包括但不限于羧酸，酯，酰胺，腈，硫醇和羟基。这样的J*基团可以是氨基酸，核酸，脂肪酸，糖及其衍生物成分，和例如壳多糖，壳聚糖，肝素，乙酰肝素硫酸盐，软骨素，软骨素硫酸盐，皮肤素和硫酸皮肤素，环糊精，葡聚糖，透明质酸，磷脂，唾液酸等这样的部分。J*优选包括选自羧基，氨基，硫醇，羟基，磷酰基，胍鎓盐，咪唑及其盐的可离子化部分。最优选的是其中J*包括可离子化羧酸根部分并且在生理条件下带由净负电荷。
成分s1，s2，和s3是可以是相同或不同的并且可以各自存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。优选的间隔基团或连接基团包括直链或支链部分和脂肪族部分，所述直链或支链部分包括在水溶性聚合物中使用的一个或多个重复单元，二氨基和/或二元酸单元，天然或非天然氨基酸或者其衍生物，所述脂肪族部分包括烷基，芳基，杂烷基，杂芳基，烷氧基等，其优选包含至多18个碳原子或者甚至另外一个聚合物链。最优选的是所述间隔基团或连接基团包括一条聚合物链。
或者上式蛋白质-Un-s1-B-s2-聚合物-s3-J*可以表示为″蛋白质-Un-B-聚合物-J*″，其中s1，s2和s3基团可以存在或不存在。更优选的聚合物成分是其中全部是通过一步一步合成来制备水溶性聚合物U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*。这意味着这些聚合物具有精确的分子量和确定的结构。相反，常规聚合物合成，它是一个聚合过程，得到其中不同长度链的混合物，这样就有即使有可能也是难以分离的分子量分布和大小的分布。能够控制分子纯度的有利之处在于可以构建具有与之连接的水溶性聚合物并且是单分散性的合成的蛋白质。这表现出的明显的好处在于能够避免因非均相化合物导致的不定性质，只制备具有最优选性质的那些化合物并且相对容易制备与分离。
或者上式蛋白质-Un-s1-B-s2-聚合物-s3-J*可以表示为″蛋白质-Un-B-聚合物-J*″，其中s1，s2和s3基团可以存在或不存在。
最优选的式蛋白质-Un-s1-B-s2-聚合物-s3-J*的化合物具有包括核糖体特异性蛋白质的氨基酸序列的多肽链，并且更优选其中多肽链具有一个或多个不规则氨基酸。如这里使用的，″不规则氨基酸″指具有非遗传编码侧链，非遗传编码主链，非遗传编码取代的Nα或αC(O)部分，或者它们的组合的氨基酸，即除了核糖体安装的20种遗传编码氨基酸的其他氨基酸。优选的不规则氨基酸的例子包括具有携带除了遗传编码的官能团之外的特定官能团的侧链的氨基酸，和假氨基酸和各种氨基酸衍生物。在这一点上，本发明在设计和/或构建合成的生物活性蛋白质中提供选择性和灵活性。可以根据本发明使用的非核糖体安装的氨基酸的例子包括但不限于D-氨基酸，β-氨基酸，假-谷氨酸盐，γ-氨基丁酸盐，鸟氨酸，高半胱氨酸，N-取代的氨基酸(R.Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)899367-71；WO 91/19735(Bartlett等)，美国专利5,646,285(Baindur)，α-氨基亚甲基氧基乙酸(一种氨基酸-Gly二肽等排物)，和α-氨基氧酸，和具有非遗传非编码侧链官能团的其他氨基酸衍生物等。可以使用包含硫代酰胺，联乙烯酰胺，肼基，亚甲基氧基，硫代亚甲基，磷酰胺，氧酰胺，羟基亚乙基，还原的酰胺和取代的还原的酰胺等排物和β-磺酰胺。所谓″假氨基酸″意指与遗传编码的氨基酸具有相同的主链结构和侧链基团但是侧链原子的原子构成不同的氨基酸。
在优选的实施方案中，提供具有与其多肽链的不规则氨基酸连接的水溶性聚合物的合成的生物活性蛋白质。连接其水溶性聚合物的更优选的不规则氨基酸利用了在不与它们反应的遗传编码的官能团的存在下可以使用的化学选择连接化学。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括含有核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列的多肽链的合成的生物活性蛋白质，其中所述多肽链具有与之连接的一个或多个水溶性聚合物，并且优选具有大于25kDa的单体分子量。这包括具有模拟与核糖体特异性糖蛋白相关的生物活性的生物活性的合成的生物活性蛋白质。如这里使用的，“糖蛋白”指包含通过糖基与蛋白质的氨基酸侧链共价连接的碳水化合物链的蛋白质，并且有时称之为糖基化蛋白质。糖蛋白的碳水化合物可以是下面的形式单糖，二糖，寡糖，多糖，或它们的衍生物(例如硫取代或磷取代的)。通过具有N-连接和O-连接糖基化作用举例说明具有与蛋白质连接的一个以上碳水化合物的糖蛋白。包括天然或非天然糖蛋白的糖基化生物活性结构域。要明白该定义中包括被诱变减少了一个或多个糖基化位点或者在不将蛋白质糖基化的细胞中表达的糖蛋白，因为聚合物修饰的残基位点位置是相同的。
本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质优选的多肽链包括核糖体特异性哺乳动物糖蛋白的氨基酸序列。更优选的多肽链包括是细胞因子的核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列，其中很多多肽链和它们的特异的氨基酸序列和相关的生物学性质是已知的(参见，例如，“细胞因子手册”，第三版，A.Thomas编著，Associated Press，1998；“细胞因子”，A.Mire-Sluis和R.Thorpe编著，科学出版社，1998；和“细胞因子索引”，第一卷，配体，细胞因子和宿主防御的其他介体概要，J.J.Oppendheim和M.Feldmann编著，科学出版社，2001)。在优选的实施方案中，核糖体特异性糖蛋白包括一个或多个糖基化位点，在相应于核糖体特异性糖蛋白的一个或多个糖基化位点的一个或多个位点处，水溶性聚合物与合成的生物活性蛋白质的多肽链连接。在更优选的实施方案中，在相应于一个或多个这样的糖基化位点的一个或多个位点处，水溶性聚合物与多肽链特异性连接。本发明的该方面包括其中核糖体特异性糖蛋白是重组产生的可以是天然或非天然糖蛋白的糖蛋白的合成的生物活性蛋白质，所述非天然糖蛋白可以进一步包括一个或多个非天然糖基化位点。“糖基化位点”意指编码用于寡糖(碳水化合物)链与蛋白质的氨基酸序列的氨基酸残基的侧链酶促连接的蛋白质的氨基酸序列，通过N-连接和O-连接糖基化作用举例说明。要明白“糖基化位点”该定义中包括被诱变减少了一个或多个这样的糖基化位点的糖蛋白，因为聚合物修饰的残基位点位置是相同的。所谓“天然存在的糖基化位点”意指自然界发现的糖蛋白的糖基化位点。所谓“非天然存在的糖基化位点”意指经工程处理导入蛋白质中的糖基化位点。例如用基因工程方法对重组人EPO和GCSF进行了处理(参见，例如，美国专利No.5856298和5218092)。
本发明优选实施方案部分以这样的发现为基础，即在它的一个或多个糖基化位点用例如这里描述的聚合物的水溶性聚合物修饰具有糖蛋白多肽链的合成的蛋白质，可以使用水溶性聚合物带来归因于一般在对应的天然存在的糖蛋白、经基因工程处理包含另外的糖基化位点的糖蛋白、或经基因工程处理是糖基化的非糖蛋白的那个位置发现的碳水化合物链的一种或多种生物学作用的好处。这样的生物学作用包括调制蛋白酶抗性，免疫原性，受体特异性，特异性活性，药效和药物动力学。但是，通过排除碳水化合物链的存在，和用本发明优选的水溶性聚合物置换它，获得显著的利益，包括例如当去除糖链的侧链唾液酸残基侧链时避免酶促降解和清除、不稳定性、有限的循环半寿期、分布、不好的操作性质等。明显地，发现本发明这样的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质与没有修饰的相应的蛋白质比较时，保留了有利的生物学性质而基本上没有损失生物学活性，包括提高的生物活性，即使在合成的蛋白质的单体分子量大于25kDa时也是如此。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包括含有核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列的多肽链的合成的生物活性蛋白质，其中多肽链具有一个或多个与之连接的水溶性聚合物，并且单体分子量大于25kDa，并且其中合成的生物活性蛋白质具有与具有没有所述水溶性聚合物的多肽链的相应的合成的生物活性蛋白质相同或更好的生物活性。所述生物活性可以是体外、体内或者体外和体内的。在优选的实施方案中，所述生物活性是体内的。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包括含有核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列的多肽链的合成的生物活性蛋白质，其中多肽链具有一个或多个与之连接的水溶性聚合物，并且单体分子量大于25kDa，并且其中合成的生物活性蛋白质具有与核糖体特异性糖蛋白相同或更好的生物活性。同样，所述生物活性可以是体外、体内或者体外和体内的。在优选的实施方案中，所述生物活性是体内的。最优选地，这样的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质具有与之连接的不连续数目的水溶性聚合物。
蛋白质定向非天然存在的糖基化位点的好处在于自然界发现的蛋白质，不管是不是天然糖蛋白，都可以被利用重组DNA技术(例如定点诱变或定向修饰)来修饰，以便在一个或多个位点或区包含一个糖基化位点，所述区是例如负责免疫原性或蛋白酶灵敏性的没有保护的无序的或表面接触的那些区。例如在靶多肽序列的可能的免疫原性或蛋白酶灵敏位点设计非天然存在的糖基化位点，并且在生产(例如CHO细胞和酵母细胞表达系统等)并且分析相关的期望的生物活性的重组系统中筛选。然后具有在一个或多个那些位点专一地连接的水溶性聚合物的本发明合成的生物活性蛋白质的设计和合成中使用发现可以修饰来进行糖基化的新的位点。
在另一个实施方案中，本发明涉及在蛋白质的连接位点包括一个假氨基酸，和任选地，与该蛋白质连接的水溶性聚合物的合成的生物活性蛋白质。通过使具有包括化学选择反应性官能团例如半胱氨酸的N-末端氨基酸的第一个肽或多肽片段与具有化学连接相匹配的C-末端官能团例如α-羧酸硫酯的第二个肽或多肽片段的连接而形成在连接位点具有没有保护的侧链官能团的连接产物，然后将连接位点的没有保护的侧链官能团化学转化为假氨基酸，例如将半胱氨酸巯基侧链进行羧甲基作用，生成假谷氨酸氨基酸来制备这些化合物。通过在天然化学连接位点的半胱氨酸类的转化而形成的假氨基酸在这里称为“假天然化学连接”，下文将详细描述。
还提供了包括在蛋白质的连接位点与氨基酸的侧链连接的水溶性聚合物的合成的生物活性蛋白质。通过使具有包括化学选择反应性官能团例如半胱氨酸的N-末端氨基酸的第一个肽或多肽片段与具有连接相匹配的C-末端官能团例如α-羧酸硫酯的第二个肽或多肽连接而形成在连接位点具有没有保护的侧链官能团的连接产物，并且使水溶性聚合物与没有保护的侧链官能团在连接位点连接，来合成这些化合物。
利用本发明的假氨基酸化学连接和化学连接位点聚合物修饰的方法提供了比现有技术好的几个优点，其中包括另外没有合适的连接位点，以常规并且低成本方法可以开发定点聚合物修饰的位点的扩展(和连接化学过程)的合成的生物活性蛋白质的粗合成，以及大分子量合成的生物活性蛋白质的合成。它们也特别适合期望的生物学性质的微调的高通量模拟，包括对各个位点或多个位点检查水溶性聚合物连接。
如上所述，通过结合精确调节水溶性聚合物的分子量，聚合物组成，结构(例如线性还是支化的，或者其混合物)，侧基(例如带电荷还是不带电荷或者其混合物)，来精确调节聚合物连接的位点和连接化学，便能够修饰本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的生物学性质。特别地，除了提高蛋白质的分子量以提高半寿期以及支化等之外，与其连接水溶性聚合物使得合成的蛋白质具有精确电荷，如等电点测定的，等电点大约等于合成的生物活性蛋白质的氨基酸序列赖以为基础的相应的生物学产生的蛋白质的电荷。这具有模拟相应的核糖体特异性蛋白质的中性电荷的好处。因此本发明优选的实施方案涉及综合上述性质，并且为此使用水溶性聚合物，特别是能在预先选择的位置连接的结构确定的聚合物加成物的合成的生物活性蛋白质。
如上所述，本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质可以具有大的总分子量，大于大约25kDa。对于本发明的目的，通过变性SDS聚丙烯酰胺电泳测定分子量。术语“单体分子量”意指单体合成的蛋白质的分子量，这与具有蛋白质或多肽的多个拷贝的合成的蛋白质不同。术语“单体多肽分子量”意指单体多肽的分子量，这与具有与之连接的聚合物和/或蛋白质或多肽的多个拷贝的合成的蛋白质不同。
如这里使用的，如果对聚合氨基酸残基中的某些、最优选全部氨基酸残基，使用非重组技术，则蛋白质是“合成的”。术语“非重组技术”意指将涉及有机化学和其它合成聚合方法的技术与涉及体内或体外将RNA翻译成蛋白质的技术区别开来。合成的蛋白质包括全合成和半合成蛋白质。制备全合成蛋白质，其中所有的连接成分是通过化学合成人工制备的，即通过没有核糖体的合成。制备半合成蛋白质，其中至少部分连接成分是通过生物合成制备的，即在细胞内或者没有细胞的翻译系统中核糖体制备，而另一部分通过化学合成制备。
如这里使用的，如果其具有取决于合成的蛋白质结构或氨基酸序列的可辨别的生物活性，则合成的蛋白质是“生物活性”的，而这样的结构或序列中这样的变化增强，改变，或降低蛋白质的生物活性。没有限制地，这样的“生物活性”包括蛋白质介导催化、信号传导或诱导反应的能力，如这里使用的，认为蛋白质通过将底物转化为产物而其本身不被消耗或永久性被修饰而“介导催化反应”。如果其存在引起生物体或者其组织或细胞开始、持续、增强、修饰或减弱基因表达，细胞分化，或细胞增殖，则认为蛋白质“介导信号传导或诱导反应”。这样的信号传导或诱导反应的例子包括诱导细胞因子表达或者对细胞因子表达的响应，诱导红细胞生成，诱导或减弱炎症和/或发炎过程，引发血管生成或血管化作用，诱导编程性细胞死亡，影响细胞周期等。
因此，这里使用的所谓“聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质”指具有与之连接的一个或多个水溶性聚合物的合成的生物活性蛋白质。本发明合成的生物活性蛋白质的生物活性还包括蛋白质特异性结合受体、配体或抗体的能力。如这里使用的，术语“特异性”结合意指以结构为基础的结合相互作用，例如激素及其受体、或抗体和抗原表位之间存在的相互作用，这与以电荷，溶解性，疏水性等为基础的“非特异性”结合完全不同。
可以对本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质进行设计，使具有模拟与哺乳动物(包括人，猴，牛，鼠，猪，绵羊，或马等)，鸟或鱼蛋白质相关的生物活性的生物活性。如这里使用的，如果就第二蛋白质的生物活性来说，第一蛋白质具有被修饰，增强或减弱的生物活性，则说第一蛋白质模拟第二蛋白质。如果其存在直接或间接依赖蛋白质的氨基酸序列，则说生物活性与该蛋白质“相关”。在另一个实施方案中，本发明的生物活性蛋白质可以全部或部分基因工程处理，而不牵涉任何相应的天然生物活性对应物。
本发明优选的合成的生物活性蛋白质包括除受体之外的聚合物修饰的蛋白质，和聚合物修饰的可溶性受体结构域。例如，包括聚合物修饰的可溶性受体结构域的合成的生物活性蛋白质是特别优选的。PCT/US00/06297中描述了对于聚合物修饰是优选的可溶性受体结构域的例子，并且包括促肾上腺皮质激素受体及其生物活性片段，血管紧张肽受体，心房受体，缓激肽受体，生长激素受体，趋化性受体，强啡肽受体，内啡肽受体，β-脂肪酸释放激素的受体及其生物活性片段，脑啡肽受体，酶抑制剂受体，纤连蛋白及其活性片段的受体，肠胃-和生长激素释放肽受体，黄体化激素释放肽的受体，黑素细胞刺激激素的受体，神经降压素受体，阿片样物质受体，催产素受体，血管生压素受体，加压催产素受体，甲状旁腺激素和片段的受体，蛋白激酶受体，抑生长素受体，物质P受体，的可溶性结构域。
聚合物修饰的合成的细胞因子是本发明特别优选的实施方案。特别地，本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质包括合成的细胞因子，包括合成的趋化因子，其介导对细胞-细胞相互作用、传达和对生物学行为的其它细胞的行为的特异性作用。如这里使用的，术语“细胞因子”意指包括白细胞介素(“IL”)(例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14等)，淋巴因子和信号分子，例如红细胞生成刺激蛋白(例如红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO))，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素，等，生长因子，例如转化生长因子，神经生长因子，大脑衍生生长因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，肝细胞生长因子，T-细胞生长因子(TGF，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3等)，集落刺激因子(G-CSF，GM-CSF，M-CSF等)，表皮生长因子(EGF，LIF，KGF，OSM，PDGF，IGF-I等)，成纤维细胞生长因子(αFGF，βFGF等)，和激素，特别是信号肽激素，例如生长激素和趋化因子。如这里使用的，术语“趋化因子”意指趋化性细胞因子，例如6Ckine，9E3，ATAC，ABCD-1，ACT-2，ALP，AMAC-1，AMCF-1，AMCF-2，AIF，ANAP，Angie，β-R1，β-血小板球蛋白，BCA-1，BLC，blr-1配体，BRAK，C10，CCF18，Ck-β-6，Ck-β-8，Ck-β-8-1，Ck-β-10，Ck-β-11，cCAF，CEF-4，CINC，C7，CKA-3，CRG-2，CRG-10，CTAP-3，DC-CK1，ELC，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-1，Exodus-2，ECIP-1，ENA-78，EDNAP，ENAP，FIC，FDNCF，FINAP，Fractalkine，G26，GDCF，GOS-19-1，GOS-19-2，GOS-19-3，GCF，GCP-2，GCP-2-样，GRO1，GRO2，GRO3，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，H400，HC-11，HC-14，HC-21，HCC-1，HCC-2，HCC-3，HCC-4 H174，肝素中和蛋白，Humig，I-309，ILINCK，I-TAC，Ifil0，IL8，IP-9，IP-10，IRH，JE，KC，Lymphotactin，L2G25B，LAG-1，LARC，LCC-1，LD78-α，LD78-β，LD78-γ，LDCF，LEC，Lkn-1，LMC，LAI，LCI，LA-PF4，LDGF，LDNAP，LIF，LIX，LUCT，Lungkine，LYNAP，Manchester抑制剂，MARC，MCAF，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MDC，MIP-1-α，MIP-1-β，MIP-1-δ，MIP-1-γ，MIP-3，MIP-3-α，MIP-3-β，MIP-4，MIP-5，Monotactin-1，MPIF-1，MPIF-2，MRP-1，MRP-2，M119，MDNAP，MDNCF，巨核细胞刺激因子，MGSA，Mig，MIP-2，mob-1，MOC，MONAP，NC28，NCC-1，NCC-2，NCC-3，NCC-4 N51，NAF，NAP-1，NAP-2，NAP-3，NAP-4，NAP S，NCF，NCP，Neurotactin，制癌蛋白A，P16，P500，PARC，pAT464，pAT744，PBP，PBP-样，PBSF，PF4，PF4-样，PF4-ALT，PF4V1，PLF，PPBP，RANTES，SCM-1-α，SCI，SCYA26，SLC，SMC-CF，ST38，STCP-1，SDF-1-α，SDF-1-β，TARC，TCA-3，TCA-4，TDCF，TECK，TSG-8，TY5，TCF，TLSF-α，TLSF-β，TPAR-1，TSG-1。
这样的细胞因子，它们的细胞因子亚族和它们的相应的多肽链，其变体和相关的生物活性是公知的并且公众可以通过多个来源获得(参见，例如，“细胞因子手册”，第三版，A.Thomas编著，AssociatedPress，1998；“细胞因子”，A.Mire-Sluis和R.Thorpe编著，科学出版社，1998；和“细胞因子索引”，第一卷，配体，细胞因子和宿主防御的其他介体概要，J.J.Oppendheim和M.Feldmann编著，科学出版社，2001))。
II.本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的制备设想本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的制备可以有下面的步骤设计，肽合成，肽连接，全长连接产物折叠，产生蛋白质，并且评价蛋白质的生物活性。发现可以在肽合成、连接或折叠产物步骤中的一步或多步可以进行聚合物修饰。但是优选的是，在折叠之前使聚合物连接在多肽上或连接在连接产物上，筛选用该方法制备的表现出期望的生物活性的蛋白质，并且代表本发明的合成的生物活性蛋白质。
在特别优选的实施方案中，提供了制备本发明的合成的生物活性蛋白质的方法，该方法包含化学连接包括本发明的靶合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的多肽链的不重叠氨基酸序列的肽片段，其中用于连接的一个或多个肽片段在使用者确定的和预先选择的位点有与之连接的水溶性聚合物。然后可以折叠聚合物修饰的多肽链，制备本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
制备本发明的合成的生物活性蛋白质的另一个优选的方法包含化学连接包括本发明的合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的多肽链的不重叠氨基酸序列的肽片段，并且在其一个或多个化学连接位点使一个或多个水溶性聚合物与氨基酸侧链连接。然后可以折叠聚合物修饰的多肽链，制备本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。
本发明还涉及制备聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的方法，该方法包含(1)化学连接包括合成的生物活性蛋白质的多肽链的不重叠氨基酸序列的肽片段，形成相应于合成的生物活性蛋白质的全长多肽链，其中至少一个肽片段包括一个具有第一个化学选择性官能团的不规则氨基酸，(2)折叠多肽链，和(3)与之连接水溶性聚合物，其包括与第一个化学选择性基团特异地并且相互反应的第二个化学选择性基团。
特别地，如附图所示，可以举例说明本发明包括的这些各种各样的方法，和实施例中举例说明的方法。例如图1A-1E说明连接方案，涉及水溶性聚合物(这里定义的U-B-聚合物-J*)与连接之前或之后部分或完全未保护的肽片段 或者其组合连接。在图1A-1D中，Yaa代表携带用于与携带能与Yaa化学选择性化学连接的特异和相互反应性N-末端氨基酸Xaa(例如，氨基末端半胱氨酸)部分的第二肽片段化学连接的特异化学选择部分(例如携带α-羧基硫酯的氨基酸)的第一肽片段上的C-末端氨基酸。Yaa和Xaa之间的化学选择性反应形成它们之间的共价连接(例如酰胺键)。因此Yaa和Xaa形成化学选择性连接对。Un-，如图所示，代表在氨基酸侧链上使用者确定的精确位点处插入的第二特异化学选择性部分，并且对于水溶性聚合物U-B-聚合物-J*的基团U-是化学选择性的，并且与之相互反应。例如，当Un是经修饰而携带酮基的侧链时，水溶性聚合物U-聚合物-J*的基团U-是对于与酮反应是化学选择性的基团，例如，在它们之间形成肟键的氨基氧基。Un-的脚注“n”代表氨基酸的数目，设计它们的侧链使带有化学选择性基团U，例如，其中两个特异性的使用者确定的位点要被聚合物修饰，n＝2，其也可以表示为U2或Un＝2。在所有的情况下，n使通过设计而精确控制的正整数。因此Un和U代表与Xaa和Yaa的化学选择性基团相匹配并且不反应的第二化学选择性连接对。图1A和1B详细说明两个不同的潜在的反应。在第一个说明的反应中，带有Un官能团的多肽链与第二个多肽连接，然后为了获得聚合物修饰的多肽而与U-B-聚合物-J*部分反应。在第二个说明的反应中，为了获得聚合物修饰的多肽，带有Un官能团的多肽链与U-B-聚合物-J*部分反应，然后与第二多肽反应，以获得更大的聚合物修饰的多肽。图的不同之处在于，图1A中，带有Xaa残基的多肽接受聚合物修饰，而图1B中，带有Yaa残基的多肽接受聚合物修饰。图1C详细说明在生成更大的多肽的连接之前或之后本发明修饰多个多肽链的能力。在图1D中，PG和PG′代表保护基团，其中PG′说明正交的保护基团，即PG和PG′在不同条件下是可去除的，并且在不同的水溶性聚合物通过相同化学与Un基团连接的情况下，或者Un基团代表人们不期望用聚合物修饰的侧链官能团(例如带有反应性-NH2或-SH的侧链，其中设计水溶性聚合物的U基团，使得与伯氨基或侧链巯基特异性反应)的情况下是有用的。图1D说明为了保护根据本发明方法连接的多肽的期望的侧链可以使用的保护基团。
图1E详细说明根据图1A-1D的连接和聚合物修饰中使用的肽片段中可以存在或不存在的基团的多样性。
图2A-2C另外图解说明本发明的合成的生物活性蛋白质的制备方法。特别地，图2A-2B说明连接方法，涉及水溶性聚合物U-B-聚合物-J*在连接位点(例如半胱氨酸的侧链巯基)与氨基末端基团Xaa的侧链连接。图2C详细说明根据图2A-2B的连接和聚合物修饰中使用的肽片段中可以存在或不存在的基团的多样性。
图3A-3B另外图解说明实现多片段连接的方法，涉及三个或多个非重叠肽片段的化学连接，即，至少一个片段是相应于最终全长连接产物的中间片段。用该方法制备的肽可以用于制备另一个连接反应中涉及的肽片段，例如，如图1A-1E，图2A-2C，和图4A-4C所示。一般情况下，对于多片段连接，中间片段要么具有保护的Xaa基团或者保护的Yaa基团，以避免环化或者干扰取决于应用的连接化学过程的肽的生成。对于顺序或连续连接，保护中间片段的Xaa基团(例如.，Cys(Acm))，同时不保护Yaa基团(例如，Yaa-COSR，其中-COSR是α-羧基硫酯)。这里Yaa基团自由地与带有未保护的Xaa基团的第二肽反应，其中第二肽没有自由的Yaa基团。连接之后，去除保护基团，再产生Xaa基团用于下面的连接反应。如果需要，继续该过程，从而产生延长的多肽链。Yaa基团的保护特别用于涉及由四个或多个片段组成的最终连接产物的制备的会聚化学连接。例如，对于由四个片段连接(即三个连接反应)产生的蛋白质靶物，可以平行连接相应于蛋白质一个末端的两个片段和相应于蛋白质另一个末端的两个片段，与顺序相反，两个末端在最终连接反应中连接。这样的会聚化学连接方案也可以应用正交连接化学。图1E，2C和4C中详细说明了这样的肽片段中可以存在或不存在的基团的多样性。
图4A-4C详细说明根据本发明的原理可以怎样实现得到的侧链硫醇的天然化学连接和化学修饰。特别地，图4A-4B说明在连接位点利用得到的半胱氨酸侧链硫醇的天然化学连接和化学修饰，通过硫代烷基化作用和包括硫醚键的化学修饰侧链(ψ表示)的产生，形成″假氨基酸″(ψXaa表示)。在没有描述的另一个实施方案中，在脱硫作用反应中可以将侧链硫醇转化为丙氨酸(Liang等，J.Amer.Chem.Soc.(2001)123(4)526-533)。两个反应的显著方面是用合适的保护基团(PG)保护人们不期望转化或修饰的任何其它侧链硫醇，或者对于多片段连接，用正交保护基团(PG′)，其中带有羧基末端Yaa基团的片段包括保护的氨基末端Xaa基团，即，PG-Xaa-肽，图4B举例进行了说明。图4C详细说明根据图4A-4B，以及图1A-1E，图2A-2C，和图3A-3B的连接和聚合物修饰中使用的肽片段中可以存在或不存在的基团的多样性。
在本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的设计中，一般从很多种不同来源包括数据库例如基因和/或蛋白质数据库获得，或者例如通过感兴趣的新的蛋白质靶物的蛋白水解鉴定从头获得最初的靶蛋白质的多肽主链氨基酸序列。如上所述，这样的数据库的例子包括但不限于GeneBank(Benson等，Nucleic Acids Res(1998)26(1)1-7；美国国家生物技术信息中心，国家医药图书馆，国家健康研究中心，Bethesda，MD，USA)，TIGR数据库(基因组研究中心，Rockville，MD，USA)，Protein Data Bank(Brookhaven国家实验室，USA)，和ExPASy和Swiss-Protein数据库(瑞士生物信息研究所，Genève，瑞士)。对于该目的也可以使用公众可获得的专利数据库。设计所使用的多肽主链代表靶序列的部分(例如结构域)或全部(例如多肽链的成熟形式)。
使用最初的多肽主链序列，对于给定的目标合成蛋白或者其一组类似物设计期望的全长聚合物修饰的多肽结构。这包括设计多肽主链，水溶性聚合物的结构，对于感兴趣的给定的合成的蛋白质构建体的连接和水溶性聚合物连接策略。特别地，对设计基础的多肽氨基酸序列检查一个或多个糖基化位点、一个或多个免疫原性位点、或一个或多个蛋白酶敏感位点的存在(即基本上没有螺旋或β-折叠二级结构的区；一般是环形和回转区)。也可以收集其它位点，包括聚集位点和糖胺聚糖(GAG)结合位点，后者对于所有的趋化因子是常见的。此外，很多蛋白质的三维结构是已知的并且用于辅助设计。
糖基化位点包括N-连接和O-连接糖基化位点，它们一般存在于环和回转区中的无规区。免疫原性位点包括蛋白质表面上回转处的亲水性位点。感兴趣的蛋白酶敏感位点包括蛋白酶识别的并且在蛋白质一般是无规区的表面上的氨基酸序列。很多蛋白质的聚集和GAG位点和它们的鉴定方法、特别是趋化因子是公知的(参见，例如，“细胞因子手册”，第三版，A.Thomas编著，Associated Press，1998；“细胞因子”，A.Mire-Sluis和R.Thorpe编著，科学出版社，1998；和“细胞因子索引”，第一卷，配体，细胞因子和宿主防御的其他介体概要，J.J.Oppendheim和M.Feldmann编著，科学出版社，2001)。
例如，通过使一个或多个聚合物与免疫原表位或蛋白酶识别序列定点连接产生本发明的蛋白酶抗性或非免疫原性水溶性聚合物修饰的生物活性蛋白质，可以减小或消除给定蛋白质靶物的免疫原性或蛋白酶稳定性。使聚合物连接的其它位点包括给定蛋白质靶物的氨基和/或羧基末端。
糖基化位点，包括天然的和经基因工程处理而包含它们的位点对于水溶性聚合物连接来说是特别优选的位点。这以本发明的发现为基础，即可以制备在一个或多个这样的位点特异性修饰的有水溶性聚合物这样以代替和模拟在那个位置上天然存在的糖蛋白的一个或多个的碳水化合物链的正生物作用的合成的生物活性蛋白质。
通过模型模拟和/或生物或化学分析方法可以测定这样的水溶性聚合物连接位点。模型模拟包括生物信息学方法，例如使用同源性模型软件算法或程序，这些算法或程序比较部分至最多所有给定的核酸或靶蛋白质的氨基酸序列，感兴趣的多肽的二维结构信息，和感兴趣的蛋白质的三维结构信息，或者它们的组合。很多软件程序和数据库是公知的，并且为此目的是可获得的(参见，例如GeneBank(Benson等，Nucleic Acids Res(1998)26(1)1-7；美国国家生物技术信息中心，国家医药图书馆，国家健康研究中心，Bethesda，MD，USA)，TIGR数据库(基因组研究中心，Rockville，MD，USA)，Protein DataBank(Brookhaven国家实验室，USA)，ExPASy和Swiss-Protein数据库(瑞士生物信息研究所，Genève，瑞士)。使得这些方法成为一体的软件程序的一个例子是“MAXVECTOR”(Oxford Molecular Group)，其含有用于预测二级结构的多种蛋白质分析工具(Chou-Fasman和Robson-Garnier方法)；亲水性(Hopp-Woods，Kyte-Doolittle，Goldman-Engelman-Steitz(GES)，和von-Heijne方法)；疏水性(Fauchere-Pliska，Janin，Manavalan，Sweet-Eisenberg方法)；抗原性(Hopp-Woods，Parker，Protrusion Index(Thornton)，Welling方法)；表面概率(Karplus&Schultz’s方法)；柔性(Janin和Emini方法)；两亲性(Eisenberg方法)；PROSITE基础子序列数据库和使用者确定的子序列；定型子序列；和蛋白酶位点和蛋白水解消化预测。
例如，当对蛋白质靶物检查一个或多个糖基化位点的存在时，一般对天然氨基酸序列的部分或全部检查N-连接糖基化位点(一般在环或回转区中在Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser序列处存在)和O-连接位点(一般在环或回转区中在Ser-Xaa-Xaa-Pro或Thr-Xaa-Xaa-Pro序列处存在)。很多种算法和模拟程序适合该目的(参见，例如ExPASy和Swiss-Protein数据库(瑞士生物信息研究所，Genève，瑞士；Gupta等，Glycobiology(1999)9(10)1009-1022；“DICTYOGLYC”，Hansen等，Biochemical Journal(1995)308801-813；O-GLYCBASE，Hansen等，Nucleic Acids Res earch(1997)25278-282；NETOGLYX，Hansen等，Glycoconjugate J.(1998)15115-130)。
为了预测蛋白质中的免疫原位点，可以使用下面的方法。对蛋白质序列进行二级结构预测。Chou-Fasman参数特别用于该目的(Chou等，高级酶学(1978)4745-148；Maclin等，“以神经网络知识为基础精确确定算法改进对于蛋白质折叠的Chou-Fasman算法”，Working Paper 91-2，Wisconsin-Madison大学计算机科学系，1991，和Qian等，J.Molecular Biology(1988)202865-884；“PEPEPLOT”，Genetics Computer Group，Inc.研发的程序)。鉴定无序区，特别是回转区。也对蛋白质序列测定疏水性，一般根据标准方法使用六个残基的running average(例如Fauchere-Pliska或Hopp-Woods疏水性预测方法或Bull-Breese)，并且鉴定更多的亲水区，特别关注回转区的那些。同时鉴定糖基化位点，包括N-连接和O-连接的位点。蛋白质中的大多数亲水性位点，如果其是在回转区中并且预测不是糖基化的，这有高概率的免疫原性，因此用作聚合物修饰位点。相同的基本原则适用于连续较小亲水区，以鉴定聚合物修饰的次位点。
也可以利用生物和化学分析鉴定制备本发明的合成的生物活性蛋白质中的聚合物连接的特异位点。例如，可以使要用作设计和合成本发明的合成的生物活性蛋白质基础的分离的糖蛋白进行酶消化和分析，例如通过HPLC肽谱和质谱，来实验鉴定N-连接和O-连接糖基化位点。为了鉴定免疫原性位点，或蛋白水解酶敏感位点，可以以多种生物或化学途径鉴定包含这样的区的蛋白质分子的表面上更高度无规的“环”区。例如，可以利用各种各样的蛋白水解酶使要用作设计和合成本发明的合成的生物活性蛋白质基础的分离的糖蛋白进行有限蛋白酶水解消化，接着对得到的肽片段进行质谱分析，根据标准方法在图中找出对蛋白水解酶最可能的位点(参见，例如，Coligan JE，Dunn BM，Ploegh HL，Speicher DW，Wingfield PT，编著，最新蛋白质结构实用程序(Current Protocols in Protein Structure)，volII，纽约；JohnWiley&Sons，1997；Chait，BT，结构(Structure)(1994)2465-467；Kriwacki等，J Chromatogr A(1997)777；23-30；Hillenkamp等，AnalChem(1991)63A1193-1201；Fenn等，质谱综述(Mass Spectr Rev)(1990)937-70；和Siuzdak G.，用于生物技术的质谱(MassSpectrometry for Biotechnology)，San Diego科学出版社，1996)。有很多常规用于该目的的蛋白酶(Konigsberg WH，酶学方法(MethodEnzymol)(1995)262331-346；Carrey，EA，InCreighton T，编著，蛋白质结构-实验手册(Protein Structure，a Practical Approach.)纽约；IRL Press(1989)，pp.117-144；和Coligan，JE，Dunn BM，PloeghHL，Speicher DW，Wingfield PT，编著，最新蛋白质结构实用程序(Current Protocols in Protein Structure)，vol II，纽约；JohnWiley&Sons，1997)。折叠蛋白质多肽链的表面环区通常与对蛋白酶消化提高的灵敏性有关。利用相似方法限制消化之后“随机的”化学修饰，并且也可以使用肽质谱谱图鉴定未知三维结构的蛋白质的暴露的表面区。
对于鉴定免疫原性位点，蛋白酶灵敏位点或适合聚合物修饰的其它位点，也可以进行丙氨酸检查来鉴定能够作为水溶性聚合物连接位点的多肽主链中的特异性残基。当水溶性聚合物连接位点位于靶分子的免疫原性位点或蛋白酶灵敏位点时，这特别用于鉴定生物活性要求的相同的残基。当与如上所述的其它蛋白质分析方法结合使用时，丙氨酸扫描是特别有用的。另一种方法是系统制备感兴趣的合成的蛋白质文库，其中水溶性聚合物部分修饰在各分子的多肽链中的不同的位点。聚合物修饰的多肽链库折叠之后，可以进行功能筛选/测试，来分离例如折叠的与没有折叠的分子，或者结合受体与没有结合受体的分子。然后可以对功能分子测定聚合物修饰位点的位置。这样的方法可以利用“蛋白质识别标志分析”方法的原理有利地鉴定聚合物修饰的非干扰位点(Muir等，Chemistry&Biology(1996)3817-825)。
与设计相结合，构建用于合成多肽主链的肽或多肽片段。这包括选择合适的连接位点，选择的基础是用于组装各种多肽主链片段而选择的连接化学，对于给定的靶蛋白而选择的聚合物连接化学，和特定聚合物连接位点。当利用天然化学连接时，通过对靶多肽主链氨基酸序列扫描合适的天然存在的半胱氨酸残基来测定半胱氨酸连接位点。当利用这里描述的拓展的天然化学连接时，通过对靶多肽主链氨基酸序列扫描合适的天然存在的允许牢固连接的连接位点连接可以筛选连接位点，例如Xaa-Gly位点。因为拓展的天然化学连接不局限于在半胱氨酸残基处连接，所以许多的残基都可以作为连接位点连接。在一些情况下，天然的和拓展的天然化学连接组合也是设计的一部分。
在优选的实施方案中，利用天然化学连接产生全长多肽链的部分或全部。合成的生物活性蛋白质以之为基础的天然存在的蛋白质中存在的半胱氨酸可以用作化学连接位点。但是在优选的连接点没有合适的半胱氨酸的情况下，可以用半胱氨酸置换那个位置的非半胱氨酸的氨基酸，以允许在那个位点进行天然化学连接。如果期望，可以如本文所述，可以将新导入的半胱氨酸转化为相应于那个位置的原氨基酸的假氨基酸残基。或者，当在一个位点导入半胱氨酸用于聚合物修饰时，侧链硫醇可以连接硫醇-反应性水溶性聚合物构建体，前提是保护靶多肽中不期望修饰的所有的其它半胱氨酸。
在另一个优选的实施方案中，可以利用这里描述的拓展的天然化学连接产生全长多肽链的部分或全部。对于该方法，可以利用N-末端Nα-取代的2或3个碳链烷基或芳基硫醇氨基酸。根据这里描述的拓展的天然化学连接方法，可以有利地使用这样的残基(存在于用于连接的肽或多肽片段的N-末端)使那个多肽与具有C-末端α-羧基硫酯部分的多肽连接。
典型地，肽的合成利用标准自动肽合成仪使用标准的分步骤Boc和/或Fmoc固相肽合成，或者根据标准方法手工制备，或者从商家定购和购买(“合成肽，使用者指南”(Synthetic Peptides，A User′sGuide)，G.A.Grant，编著，W.H.Freeman & Company，纽约，NY，1992；肽合成原理(Priciples of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；肽合成实践(The Practice ofPeptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；和保护基团(Protecting Groups)，P.J.Kocienski，编著，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1994；Fmoc固相肽合成，实践入门(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，APractical Approach)，W.C.Chan和P.D.White编著，OxfordUniversity出版社，2000)。对于用于硫酯介导的连接的肽，例如用于天然化学连接，也可以根据标准方法制备(参见，例如，Dawson等，Science(1994)266776-779；Canne等Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，等，WO 96/34878；Kent，等，WO 98/28434；Ingenito等，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073)；Amiato等，上文)。
对于水溶性聚合物的连接和定点连接，在肽合成中应用化学正交策略(参见，例如，图1-4，和实施例)，以避免产生不期望连接的副反应。例如，根据连接设计和聚合物连接方法，可以开发各种正交合成策略。特别地，要考虑要连接的水溶性聚合物的性质，特别是连接它和多肽的官能团，例如下文对于本发明优选的糖基模拟聚合物所讨论的。
特别地，制备水溶性聚合物，以包括与用于连接的靶肽、全长物质或者甚至折叠的多肽上的特异官能团选择性反应的特异官能团U。应用化学合成时，制备在精确的使用者确定的位点包含相互反应的化学选择性基团的肽。本发明的该方面包括肽合成(保护基团策略)和化学连接(部分或没有保护基团策略)原理。对于保护基团策略，用合适的保护基团保护除了水溶性聚合物上的期望的官能团和靶分子上存在的其相互反应官能团之外的所有的可能的反应官能团。很多保护基团是公知的并且适合该目的(参见，例如，有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编著，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“合成肽，使用者指南”(Synthetic Peptides，A User′sGuide)，G.A.Grant，编著，W.H.Freeman & Company，纽约，NY，1992；组合和固相有机化学高等化学技术手册(Advanced ChemtechHandbook of Combinatorial&Solid Phase Organic Chemistry)，W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编著，高等化学技术(AdvancedChemtech)，1998；肽合成原理(Priciples of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；肽合成实践(ThePractice of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；和保护基团(Protecting Groups)，P.J.Kocienski，编著，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1994)。
因此，可以制备具有例如上述的那些各种各样的官能团的水溶性聚合物。对于部分或没有保护基团策略，聚合物上的官能团和靶肽或多肽上存在的其相互反应官能团使用化学选择性反应对，其中反应体系中可以存在其它不反应的官能团。这包括能进行胺保护策略(例如，通过形成半胺，通过形成亚胺，通过米歇尔加成而连接)，硫醇保护策略(例如通过形成硫醇化物，通过二硫化物互换连接)，天然化学连接策略(例如，通过涉及包含侧链氨基酸衍生物的半胱氨酸或硫醇的硫酯交换连接)，和正交连接偶联策略(例如，例如通过形成噻唑烷，通过硫酯交换，通过硫酯形成，通过二硫化物交换，和通过酰胺形成而连接)(参见，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)的基团。
该实施方案优选的化学选择性U基团包括在含水的兼容的连接化学例如天然化学连接中使用的特异官能团残基(Dawson，等，Science(1994)266776-779；Kent，等，WO 96/34878)，拓展的一般化学连接(Kent，等，WO 98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等，J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)，形成硫酯的连接(Sehnlzer，等，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，和形成噻唑烷的连接和形成噁唑烷的连接(Zhang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等，WO 95/00846)或者通过其它方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，通过天然化学连接结合脱硫作用没有半胱氨酸残基的肽和蛋白质的合成(Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues byNative Chemical Ligation Combined with Desulfurization)，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，这里引作参考；Gieselnan等，Org.Lett.2001 3(9)1331-1334；Saxon，E.等，用于酰胺键化学选择性合成的″Traceless″Staudinger连接(″Traceless″Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds)，Org.Lett.2000，2，2141-2143)。
给出上述各种各样的连接化学，水溶性聚合物和靶肽或多肽之间形成的键可以包括选自碳酸酯，酯，尿烷，原酸酯，酰胺，胺，肟，酰亚胺，脲，硫脲，硫醚，硫代尿烷，硫酯，醚，噻唑烷(thaizolidine)，腙，噁唑烷等的键的残基。最优选的键是肟和酰胺键。
例如如图1-4所示的肽连接步骤可以应用固相或溶液相连接策略。图8说明水溶性聚合物与可用于本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的连接和制备的肽片段精确连接的另一条途经。第一步骤应用固相肽合成(″SPPS″)(例如，Fmoc或Boc SPPS)，其中用正交保护基保护目的在于聚合物连接的氨基酸侧链(例如，如果使用FmocSPPS，可以使用Boc基团保护聚合物连接位点，或者如果使用BocSPPS，可以使用Fmoc基团作为正交保护基)。肽合成之后，选择性去除正交保护基，同时肽的其余部分仍然受保护。这为下一步固相聚合物合成提供了单一连接位点。一旦去除正交保护基，聚合物链作为前体被连接。更优选地，利用图6A-6D说明的方法通过聚合物合成的相继循环构建聚合物链。尽管只说明了单一聚合物连接位点，也可以提供一个以上的聚合物连接位点。
如上所述，化学连接包括第一化学成分和第二化学成分之间的选择性共价连接的形成。可以使用第一和第二成分上存在的独特的、相互反应的官能团进行化学选择性连接反应。例如，肽和多肽的化学连接包括带有相容的独特的相互反应的C-末端和N-末端氨基酸残基的肽或多肽片段的化学选择性反应。对于该目的使用几种不同的化学，其例子包括天然化学连接(Dawson，等，Science(1994)266776-779；Kent，等，WO 96/34878；Kent，等，WO 98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等，J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-34)，形成硫酯的连接(Schnlzer，等，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，形成噻唑烷的连接和形成噁唑烷的连接(Zhang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等，WO 95/00846；美国专利No.5,589,356)；Gieselman等，硒代半胱氨酸-介导的天然化学连接(Org.Lett.(2001)3(9)1331-1334)；Staudinger酰胺形成化学连接(Saxon等，Org.Lett.(2000)22141-2143)。因此，要明白，对于该目的可以使用能够用于未保护的肽片段的连接的任何化学选择性反应化学。
选择对于给定连接化学的反应条件来保持用于连接的肽或多肽片段的期望的相互作用。例如，可以改变反应混合物的pH和温度、连接标记的水溶性、第一片段和第二片段的比例、水含量和组成，以优化连接。另外可以利用将连接片段溶解至不同的程度的试剂的加入或排出来控制期望的连接反应的特异性和速度，即，通过操作肽或多肽片段的溶解性来控制反应基团的接触和暴露。通过与一个或多个内标和/或外标相比较测定期望的化学选择性反应产物，就可容易地确定反应条件。
在包括连接带有N-末端半胱氨酸残基的多肽的连接的情况下，优选使用天然化学连接方法(Dawson，等，Science(1994)266776-779；Kent，等，WO 96/34878；Kent，等，WO 98/28434))。证明了该方法是在连接位点生成天然酰胺键的可靠方法。天然化学连接包括具有C-末端α-羧基硫酯部分的第一肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸残基的第二肽或多肽之间的化学选择性反应。硫醇交换反应得到最初的硫酯-连接中间体，其自发重排在连接位点得到天然酰胺键，同时再生出半胱氨酸侧链硫醇。在很多情况下，天然蛋白质序列包括适当安置的半胱氨酸残基，这样可以合成带有N-末端半胱氨酸残基的多肽片段，并且在天然化学连接反应中使用。在其它情况下，可以进行肽合成，这样为此目的将半胱氨酸残基导入多肽中。这样，在其标准形式中，天然化学连接包括靶多肽序列中的半胱氨酸残基处的硫酯-介导的化学选择性反应；在连接位点形成肽键，并且再生天然形式的Cys侧链。
或者，通过应用″假-天然化学连接″或″拓展的天然化学连接″可以合成本发明的蛋白质。假-天然化学连接包括在蛋白质合成中使用的肽中预先选择的位置处非天然存在的假氨基酸残基的使用(例如，参见图4)。这样的假氨基酸的结构模拟半胱氨酸的结构和要合成的蛋白质中这样的预先选择的位置处天然发现的氨基酸的结构。因此假-天然化学连接涉及天然化学连接的连接位点处产生的半胱氨酸侧链的硫代烷基化作用。优选的一方面是其中至少一个肽包含具有合适的保护基团保护的其硫醇侧链的天然半胱氨酸的半胱氨酸连接位点的硫代烷基化作用。
在本发明优选的实施方案中，将半胱氨酸基团的硫醇部分修饰成期望的侧链，例如，成为核糖体特异性氨基酸的侧链、这样的氨基酸的类似物、或者成为非-核糖体特异性氨基酸。如这里使用的，核糖体特异性氨基酸是在蛋白质翻译过程中核糖体识别的氨基酸，并且可以插入核糖体产生的蛋白质中。相当多公开的文献描述了半胱氨酸侧链硫醇部分的化学修饰(参见，例如，蛋白质科学中的最新方法(CurrentProtocols in Protein Science)，John E.Coligan等编著，John Wiley &Sons，NY(2000))。Kaiser，E.T.描述了转化半胱氨酸残基来模拟天然存在的氨基酸侧链的化学性质(参见，例如，Kaiser，E.T.等，酶活性位点的化学诱变(Chemical Mutation Of Enzyme Active Sites)，Science.1984年11月2日；226(4674)505-11)。另外，有人描述过利用半胱氨酸侧链将标记导入肽或蛋白质。下面文献中综述了半胱氨酸侧链修饰蛋白质偶联和交联化学(Chemistry of Protein Conjugation andCrosslinking)，S.S.Wong，(1991，CRC Press)；蛋白质的化学修饰(Chemical Modification of Proteins)，Gary E.Means等，(1971，Holden-Day)，蛋白质的化学修饰筛选方法和分析方法(ChemicalModification of ProteinsSelected methods and analyticalprocedures)，Glazer，A.N.等(1975，Elsevier)；用于蛋白质修饰的化学试剂(Chemical Reagents for Protein Modification)，RL Lundblad(1991，CRC Press)。Tam等(生物聚合物(Biopolymers)(1998)46319-327)公开了高半胱氨酸(-CH2-CH2-SH)用于非-cys天然化学连接，接着使用对硝基苯磺酸甲酯(甲基化试剂)进行硫代烷基化作用，将高半胱氨酸侧链转化为天然甲硫氨酸侧链(-CH2-CH2-S-CH3)。本发明还用于将高半胱氨酸转化为假氨基酸，即，转化为除甲硫氨酸之外的氨基酸。但是，使用这里描述的半胱氨酸转化时，根据本发明，需要使用保护基团以避免包含至少一个不期望转化的天然半胱氨酸的肽的二硫键对中涉及的天然半胱氨酸的破坏。下面描述合适的保护基团。
假-天然化学连接方法不利于促进模拟一些核糖体特异性氨基酸的侧链(例如，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸和脯氨酸的侧链)，(但是丙氨酸侧链可以通过脱硫作用反应来形成(Liang，Z.Y.和Dawson，P.E.，通过天然化学连接结合脱硫作用合成没有半胱氨酸残基的肽和蛋白质(Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues byNative Chemical Ligation Combined with Desulfurization)，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，将其在这里并入本文引作参考)，其可以用来形成模拟很多核糖体特异性或非编码氨基酸的侧链。根据本发明的假-天然化学连接方法制备的氨基酸包含硫醚键，并且没有β-支化，其中它们在β位置都包括甲基，即，aa-CH2-S-。因此，可以制备β-支化的氨基酸、异亮氨酸和苏氨酸具有侧链结构的假-氨基酸变体，没有β几何学及其伴随的约束。
明显地，本发明的方法可以用来生成与核糖体特异性氨基酸一样长度，或者比该长度更长或更短的氨基酸侧链。侧链长度的这种改变可以用来稳定(或去稳定)三维构象，以提高蛋白质稳定性(或提高蛋白质改变其构象的能力)，从而接受与天然存在的蛋白质接受的那些不同范围的底物、抑制剂、受体、配体等。例如，Cys-CH2-SH+Br-CH2-COOH得到Cys-CH2-S-CH2-COOH(这样的″假-谷氨酸″具有一个另外的侧链原子，即-S-基团；或者，如果代替天冬氨酸使用，它则带有两个另外的侧链原子，即-CH2-S-基团)。其它侧链具有该侧链中相同数目的原子，但是不同之处在于包含硫醚键(-S-)。例如，Cys-CH2-SH+Br-CH2-CH2-NH-PG，接着去除PG，得到Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2。得到的结构侧链中没有另外的原子，但是用-S-置换了一个-CH2-基团。这里甲硫氨酸是另一个实施例，Cys-CH2-SH+I-CH2-CH3得到Cys-CH2-S-CH2-CH3(对Met-CH2-CH2-S-CH3的天然甲硫氨酸结构)；这样重新安置硫醚。精氨酸也是如此Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))得到Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))。优选地，可以使用特别是对于构建假赖氨酸来说对反应性氨基的保护，来避免不期望的副反应。一旦实现硫代烷基化反应，则去除保护基。
一般情况下，在期望尽可能模拟天然存在的蛋白质的情况下，最优选使用具有和该蛋白质中该位置正常存在的核糖体特异性氨基酸的长度相同的侧链长度的假氨基酸分子；较不优选的是使用具有比核糖体特异性氨基酸长度长一个原子的侧链长度的假氨基酸分子，更不优选使用具有比核糖体特异性氨基酸长度长两个原子的侧链长度的假氨基酸分子。此外，优选选择遗传变化不可能干扰功能或者其中相关的蛋白质中该位点的氨基酸是保守的位置中的半胱氨酸连接位点。通过丙氨酸扫描，同源性模拟，和其它方法可以鉴定这样的位点。
在-假天然化学连接中，含有氨基末端半胱氨酸残基的肽与具有羧基末端硫酯的肽连接，和在天然化学连接中一样。然后半胱氨酸的硫醇侧链与式Raa-X的化合物反应，其中X是好的离去基团，并且Raa是其结构模拟核糖体特异性的或合成的氨基酸的侧链的末端部分的基团。
明显地，假-天然化学连接反应以半胱氨酸侧链的天然L-构型或D-构型进行。使用D-构型能够在那个连接位点带来蛋白酶抗性，因此当期望提高蛋白酶水解能力时是理想的。但是，在使用D-半胱氨酸时，将改变那个位点的主链结构。这样的改变，除了蛋白酶抗性之外，预期会改变生物活性。但是，为了将对生物活性的影响最小化，优选使D-半胱氨酸位于高灵活性的位点上，例如无规区，例如位于位于得到的折叠的分子的表面上的无规环处，该分子无规末端上。期望的是，假-天然化学连接反应可以用来在合成的分子表面上放置大的带电荷侧链(例如，Lys，Arg，Asp或Glu的侧链)。
合适的好的离去基团的例子，X，包括卤原子，特别是碘和溴。Raa基团的例子包括PO4，COOH，COO，CONH2，鈲盐，胺，烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，咪唑，烷基化咪唑，吲哚，或烷基化吲哚基团。
选择使用哪一个Raa取决于特定位置期望存在的氨基酸侧链。因此，例如，通过制备两个肽片段可以合成具有下面氨基酸序列的期望的多肽或蛋白质aaNH2-Q-aax-aay-W-aaCOOH其中Q和W各自表示任选存在或不存在的另外的氨基酸残基，并且aax和aav表示内部相邻的残基(分别具有侧链x和y)，aaNH2和aaCOOH分别表示多肽或蛋白质的氨基(N-)末端残基和羧基(C-)末端残基，所述两个肽片段是aaNH2-Q-aax-COSR和Cys-w-aaCOOH其中Cys表示用半胱氨酸置换aay，并且R是任何与硫酯基团兼容的基团，包括但不限于芳基，苄基，和烷基。R的例子包括3-羧基-4-硝基苯基硫酯，苄酯，和巯基丙酸亮氨酸酯(参见，例如，Dawson等，Science(1994)266776-779；Canne等，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，等，WO 96/34878；Kent，等，WO 98/28434；Ingenito等，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073)。其它例子包括二硫苏糖醇，或烷基或芳基酯，它们可以通过intein-介导的生物技术制备，它们也是公知的(参见，例如，Chong等，Gene(1997)192277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等，蛋白质科学(Protein Science)(1998)72256-2264；和Cotton等，化学和生物学(Chemistry & Biology)(1999)6(9)247-256)；然后将片段连接在一起，形成aaNH2-Q-aax-Cys-W-aaCOOH。
连接的片段然后与Ry-X反应，其中Ry是模拟y侧链结构的侧基。反应在足以将半胱氨酸的硫醇转化为″假-y″侧链的条件下进行。例如，如果选择的Raa是CH2-COOH或(CH2)2-COOH，则反应将导致模拟天冬氨酸(″假-Asp″)或谷氨酸(″假-Glu″)的结构和功能的氨基酸残基。要明白，从上述描述来看，使用两个以上的肽片段可以进行更复杂的合成。
该方法的显著特征在于反应片段中不期望修饰的半胱氨酸残基被侧链保护，例如作为Cys(Acm)，来防止Cys残基而不是连接位点的其它残基的化学修饰，或者在于对反应片段中所有的其它Cys残基要在连接之后通过化学修饰反应同时生成相同的“假氨基酸”。
如这里使用的，符号表示苄基；IM表示咪唑基团；IN表示吲哚基团；PG表示保护基团。下面是用来根据本发明合成包含假氨基酸残基的肽的Raa侧基的总结(其中X是卤素(I，Br，Cl，F，其中I和Br是最优选的，F优选用于连接)碱性氨基酸Lys(没有额外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2-NH-PG，接着进行去保护作用，得到-CH2-S-CH2-CH2-NH2Arg(没有额外原子)-CH2-SH+X-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))得到-CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))His(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-IM得到-CH2-S-CH2-IM酸性氨基酸Asp(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-COOH得到-CH2-S-CH2-COOHGlu(1个额外原子)
-CH2-SH+X-CH2-COOH得到-CH2-S-CH2-COOH不带电荷的极性氨基酸Tyr(没有或1个额外原子)-CH2-SH+F--pOH得到-CH2-S--pOH)(没有额外原子，相同的几何学-CH2-SH+Br/I-CH2--pOH得到-CH2-S-CH2--pOH(1个额外原子)Gln(1个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)得到-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Asn(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)得到-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Ser(2或3个额外原子)-CH2-SH+X-CH2OH)得到-CH2-S-CH2OH(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2-OH得到-CH2-S-CH2-CH2OH(3个额外原子)Thr(2或3个额外原子，没有β支化)-CH2-SH+X-CH((CH3)(O-PG))，接着去除PG，得到-CH2-S-CH((CH3)(OH))(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(O-PG))，接着去除PG得到-CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))(3个额外原子)非极性氨基酸Leu(1或2个额外原子)-CH2-SH+X-CH((CH3)(CH3))得到-CH2-S-CH((CH3)(CH3))(1个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(CH3))得到-CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))(2个额外原子)Ile(2或3个额外原子，没有β支化)-CH2-SH+X-CH(CH3)-CH2-CH3得到-CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3(2个额外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3得到-CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3(3个额外原子)
Phe(1或2个额外原于)-CH2-SH+F-得到-CH2-S-(1个额外原子)-CH2-SH+Br/I-CH2-得到-CH2-S-CH2-(2个额外原子)Met(没有额外原子)-CH，-SH+I-CH2-CH3得到-CH2-S-CH2-CH3Trp(1个额外原子)-CH2-SH+F-IN得到-CH2-S-IN但是，在不方便或者不期望对蛋白质序列修饰以在用于连接的多肽的给定N-末端导入一个半胱氨酸或高半胱氨酸残基，或者在连接位点使用假氨基酸的情况下，使用其N-末端已经被修饰而包含有N-取代的，和优选地，Nα-取代的2或3个碳链氨基烷基或芳基硫醇从而允许使用没有半胱氨酸残基的多肽应用天然化学连接原理的多肽拓展天然化学连接的方法(参见美国专利申请顺序号No.60/231,339，引入本文作为参考)。
″拓展的天然化学连接″方法包括使包括羧基硫酯更优选α-羧基硫酯的第一成分与包括酸稳定性N-取代的，并且优选地，Nα-取代的，2或3个碳链氨基烷基或芳基硫醇的第二成分连接。第一成分的羧基硫酯和第二成分的N-取代的2或3个碳链烷基或芳基硫醇的硫醇之间的化学选择性反应通过硫酯-键合的中间体进行，并且拆分成最初的连接产物。更具体地，COSR硫酯成分和氨基烷基硫醇成分之间发生的硫醇交换产生硫酯-键合的中间体连接产物，其通过5-元或6-元环中间体在自发重排之后产生酰胺-键合的第一连接产物，是通过5-元或6-元环中间体取决于氨基烷基硫醇成分分别具有式I还是式IIJ1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 IJ1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1是具有一个或多个任选被保护的氨基酸侧链的肽或多肽、这样的肽或多肽的一部分、聚合物、染料、适当官能化的表面、连接基团或可检测标记、或者与化学肽合成或拓展的天然化学连接兼容的任何其它化学部分；R1，R2和R3独立地是H或者与C1连接的供电子基团；前提是R1，R2和R3至少一个包括与C1连接的供电子基团；并且J2是具有一个或多个任选被保护的氨基酸侧链的肽或多肽、这样的肽或多肽的一部分、聚合物、染料、适当官能化的表面、连接基团或可检测标记；或者与化学肽合成或拓展的天然化学连接兼容的任何其它化学部分。
在与肽相容的条件下，连接位点处的N-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]可以被去除，对产物没有损害，得到在连接位点处有天然酰胺键的下面的式III的最终连接产物J1-C(O)-HN-J2 III其中J1，J2，R1，R2，和R3如上定义。
选择R1，R2和R3基团以有利于N-C1键在肽相容裂解条件下裂解。例如，供电子基团，特别是如果与C1偶联，可以被用来在C1处形成有利于裂解的谐振稳定的阳离子。化学连接反应优选包括硫醇催化剂作为赋形剂，并且在有水或者混合的有机-水条件下在中性pH条件附近进行。第一成分和第二成分的化学连接可以通过经自发重排得到N-取代的酰胺键合的连接产物的五或六元环进行。其中第一成分和第二成分是肽或多肽的情况下，N-取代的酰胺键合的连接产物具有式IV或VJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IVJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2V其中J1，J2和R1，R2，R3和Z2如上定义。
N-取代的酰胺键合的连接产物的偶联的供电子基团R1，R2或R3有利于N-C1键的裂解和从N-取代的酰胺键合的连接产物上去除2或3碳链烷基或芳基硫醇。在肽相容裂解条件下去除N的烷基或芳基硫醇链产生在连接位点具有天然酰胺键的连接产物。当第一成分和第二成分是肽或多肽时，所述连接产物具有下式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X表I描述对于式IR1取代基的举例说明。
表I 表II描述对于式II R1，R2和R3取代基的举例说明。
表II 对于N-取代的2碳链化合物，苄基和吡啶甲基供电子取代基R1′，R3′和R5′在邻位或对位的位置对于连接之后保持用于Nα-C1键的强烈裂解的C1碳的电子共轭是必需的。但是，当R2和R3与C2和C3形成苄基时，R1′或R3′中的至少一个包含强供电子基团，其中R1′或R3′选自甲氧基(-OCH3)，硫醇(-SH)，羟基(-OH)，和硫代甲基(-SCH3)。对于其中R2和R3是氢原子的N-取代的3碳链硫醇，R1包括其中R1′，R3′和R5′包括或者强的或者中等的供电子基团或者它们的组合的苄基或吡啶甲基。带有N-取代的2碳链烷基或芳基硫醇情况，强供电子基团提高3碳链烷基或芳基硫醇对连接之后的裂解的灵敏性。因此可以相应选择特定的供电子基团或者它们的组合。
与N-取代的2碳链化合物相似，如果对于感兴趣的构建体中的取代作用是存在的话，本发明的N-取代的3碳链化合物可以包括作为R1′和R5′位置中的R1的取代基的硫醇。还是供电子硫醇基团与C1偶联并且其在这些位置的导入使得化合物具有形成连接作用的6-元环的两条途经。还提高了用于与α羧基硫酯反应的可获得的硫醇的局部浓度，并且就可改善连接的结构约束来说提供了另外的构象。
根据这里例如方案I和方案II中所描述的，并且根据本领域公知的标准有机化学技术，可以进行根据本发明的N-末端N-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇氨基酸的合成。参见，例如，高级有机化学，反应，机理和结构(Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure)，第四版，J.March(编著)，John Wiley & Sons，纽约，NY，1992；有机转化综述，官能团制备指南(Comprehensive OrganicTransformations，A Guide to Functional Group Preparations)，R.Larock(编著)，VCH Publishers，纽约，NY，1989。它们可以通过在溶液中合成，通过聚合物载体合成或者它们的结合来合成。优选的方法使用Nα保护的N烷基化的S-保护的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸前体。可以从很多商业来源获得用于合成的试剂。还有，大家公知可以以试剂盒等提供贮存以备以后使用的起始成分和各种中间体，例如各种氨基酸衍生物。
在制备本发明的N-末端Nα-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇氨基酸中，可以利用保护基团策略。在一般各种合成策略中使用优选的保护基团(PG)与固相肽合成(″SPPS″)是相容的。在某些情况下，使用在不同条件下可去除的正交保护基团也是必需的。很多这样的保护基团是公知的并且适合该目的(参见，例如，有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编著，John Wiley&Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“合成肽，使用者指南”(Synthetic Peptides，A User′sGuide)，G.A.Grant，编著，W.H.Freeman & Company，纽约，NY，1992；组合和固相有机化学的高等化学技术手册(Advanced ChemitechHandbook of Combinatorial&Solid Phase OrganicChemistry)，W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编著，高等化学技术(Advanced Chemtech)，1998；肽合成原理(Priciples of PeptideSynthesis)，第二版，M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；肽合成实践(The Practice of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；和保护基团(ProtectingGroups)，P.J.Kocienski，编著，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1994)。例子包括苄氧羰基(Z)，Boc，Bpoc，Trt，Nps，FmocCI-Z，Br-Z；NSC；MSC，Dde，等。对于硫部分，合适的保护基团的例子包括但不限于，苄基，4-甲基苄基，4-甲氧基苄基，三苯甲基，ACM，TACAM，呫吨基，二硫化物衍生物，吡啶甲基，和苯甲酰甲基。
更优选地，可以根据方案I(Nα-取代的前体的固相制备)，方案II(Nα-取代的前体的溶液相制备)制备Nα-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇。在方案I，应用聚合物载体有机合成标准方法在固相上直接组装Nα-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇，而应用标准偶联方法，方案II的Nα-保护的，N-烷基化的，S-保护的，氨基烷基或芳基硫醇氨基酸前体与树脂偶联。在制备外消旋或非对映异构体产物情况下，在用于拓展的天然化学连接之前必需通过标准方法将它们分离。
方案IECL辅助衍生化分子的固相合成 X＝卤素方案II 根据本领域公知的标准技术，例如这里描述的包括实施例描述的那些，可以通过化学或生物学方法制备α-羧基硫酯。对于化学合成，在溶液中或者从产生硫酯的树脂可以合成α-羧基硫酯肽，该项技术是公知的(参见，例如，Dawson等，Science(1994)266776-779；Canne等，Tetrahedron.Lett.(1995)361217-1220；Kent，等，WO 96/34878；Kent，等，WO 98/28434；Ingenito等，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073)；Amiato等，上文)。例如，从相应的肽α-硫代酸可以制备化学合成的硫酯肽，而肽α-硫代酸可以在硫酯-树脂上合成或者在溶液中合成，但是优选树脂方法。肽-α-硫代酸可以被转化为相应的3-羧基-4-硝基苯基硫酯，为相应的苄酯，为各种各样的烷基硫酯。所有的这些硫酯为连接反应提供了令人满意的离去基团，3-羧基-4-硝基苯基硫酯证实比相应的苄基硫酯反应速度多少快一些，而其又比烷基硫酯更具反应性。作为另一个例子，与三苯甲基相关的巯基丙酸亮氨酸硫酯-产生树脂可以被用来构建C-末端硫酯(Hackeng等，上文)。使用3-羧基丙磺酰胺安全-保护连接基团通过用重氮甲烷或碘代乙腈激活作用之后用合适的硫醇置换，也可以实现C-末端硫酯的合成(Ingenito等，上文；Bertozzi等)。
应用生物学方法，例如intein-介导的生物技术，也可以制备C-末端α-羧基硫酯肽(参见，例如，Chong等，Gene(1997)192277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等，ProteinScience(1998)72256-2264；和Cotton等，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。例如，可以使用有或没有象亲和性标记物的intein表达体系来开发产生C-末端二硫苏糖醇(DTT)酯肽或多肽片段的′intein′蛋白质-剪接元件的可诱导自身裂解活性。特别地，intein经历了例如DTT，b-巯基乙醇或半胱氨酸这样的硫醇存在下的特异性自身裂解，其产生带有C-末端硫酯的肽片段。参见，例如，Chong等，(1997)上文；Chong等，(1998)上文；Evans等，上文；和Cotton等，上文。但是，当使用重组制备的片段时，最终构建体的化学合成部分在包括的情况下一般含有聚合物修饰。
本发明的N-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇成分与第一羧基硫酯成分的连接产生在连接位点具有N-取代的酰胺键的连接产物。选择反应的连接条件来保持硫酯和N-取代的2或3碳链烷基或芳基硫醇部分的选择反应性。在优选的实施方案中，在pH6-8的缓冲溶液中进行连接反应，优选的pH范围是6.5-7.5。缓冲溶液可以是水溶液，有机溶液或者其混合物。连接反应还可以包括一种或多种催化剂和/或一种或多种还原剂、脂质、洗涤、其它变性剂或增溶剂等。优选的催化剂的例子是包含硫醇和膦的部分，例如苯硫酚，苄硫醇，TCEP和烷基膦。变性剂和/或增溶剂的例子包括鈲盐、水或有机溶剂例如TFE，HFIP，DMF，NMP中的脲，与水混合的或者与水中鈲盐和脲混合的乙腈。也可以利用温度来调节连接反应的速度，其一般在5℃和55℃之间，优选温度在15℃和40℃之间。作为一个例子，在pH在6.8和7.8之间的6M鈲盐中含有2％苯硫酚的反应体系中该连接反应顺利进行。
对于N-取代的2碳链烷基或芳基硫醇，COSR硫酯成分和氨基烷基硫醇成分之间发生的硫醇交换产生连接作用。交换产生硫酯-键合的中间体连接产物，其在自发重排之后通过5-元环中间体产生下式的第一连接产物J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2，该式在连接位点具有可去除的N-取代的2碳链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]，其中取代基如上定义。连接位点处的N-取代的2碳链烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]在肽相容条件下能够被去除，产生在连接位点具有天然酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。
对于N-取代的3碳链芳基或烷基硫醇，COSR硫酯成分与氨基烷基硫醇成分之间发生的硫醇交换产生硫酯-键合的中间体连接产物，其在自发重排之后通过6-元环中间体产生下式的第一连接产物J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2，该式在连接位点具有可去除的N-取代的3碳链烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]。连接位点处的N-取代的3碳链芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]在肽相容条件下能够被去除，产生在连接位点具有天然酰胺键的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最终连接产物。
优选在有利于N-C1键裂解的酸性条件下进行N-取代的烷基或芳基硫醇的去除，在该位点得到稳定的、未取代的酰胺键。所谓″肽-相容裂解条件″意指与肽相容的并且适合烷基或芳基硫醇部分从连接产物裂解的物理-化学条件。一般根据使用的α-取代的化合物选择肽相容裂解条件，这容易通过常规的公知的方法推出(参见，例如，有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编著，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，使用者指南”(SyntheticPeptides，A User′s Guide)，G.A.Grant，编著，W.H.Freeman &Company，纽约，NY，1992；组合和固相有机化学的高等化学技术手册(Advanced Chemitech Handbook of Combinatorial&Solid PhaseOrganic Chemistry)，W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编著，高等化学技术(Advanced Chemtech)，1998；肽合成原理(Priciples of PeptideSynthesis)，第二版，M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；肽合成实践(The Practice of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；和保护基团(ProtectingGroups)，P.J.Kocienski，编著，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1994)。
例如，在R1，R2或R3取代基包括甲氧基，羟基，硫醇或硫代甲基，甲基等的情况下，去除保护基的更普遍适用的方法包括一般用于肽合成化学的酸性裂解条件。这包括在有或没有还原剂和/或清除体系(例如，酸，如无水氟化氢(HF)，三氟乙酸(TFA)，或者三甲基磺酰基氟代乙酸(TMSFA)等)下，N-C1键在强酸性条件或水-酸性条件下的裂解。可以选择更有特异性的酸性裂解体系来优化Nα-C1键的裂解，以便对于给定构建体去除芳基或烷基硫醇部分。这样的条件是公知的并且与保持肽的完整性相容。可以包括硫醇清除剂，特别是在肽或多肽序列中存在色氨酸的情况下，以避免色氨酸侧链与自由芳基或烷基硫醇部分反应。硫醇清除剂的例子包括乙二醇，半胱氨酸，β-巯基乙醇和硫代甲酚。
其它具体的裂解条件包括光或当吡啶甲基是取代基时的还原-裂解条件。作为例子，当R1，或R2和R3取代基包括吡啶甲基部分时，可以根据标准方法，将光分解(例如，紫外光)，锌/乙酸或者电介质还原作用用于裂解。在N-取代的2碳链硫醇的R1在R1处包括硫代甲烷时，可以使用汞或HF裂解。当第一或第二连接成分包括其它保护基团时，对于从固相载体上自发裂解和/或作为去保护试剂，可以使用裂解体系。
在本发明的一个实施方案中，在肽合成步骤中使用Nα-取代的2或3链烷基或芳基硫醇(特别是在自动肽合成和正交和聚集于一点的连接策略中)，得到适当N-末端衍生化的多肽，其可以用作拓展的化学连接的底物，得到合成的生物活性蛋白质。这样的化合物包括完全保护的，部分保护的或完全未保护的酸稳定性式(PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2或(PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2的Nα-取代的2或3碳链氨基烷基或芳基硫醇，其下面表III和表IV中进行了描述。特别地，R1，R2和R3中的一个或多个包括与C1共轭的供电子基团，其在Nα-取代的氨基烷基或芳基硫醇转化为Nα-取代的酰胺烷基或芳基硫醇之后，在C1处能形成有利于Nα-C1键在肽相容裂解条件下裂解的谐振稳定的阳离子。PG1和PG2是保护基团，它们分别存在或者共同存在或者不存在，并且可以是相同或不同的，其中Z2是与化学肽合成或拓展的天然化学连接相容的任何化学部分，并且其中J2是与化学肽合成或拓展的天然化学连接相容的任何化学部分。PG1(或X1)是保护胺的基团。PG2(或X2)是保护硫醇的基团。很多这样的保护基团是公知的并且适合该目的(参见，例如，有机合成中的保护基团(Protecting Groups inOrganic Synthesis)，第三版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编著，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，使用者指南”(Synthetic Peptides，A User′s Guide)，G.A.Grant，编著，W.H.Freeman & Company，纽约，NY，1992；组合和固相有机化学的高等化学技术手册(Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial&Solid Phase Organic Chemistry)，W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编著，高等化学技术(Advanced Chemtech)，1998；肽合成原理(Priciples of Peptide Synthesis)，第二版，M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；肽合成实践(The Practice of PeptideSynthesis)，第二版，M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；和保护基团(Protecting Groups)，P.J.Kocienski，编著，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1994)。
表III PG1和XI的优选的保护基团的例子包括但不限于[Boc(叔丁基氨基甲酸酯)，Troc(2，2，2，-三氯乙基氨基甲酸酯)，Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)，Br-Z或Cl-Z(Br-或Cl-苄基氨基甲酸酯)，Dde(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)，MsZ(4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯)，Msc(2-甲基硫代(sulfo)乙基氨基甲酸酯)，Nsc(4-硝基苯基乙基磺酰基乙氧基羰基]。优选的PG1和X1保护基团选自“有机合成中的保护基团”(Protective Groups in Organic Synthesis)，第三版，Greene和Wuts，编著，Wiley-Interscience，(1999)，最优选的是Fmoc和Nsc。对于PG2的优选的保护基团的例子包括但不限于[Acm(乙酰氨基甲基)，MeoBzl或Mob(对-甲氧基苄基)，Meb(对-甲基苄基)，Trt(三苯甲基)，Xan(呫吨基)，tButhio(s-叔丁基)，Mmt(对-甲氧基三苯甲基)，2或4吡啶甲基(2或4-吡啶基))，Fm(9-芴基甲基)，tbut(叔丁基)，Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)]。优选的保护基团PG2和X2选自，“有机合成中的保护基团”(Protective Groups in Organic Synthesis)，第三版，Greene和Wuts，编著，Wiley-Interscience，(1999)，最优选的是Acm，Mob，MeB，吡啶甲基。
表IV 根据上文方案I和II可以制备本发明的Nα-取代的2或3链烷基或芳基硫醇的保护形式。
通过任何的各种各样的方法可以制备本发明的化合物，这些方法包括卤素-介导的氨基烷基化，还原胺化作用，和通过制备与固相氨基酸合成方法相容的Noc-保护的，N-烷基化的，S-保护的，氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸前体。期望时，可以通过标准技术将产生的外消旋体或非对映异构体拆分，得到可接受手性纯度的化合物。
III.优选的本发明水溶性聚合物和制备如这里使用的，术语″分子不均匀性″意指与蛋白质制备产物中的各蛋白质连接的聚合物分子的数目不同。术语″分子多样性″意指(a)聚合物修饰的蛋白质的位点不同，(b)蛋白质制备产物中相同蛋白质的不同位点或者不同蛋白质的相同位点处聚合物加成物的长度不同，或者(c)蛋白质制备产物中相同蛋白质的不同位点或者不同蛋白质的相同位点处聚合物加成物的任何支化程度和/或性质不同。如这里使用的，术语″分子同质″意指其中所有的蛋白质分子包含氨基酸序列并且在相同的位置包含相同的聚合物修饰的蛋白质的制备产物。两种或多种″分子同质″蛋白质制备产物的混合物在这里称作″分子确定的″制备产物。
根据本发明的该方面，解决上述聚合物非均匀性，多样性，和不适当问题的一个解答包括制备一类新的生物相容聚合物，它结合了两个多肽(精确长度，方便合成)和″pPEG″(″精密PEG″)，柔性的，两亲性，非免疫原性，不易蛋白酶水解的聚合物的优点，Rose，K.等(美国专利顺序号No.09/379,297，引入本文作为参考)。这一类新生物相容聚合物具有下式-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-n是整数，优选是1-100，更优选是2-100，其中X和Y是通过酰胺键连接的精确结构的生物相容重复单元。优选地，X和Y是没有反应官能团的二价有机基团，或者是不存在的并且是相同或不同的，并且可以不依赖每一重复单元(n)而变化。优选地，当n＝2时，X或Y之中至少一个选自取代的，未取代的，支化的和线性的脂肪族和芳香族基团。更优选地，X或Y之一选自苯基，C1-C10亚烷基部分，C1-C10烷基，含有杂原子的苯基，含有杂原子的C1-C10亚烷基部分，含有杂原子的C1-C10烷基，和它们的组合。
特别优选的pPEG部分具有下式
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-其中n优选是1-100，并且更优选是2-100；或者-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-，其中n优选是1-50，并且更优选是2-50。
可以通过各种各样的任何途径合成这样的pPEG部分，但是，优选地，利用固相一步一步的单元链组装方法制备这样的部分，而不是用聚合方法。应用这样的组装方法使得制备产物的部分具有确定的和同质的结构，如它们的长度，它们的X和Y取代基的性质，支化点的位置(如果有的话)，以及长度、X和Y取代基、和任何支化的位置。
优选地，通过例如下面的步骤合成这样的部分(a)用摩尔过量的具有式HOOC-X-COOH的二元酸衍生物将式Z-Q-载体的化合物的氨基或羟基酰化，其中Z是H2N-或HO-；Q是连接基团或靶分子；并且所述载体是固相，基质或表面；(b)活化步骤(a)的产物的自由羧基；(c)用摩尔过量的具有式NH2-Y-NH2的二胺将步骤(b)的产物胺解；和(d)任意地使用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所述X和Y是二价有机基团，或者是不存在的并且是相同或不同的，并且可以不依赖所述任选的各个重复单元而变化，并且与前面酰化和胺解步骤中使用的X和Y取代基是相同或不同的。
在优选的实施方案中，使用上述重复单元的6-链节，12-链节，18-链节和32-链节。如果期望，可以使用重复单元，例如，结合赖氨酸的氨基，形成支化的pPEG结构。pPEG可以通过各种化学过程与本发明的合成的蛋白质连接，包括硫醚，肟和酰胺键形成。
在一个实施方案中，单元的固相一步一步链组装方法包括步骤1保护的或未保护的二元酸与树脂上的氨基偶联，在键合位点产生酰胺键(其中PG是根据使用的二元酸存在或不存在的保护基团)PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-树脂步骤2树脂上如果存在保护基的话，去除树脂上的保护基(PG)HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂步骤3使保护的或未保护的二氨基与树脂上的羧基偶联，在键合位点产生酰胺键(其中PG根据使用的二氨基而存在或不存在)PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH-树脂步骤4树脂上如果存在保护基的话，去除树脂上的保护基(PG)-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-树脂步骤5将步骤1-4重复′n′次，加上′n′个单元，然后从树脂上裂解-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-。
如所讨论的，线性和支化的pPEG构建体是用于与本发明的合成的生物活性分子连接的优选的水溶性聚合物。使用的pPEGs带有在生理条件下带电荷或中性的侧链基团，根据使用的pPEG结构，在连接化学、长度、支化和溶解度方面可以变化。如上所述，本发明优选的pPEGs包括具有重复单元-CO-X-CO-NH-Y-NH-的水溶性聚酰胺，其中X和Y之一或两者包括水溶性重复单元，更优选′PEG′-基重复单元。虽然原则上讲脲低聚物易使用简单的两步固相方法得到，但是对于氨基树脂NH2-树脂和对称二胺NH2-Y-NH2的情况如下所述用羰基二咪唑活化→im-CO-NH-树脂用二胺NH2-Y-NH2氨解→NH2-Y-NH-CO-NH-树脂其中可以将这两步重复多次，得到具有重复单元-NH-Y-NH-CO-的脲低聚物，该方法较不优选。这是因为上述步骤的产率在室温下可能不是定量的，即使使用非常大量过量的试剂并且延长反应时间也是如此。因此，优选使用三步固相方法，下面对于氨基树脂NH2-树脂的情况给出说明，生成聚酰胺。为了避免同分异构产物，试剂HO2C-X-CO2H和NH2-Y-NH2应该是对称的。
用二元酸HO2C-X-CO2H酰化→HO-CO-X-CO-NH-树脂用羰基二咪唑活化→im-CO-OCO-X-CO-NH-树脂用二胺NH2-Y-NH2氨解→NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-树脂可以将这3个步骤按顺序重复多次，得到具有重复单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-的聚酰胺。所述聚合物具有精确数目的单体单元，X和Y在各步骤中可以独立地变化，并且可以根据愿望选择末端基团。例如，通过对于酰化步骤使用琥珀酸酐(″Succ″)，对于氨解步骤使用4，7，10-三氧杂-1，1，3-十三碳二胺(也称作″EDA″或″TTD″)，生成′PEG′-基聚酰胺，其中X是-CH2CH2-，Y是-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，并且重复单元是-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-。尽管存在该方法涉及没有保护基团的二价试剂这样的事实，但是当使用标准商售肽合成树脂时，交联不是问题(Rose等，(美国专利申请顺序号No.09/379,297)；和Rose等，J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)，除了下面提到的制备支化构建体的支化Lys核心的情况。
例如，可以用与在Rose等(美国专利申请顺序号No.09/379,297)和Rose，K.和Vizzavona，J.(J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)中描述的对于“化学体”构建体相似的方法制备支化pPEG构建体。因此，可以制备具有象赖氨酸支化核心这样的支化核心的支化pPEG构建体，该支化核心通过肟连接基团与优选的水溶性聚酰胺例如-(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-偶联。例如，聚酰胺的另一个端点的Lys侧链上的氨基氧酰基和赖氨酸核心上的乙醛酰之间容易形成肟键，例如四聚物核心(O＝CHCO)4Lys2Lys-。这样可以将各赖氨酸支化点之外的肟连接基团制备成-Lys(COCH2ON＝CHCO-)酰胺-结构。另一种构建方法，优选在偶联聚酰胺之后使用一保护的二胺和去保护作用，在聚酰胺和聚酰胺的自由侧链基团之间安置肟键，产生下面的四价支化的构建体[O＝CHCO-NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COCH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-不只是在二聚和四聚支化构建体的制备中可以应用肟化学，它还适用于组装八聚支化的构建体(Rose，K.，J.Am.Chem.Soc.(1994)11630；Rose，K.等，生物偶联化学(Bioconj.Chem.)(1996)7552)。当然当使用这样的pPEG聚酰胺时(参见，例如，图15)，对于这样的目的可以使用其它化学。此外，对于涉及Boc或Fmoc化学的肽合成的合成方案中可以插入聚酰胺生成，但是当详细说明这样的方案时，一定要记住氨解步骤去除Fmoc基团，并且如果应用Boc化学，则去除吲哚的甲酰基保护作用。
因此，可以制备这样的pPEGs，使其具有各种支化核心(例如，赖氨酸支化核心等)，通过选择的键(例如，酰胺，硫醚，肟等)，连接线性水溶性聚酰胺(例如，-(Succ-TTD)n-，等)，其中可以用期望的侧链基团(例如，羧基，氨基，酰胺等)保护各线性水溶性聚酰胺的自由末端，得到期望的电荷。此外，可以制备本发明的线性和支化pPEGs，使其包括用于与带有一个或多个独特的相互反应官能团的合成的蛋白质连接的特定官能团，并且pPEGs的侧链基团优选是非抗原性的(参见，例如，图15)。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及下式分子同质糖基模拟水溶性聚合物U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*其中U是独特官能团的残基，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是具有大于大约5000道尔顿的分子量的式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-50的不连续整数，并且当X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的基本上非抗原性的水溶性重复单元时，J*是在生理条件下具有选自负电荷、正电荷和中性的净电荷的基本上非抗原性的侧基的残基，并且其中s1，s2和s3是可以是相同或不同的并且各自可以存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。这样的聚合物包括美国专利申请序列号No.60/236,377中描述的那些，该专利全文引入本文作为参考。式U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*也可以用式U-B-聚合物-J*表示，其中可以存在或不存在间隔基团或连接基团s1，s2，s3。
图5-7详细说明了生成本发明的优选的糖基模拟聚合物的优选的方法。图5A-5B说明制备本发明的水溶性聚合物U-B-聚合物-J*的支化核心(B)和独特化学选择性官能团(U)的固相方法。该方法可以在溶液中进行，但是优选所示固相方法。特别地，图5A说明用反应基团正交保护的U-B前体部分 ，并且键连接的点 表示这样的构建体的基础几何结构；该基础几何结构不是要限制使用的化学键合或基团的类型，而只是详细说明构建结构的几何相对点，和适合产生本发明的U-B部分的化学确立点。正交保护的U-B前体在活化之后与包括合适的可裂解连接基团和辅助反应基团 的聚合物载体/树脂偶联，这能够与U-B前体共价键合 该系统应用聚合物-固载有机化学原理。偶联之后，如所举例所述处理支化核心(只指示出第一支化点，另外的支化点可以存在或不存在)，产生适合接着连接期望的聚合物成分例如基本上非抗原性水溶性线性聚合物的支化核心。还指出了U基团，合成开始时作为正交保护的U-B前体的一部分可以提供该U基团，或者在处理支化核心B期间或之后处理。可以在树脂上实现聚合物成分的连接，即，在裂解之前，优选的途经是从聚合物载体/树脂裂解U-B部分，这样产生U-B核心，将其纯化用于接下来的聚合物成分的连接。
如详细说明的，构建核心基团B的侧链支化点，使包括官能团(Func)，其可以是相同或不同的，并且可以可逆地被保护(PG，PG′或PG″)或不被保护。在各种情况下，连接聚合物成分的最后步骤包括在侧链支化点产生官能团(Func)，并且产生基团U(参见图7)。图5B说明另一种方法，其中与带有连接基团的聚合物载体结合使用保护的U-B前体，在裂解时产生期望的保护的或没有保护的U-基团。图5B还说明预先组装的支化核心B与聚合物载体的连接，使用产生U-基团的树脂制备U-B部分，用于接下来的聚合物成分的连接。
图6A-6D说明产生用于接下来的与U-B核心连接的本发明的优选的基本上没有抗原性的水溶性聚酰胺聚合物-J*成分的固相方法。虽然详细说明了固相方法，它是优选的方法，但是也可以采用溶液相方法来实现相同的最终结果。在图6A和6B中，应用固相有机化学原理将二元酸和二氨基单元偶联。任选地，可以插入保护的氨基-X′-酸和/或氨基-Y′-酸单元，为具有式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-聚酰胺结构的最终裂解产物中的基团X和Y带来另外的多样性。图6A说明N-至C-末端方向的合成，而图6B说明C-至N-末端方向的合成。在图6C和6D中，应用固相有机化学原理将保护的氨基-X′-酸和/或氨基-Y′-酸单元偶联。图6C说明N-至C-末端方向的合成，而图6D说明C-至N-末端方向的合成。从图6A-6D明显看出，根据对于合成进行的循环的次数，可以精确控制最终聚酰胺产物的性质。此外，可以构建侧基J*以事实上符合任何使用者确定的具体意图。使用单分散性重复单元X，Y，X′和Y′情况下，能够精确控制最终聚酰胺产物的精确分子结构。
图7说明U-B成分与聚合物-J*成分偶联产生式U-B-聚合物-J*的本发明优选的合成的聚合物构建体的优选方法。根据详细说明的，可以提供各种保护基团，并且任选地取决于给定构建体的想要的最终应用。还详细说明了制备期望的U-B-聚合物-J*构建体的不同途经，包括固相方法和溶液相方法。
如上所述，优选的水溶性重复单元包括聚氧化烯，聚酰胺氧化烯或者其衍生物。最优选的水溶性重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷。这样的水溶性重复单元的数目可以大大不同，但是更优选的这样的单元的数目是2-500，2-400，2-300，2-200，2-100，2-50，更优选2-32，最优选3-8。更优选的实施方案的一个例子是其中X和Y之一或两者选自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中n1是1-6，1-5，1-4，最优选1-3，并且其中n2是2-50，2-25，2-15，2-10，2-8，最优选2-5。高度优选的实施方案的一个例子是其中X是-(CH2-CH2)-，并且其中Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。更优选的是其中各n是不连续整数的单分散组合物。在高度优选的实施方案中，X是-(CH2-CH2)-，并且Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)n-，其中n是12-36。
特别地，当水溶性聚合物包含具有聚氧化烯重复单元例如环氧乙烷重复单元的聚合物链时聚合物是优选的，优选每一条链具有大约1500至大约42000道尔顿的分子量，优选大约2000至大约20000道尔顿是最优选的。
优选的U基团包括能化学连接的部分。当基团B包括三个或多个臂时，优选的聚合物是支化的。优选的成分J*包括在生理条件下可离子化的基团，最优选带负电荷的基团。U和J之一或两者可以包括能被去除并且对构建体的完整性没有损伤的保护基团。
优选的间隔基团或连接基团包括直链或支链部分和脂肪族部分，所述直链或支链部分包括在水溶性聚合物中使用的一个或多个重复单元、二氨基和/或二元酸单元、天然或非天然氨基酸或者其衍生物，所述脂肪族部分包括烷基，芳基，杂烷基，杂芳基，烷氧基等，其优选含有至多18个碳原子或者甚至另外一个聚合物链。
如上所述，成分U是能被连接的官能团的残基，或者其连接靶分子，例如肽或多肽，或者感兴趣的其它表面。当U是用于与靶分子偶联的官能团的残基时，U包括亲核基团或亲电子基团，靶分子分别包括相互反应的亲电子基团或亲核基团。
很多这样的相互反应官能团是已知的并且能与对肽和多肽来说常见的侧链官能团或衍生的侧链官能团连接(Zalipsky等，生物偶联化学(Bioconjugate Chemistry)(1995)6150-165；“生物偶联化学透视”(Perspectives in Bioconjugate Chemistry)，C.F.Meares，编著，ACS，1993；“蛋白质偶联和交联化学”(Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking)，S.S.Wong，编著，CRC Press，Inc.(1993))。官能团的例子包括能与氨基反应的基团，例如(a)碳酸酯，例如其对-硝基苯基酯，或琥珀酰亚胺基酯；(b)羰基咪唑；(c)二氢唑酮；(d)环酰亚胺硫酮；和(e)异氰酸酯或异硫氰酸酯。能与羧酸基团和反应羰基基团反应的官能团的例子包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼官能团，例如酰基酰肼，肼基甲酸酯，半氨基甲酸酯，硫代肼基甲酸酯，氨基氧基等。能与巯基或硫氢基反应的官能团包括苯基乙二醛，马来酰亚胺，和卤素。能与例如(羧)酸的羟基反应的官能团或者能与亲电子中心反应的其它亲核基团的例子包括羟基，氨基，羧基，硫醇基，活性亚甲基等。
例如，可以制备带有成分U作为用于与靶分子连接的官能团的上述聚合物，其中所述官能团是丙烯酸酯，醛，酮，氨基氧基，胺，羧酸，酯，硫酯，卤素，硫醇，氰基乙酸酯，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，环氧化物，酰肼，叠氮化物，异氰酸酯，马来酰亚胺，甲基丙烯酸酯，硝基苯基碳酸酯，原吡啶基二硫化物，硅烷，巯基，乙烯基砜，戊二酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸，tresylate等。U还可以是可活化形式，例如，可以转化成能与亲核物质例如胺反应的其活化酯的羧酸。
在优选的实施方案中，U是与靶分子上独特官能团选择性反应的独特官能团残基。本发明的该方面涉及上文第II部分讨论的肽合成(保护基团策略)和化学连接(部分或没有保护基团策略)的原理。因此，U代表例如上述那些很宽范围官能团的残基。优选的U基团能够进行胺保护策略(例如，通过形成半胺，形成亚胺，米歇尔加成而连接)，硫醇保护策略(例如通过形成硫醇化物，通过二硫化物互换而连接)，天然化学连接策略(例如，通过涉及包含侧链氨基酸衍生物的半胱氨酸或硫醇的硫酯交换连接)，和正交连接偶联策略(例如，例如通过形成噻唑烷，通过硫酯交换，通过硫酯形成，通过二硫化物交换，和通过酰胺形成而连接)(参见，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)。特别优选的U包括与例如上文第II部分描述的水相容化学连接化学中使用的独特官能团的残基。因此U可以是能形成选自下面的键的官能团碳酸酯，酯，尿烷，原酸酯，酰胺，胺，肟，酰亚胺，脲，硫脲，硫醚，硫代尿烷，硫酯，醚，噻唑烷，腙，噁唑烷等。优选的键是肟和酰胺键。
如上所述，B是具有三个或多个臂的支化核心部分，并且可以存在或不存在。当B存在时，一条臂与U或连接U的间隔基团或连接基团连接，各个其他臂与聚合物或连接聚合物的间隔基团或连接基团连接。支化核心B的例子包括但不限于氨基，酰胺，羧基，和它们的组合。这些包括赖氨酸的酰胺寡聚物(oligoamides)等，或者从烷二胺和丙烯酸制备的寡聚物(″聚酰氨基胺″)，后者在支化核心提供净正电荷。(参见，例如，Zeng等，J.Pept.Sci.(1996)266-72；Rose等，生物偶联化学(Bioconjugate Chem.)，(1996)7(5)552-556；Novo生物化学目录和肽合成手册(NovoBiochem Catalog and Peptide SynthesisHandbook)，Laufelfingen，2001；Wells等，生物聚合物(Biopolymers)(1998)47381-396；Mahajan等，(1999)404909-49-12；Judson等(1998)391299-1302；Swali等，(1997)624902-4903；美国专利Nos.5,932,462、5,919,455、5,643,575、5,681,567)。可以使用很多其它不同的支化点，并且适合该目的，包括取代的二元胺，取代的二元酸，烷基酸，例如甘油和具有三个或多个有官能团或可活化的基团包括多价烷基、芳基、杂烷基、杂芳基和烷氧基等的其它部分，和寡糖(例如Nierengarten等，Tetrahedron Lett.(1999)405681-5684；Matthews等，Prog.Polym.Sci.(1998)1-56；Suner等，大分子(Macromolecules)(2000)33253；Fischer等，Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38884；Sunder等，Adv.Mater.(2000)12235；Mulders等，Tetrahedron Lett.(1997)38631-634；Mulders等，Tetrahedron Lett.(1997)3830-3088；和Turnbull等，Chembiocehm(2000)1(1)70-74)。与聚合物成分连接的最优选的支化核心是通过酰胺键连接的。
优选的支化核心来自氨基，羧基或混合的氨基和羧基官能团。优选的支化核心的例子分别是赖氨酸氨基核心，天冬氨酸或谷氨酸支化核心，和γ-谷氨酸支化核心。此外，优选的支化的聚合物构建体是其中支化源自单一支化核心例如酰胺寡聚物或聚酰氨基胺核心的那些。然而，可以使用其它种类的支化的构建体，例如象蠕虫一样的结构，其中支化源自沿着聚合物主链分布的多个支化核心的序列(Schlüter等，Chem.Int.Ed.(2000)39864)。根据聚合物主链和重复单元的化学组成和/或大小，可以将得到的象蠕虫一样的结构设计成水溶性或易于诱导液体结晶组织(Ouali等，Macromolecules(2000)336185)，对于传递应用、稳定性和作用时间，其是有利的。对于本发明的其它支化的聚合物构建体，制备象蠕虫一样的结构使含有包括U的侧链官能团。
例如如上文第I部分讨论的，聚合物成分、或者一个或多个间隔基团或连接基团，可以包括生物稳定或生物可降解的聚合物链或者间隔连接基团或者键。如上文第I部分讨论的，成分J*是在生理条件下带有选自负电荷、正电荷和中性的净电荷的侧基的残基。最优选的是其中J*包括可离子化羧酸酯部分并且在生理条件下带有净负电荷。成分s1，s2，和s3是可以相同或不同，并且可以分别存在或不存在的间隔基团或连接基团部分，如第I部分讨论的那些。最优选地，所述间隔基团或连接基团包括聚合物链，其中间隔基团或连接基团包括一个或多个式-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-的重复单元。
IV.本发明优选的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质如上所述，聚合物修饰的合成的细胞因子和趋化性细胞因子特别包括本发明优选的实施例。更优选的细胞因子是糖蛋白。很多这样的细胞因子是糖蛋白，包括例如很多白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子等。举例来说，细胞因子例如EPO，TPO，GCSF,GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，Ifα-II，IF-γ，LIL，IF-β，神经生长因子，和Rantes并且很多其它趋化因子是糖蛋白，并且这些和其它的这样的蛋白质的糖基化位点是公知的。
EPO是其氨基酸序列可以用来辅助设计具有红细胞生成刺激作用活性的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的蛋白质的特别优选的例子。集落刺激因子和RANTES也构成其氨基酸序列可以用来辅助设计本发明范围内的合成的生物活性蛋白质的蛋白质的特别优选的例子。
EPO是负责在稳定状态条件下调节血红细胞产生和促进血红细胞质在出血之后恢复的主要因素(Jelkmann，W.(1992)Physiol.Reviews72449；Krantz，S.B.(1991)Blood77419；Porter，D.L.和M.A.Goldberg(1993)Exp.Hematol.21399；Nissenson，A.R.(1994)血液纯化(Blood Purif.)126)。人EPO的循环形式是分子量大约30000的165个氨基酸(aa)糖蛋白(Sawyer，S.T.等(1994)Hematol.Oncol.Clinics NA 8895；Jacobs，K.J.等，Nature(1985)313806；Lin，F-K等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)827580)。虽然EPO的cDNA预测到了具有166个氨基酸残基的分子，但是在翻译后修饰中去除羧基-末端精氨酸。对于N-键联的糖基化作用有三个可能的位点，并且全部是填满的。也存在一个O-连接碳水化合物部分。糖基化作用是复杂的。尽管没有糖基化的大肠杆菌衍生的EPO体外表现出全部的生物学活性，但是对于体内的全部活性来说糖基化作用显然是必需的。因此，大肠杆菌产生的和去糖基化作用的天然衍生的EPO在动物研究中表现出非常低的活性(Krantz，S.B.(1991)Blood77419；Sasaki，H.等(1987)，J.Biol.Chem.26212059；Lowy，P.H.等(1960)Nature185102；Wojchowski，D.M.等，Biochem.Biophys，Acta 910224；Dordal，M.S.等(1985)内分泌学(Endocrinology)1162293)。
与上述相一致，不同的糖基化模式表现出不同的效果。例如去唾液酸化EPO体外表现出增强活性并且体内表现出降低活性，该效果归因于肝细胞识别、键合和清除的半乳糖残基的暴露(Spivak，J.L.和B.B.Hogans(1989)Blood 73v90；Goldwasser，E.等(1974)J.Biol.Chem.2494202)。全部唾液酸化EPO的支化模式也使得生物活性不同。主要是四-antennary支化的EPO表现出和“标准”EPO相同的活性，而主要是二-antennary支化的EPO体外表现出高三倍的活性，但是体内只是正常活性的15％(Takeuchi，M等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867819)。研究表明只有N-连接而不是O-连接的糖对EPO功能是重要的(Higuchi，M.等(1992)J.Biol.Chem.267770319)。
在特别优选的实施方案中，本发明的合成的生物活性蛋白质包括聚合物修饰的合成的红细胞生成刺激蛋白。如这里使用的，红细胞生成刺激蛋白是介导血红细胞产生的蛋白质。可以通过各种各样的方法测定蛋白质的红细胞生成刺激生物活性，例如通过体内施用之后的红细胞生成，通过测定蛋白质介导EPO-依赖细胞系增殖的能力等。
优选的红细胞生成刺激蛋白是哺乳动物，最优选人EPO及其类似物(参见美国专利5856298；5955422；8888772；5858347；5614184；5457089和6077939；和WO00/32772)。主要是通过肾的肾小管和小管毛细内皮和间质细胞合成和分泌红细胞生成素。慢性肾病引起肾中产生EPO的细胞的破坏。结果缺乏EPO常常诱导贫血。因此EPO的主要临床应用是治疗严重肾亏(血细胞比容低于0.3)并且还常常接受输液的患者和治疗化疗之后贫血的患者。一般地，对于临床应用，在仓鼠卵巢细胞中重组合成EPO。EPO是成熟形式有165个氨基酸残基的相对热-和pH-稳定的酸性(pI＝4.5)蛋白质。EPO通过EPO-受体传送其活性。大约40％的EPO分子量归因于其糖基化作用。糖基化作用是体内决定EPO药物动力学行为的重要因素。非糖基化EPO具有非常短的生物学半寿期。体外其仍然结合其受体并且甚至可能具有更高的特异性活性。然而，最近的实验证明EPO的PEG化作用显著延长了其寿期，但是在以细胞为基础的测定系统中显著降低EPO活性。
本发明优选的合成的红细胞生成刺激蛋白(″SEPs″)优选是人尿EPO的聚合物修饰的合成的类似物。在优选的实施方案中，它们包含通过硫醚、肟、酰胺或其它连接与一个或多个肽残基连接的一个或多个聚合物部分(最优选pPEG部分)。在更优选的实施方案中，这样的连接处于人尿EPO天然糖基化作用位置的一处或多处(即，位置24，38，83和126)。最优选地，SEP分子在这样的位置的两处或多处具有pPEG部分。在另一个实施方案中，聚合物部分可以修饰其它蛋白质残基。对于本发明的合成的生物活性蛋白质的修饰的位点包括位于蛋白质的无规环、区或结构域的残基，或者在或接近可能的蛋白质裂解位点。例如，可以在EPO的9，69和/或125的一个或多个位置引入聚合物修饰。本发明SEP分子的总分子量可以是大约25至大约150kDa，更优选大约30至大约80kDa。通过增加或减少用于给定类似物的修饰的聚合物(例如pPEG)的数目和结构可以控制分子量。较大构建体的pPEG介导的流体动力学MW大于大约100kDa。在表达人EPO受体的细胞体外测试中，表明本发明的SEPs具有和重组产生的糖基化人EPO相同的ED50。
优选通过使氨基氧基、酮或醛官能化pPEG在带有氨基氧基、酮或醛官能团侧链的非天然编码氨基酸处与SEP蛋白质连接来构建肟-连接聚合物pPEG类似物。例如，SEP-0和1的位置89和117包含假谷氨酸酯(带有式-CHα-CH2-S-COOH侧链的非天然编码氨基酸(与谷氨酸侧链-CHα-CH2-CH2-COOH)相比较)。使用硫醚键优选构建SEP类似物，使包含带有硫醇侧链的半胱氨酸或非天然氨基酸提供的硫醇官能团。图10说明一种类型优选的合成的红细胞生成刺激蛋白的基础结构。
在另一个实施方案中，本发明的SEP分子可以包括″循环交替变换″EPO类似物，其中EPO的天然氨基和羧基末端重新安置。最优选地，这样的重新安置将氨基和羧基末端移至低结构约束位置，，例如至无规环等。位置125和126(相对天然EPO残基编号体系)附近的无规环是这样的重新安置位点的一个例子。更优选地，这样的SEPs没有二硫化物，经化学修饰在预先选择的残基处包含聚合物部分。
或者，SEP分子可以具有对于天然存在的糖基化位点或者对于能糖基化的其它位点例如位置126和125，来说重新安置的氨基和羧基末端。SEP分子还可以包括修饰氨基和羧基末端以去除或改变电荷(例如通过羧基酰胺化作用等)。在这样的循环交替变换分子的优选的例子中，分别由位置126和125提供新的N-和C-末端。优选用不能形成二硫化物桥的非天然编码氨基酸L-α-N-丁酸(Aba)置换位置7，29，33和161处的天然的形成二硫键的半胱氨酸。优选用丙氨酸置换残基R166，E37和V82以改善制备。还有，在相对天然EPO编号系统的位置1和166之间优选插入另外一个半胱氨酸，下面将其编号为′0′。得到的分子含有四个半胱氨酸(位置126、0、38，和83(从N-至C-末端方向读取))，其被用作(1)连接位点和(2)形成硫醚的pPEG连接位点。任选地，半胱氨酸可以置换A125，提供另外的pPEG连接位点。
本发明这样的SEP分子的总分子量可以从大约25至大约150kDa，更优选从大约30至大约80kDa变化。通过增加或减少用于给定类似物的修饰的聚合物(例如pPEG)的数目和结构可以控制分子量。较大构建体的pPEG介导的流体动力学MW大于100kDa。任选的pPEG连接位点位于位置125、9、和24(从N-至C-末端方向读取)。附加的SEP类似物设计在无规环区具有另外的N-和C-末端，和/或来自新的N-和/或C-末端的截短的残基。图11给出了优选的循环交替变换分子的基础结构。
例如，通过下面的方法将人EPO的天然序列循环交替变换来设计序列通过附加的Cys残基使天然N-末端Ala1和C-末端Arg166连接，这样给出167个氨基酸的多肽；通过在天然序列的残基125-126处解除链连接产生新的N-和C-末端；用L-□氨基-正丁酸残基置换所有的天然Cys残基；并且进行下面的取代作用Glu37Ala；Asn38Cys；Val82Ala；Asn83Cys；Ser126Cys；Arg166Ala(所有的残基编号以人EPO天然序列为基础)。同时，这些设计要素产生所示的SEP-5的氨基酸序列。通过米歇尔加成反应，用马来酰亚胺-修饰的线性(TTD-Succ)6羧基化聚合物构建体在Cys残基126，0，24，38，和83(编号以人EPO序列为基础)对SEP-5-L28蛋白质进行聚合物修饰。设计这些变化以改进SEP-5-L28蛋白质的合成和处理。从四个肽片段制备设计的序列，每个肽片段带有N-末端Cys残基。化学连接位点是Cys0，Cys38，Cys83。合成这样的肽，其中C-末端肽是□-羧酸酯；另三个肽是□-硫酯，N-末端Cys残基因此是侧链Acm保护的。Cys24是侧链没有保护的。接着通过天然化学连接使片段顺序连接，用C-末端的两个片段起始。连接之后，连接位点的自由Cys侧链通过米歇尔加成反应与马来酰亚胺-修饰的线性(TTD-Succ)6羧基化聚合物构建体反应，然后去除Cys侧链Acm保护基团，用相同的方式进行下一个片段的连接和聚合物修饰。去除Acm基团之后，进行下一个(第四个)片段的连接，去除最后的Acm基团，用相同的方式进行聚合物修饰，得到上述循环交替变换的聚合物修饰的SEP构建体并且如图38所示。
在另一个实施方案中，本发明合成的生物活性蛋白质是哺乳动物，最优选人C-GSF。G-CSF诱导嗜中性粒细胞的快速增殖和释放到血流中，从而提供了对抗感染的治疗效果。人GCSF蛋白质长度是174个氨基酸(专利EP0459630(Camble，R.等)，并且分离出了其序列变体(参见，例如美国专利6004548；4810643；5218092；5214132；5416195；和5580755)。该蛋白质具有四个半胱氨酸残基和苏氨酸位置133处一个O-糖基化位点。
在这样的合成的GCSF分子的一个实施方案中，该分子的氨基酸序列可以相对于天然GCSF的序列而有所改变，这样在位置1，2或3的一处或多处包含中性，更优选非天然编码的，疏水性残基。任选地，对这样的分子进一步修饰，使在GCSF的位置5，和/或位置173和/或174包含另外一个中性，或更优选非天然编码的，疏水性残基。
在另一个优选的实施方案中，合成的GCSF分子可以在位置63，64和/或133的一个或多个位置和/或位置1和174的一个或多个位置进行聚合物修饰(优选pPEG)。pPEG聚合物可以是线性或支化的，带电荷，不带电荷，或混合的；并且可以具有大约5至大约80kDa，更优选大约40至大约70kDa的分子量，pPEG总MW贡献取决于用于修饰的pPEGs的数目和结构。流体动力学范围表现出体内更大的MW效果(例如10kDa支化的pPEG表现出大约55kDa的有效MW)。估计pPEG介导的流体动力学MW大于100kDa。
对于利用肟键的类似物，pPEG优选与带有侧链氨基氧基、酮或醛官能团的非天然编码残基连接。对于利用硫醚键的类似物，pPEG优选与带有硫醇侧链的半胱氨酸或非天然氨基酸连接。对于利用酰胺键的类似物，pPEG与带有反应性胺侧链的天然或非天然氨基酸连接。
图12给出了合成的生物活性的GCSF蛋白质的基本结构。在该图中，“J”表示具有疏水性侧链的非天然编码的残基。
通过常规方法可以测定这样的聚合物修饰的合成的生物活性GCSF蛋白质的生物活性，例如通过测定它们介导因子-依赖性人或鼠细胞系(例如NFS60细胞系)的增殖的能力，或者通过测定体内嗜中性白细胞刺激作用，半寿期和免疫原性，有或没有送递系统定向＞20天半寿期/释放)。
在另一个实施方案中，本发明合成的生物活性蛋白质是哺乳动物最优选人趋化因子，RANTES。RANTES阻断M-回归HIV毒株进入初级受体CCR5，并且还下调哮喘，移植排异和伤口愈合中涉及的发炎途径(Kalinkovich A等，Immunol Lett.(1999)68281-287)。本发明的合成的RANTES分子优选与化学修饰的RANTES趋化因子不同，在于(1)正壬酰基(“NNY”)取代RANTES1-68的位置1发现的N-末端丝氨酸；和(2)用带有疏水性侧链的非天然编码的氨基酸取代位置3位的酪氨酸。发现这样的化合物是非常有效的，与重组“Met-RANTES1-68”的mM范围相比，具有pM范围的ED50。
制备具有一个或多个上述另外变化的潜在的RANTES类似物，例如用带有疏水性侧链的非天然编码的氨基酸置换位置2位的脯氨酸，和通过脂肪酸与该分子的C-末端连接。通过对相应于RANTES残基12-20的N-环区的修饰，结合效力提高了受体特异性。在另一个优选的实施方案中，本发明合成的RANTES分子在它们的N-或C-末端插入了聚合物部分(例如pPEG，或壬酰基(“NNY”)或Y3X，以改善特别是体内的半寿期。pPEG部分优选通过肟键与位置66，67，68或位置68处的连接基团，优选在负责聚集区的区的位置67导入的非天然编码的氨基酸连接。脂肪酸优选通过肟键(优选通过连接基团)与残基68连接，例如氨基氧基修饰的氨基酸二-或三肽连接基团。也可以利用其他连接化学。这样的合成的RANTES类似物的更大构建体的分子量范围是大约25kDa至大约45kDa，取决于pPEG连接的性质和结构，对于更大构建体，具有大于60kDa的pPEG介导的流体动力学MW。优选的合成的RANTES类似物的结构如图13所示。
V.药物本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质可以用作有效治疗疾病和症状的药物制剂。最优选地，当对需要治疗的患者或个体施用时，可以利用药物送递系统施用这样的合成的生物活性多肽和/或蛋白质。使用这样的系统使得药物能以其可以被接受并且增强期望的生物活性效果的方式呈递给患者。本发明的目的，优选的药物送递体系包括能通过口、鼻、或吸入途经、或者肌内、皮下、经皮、静脉内、intraurally或眼内施用多肽或蛋白质的系统。
这样的药物送递系统可以包括提供定点释放的制剂，或者提高对肠粘膜的保护作用的制剂。合适的制剂包括干粉末制剂，通过病毒颗粒胶囊化的送递，脂质体胶囊，透皮贴，电子辅助送递(电穿孔治疗)和聚合物/niazone偶联。
在优选的实施方案中，这样的药物送递装置将响应生物学环境的改变和在这些变化基础上的送递-或停止送递-药物。可以使用很多种材料来控制药物和其他活性成分的释放聚(氨基甲酸乙酯)，聚(硅氧烷)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(乙烯醇)用于亲水性和强度；聚(乙烯)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)，聚(正-乙烯基吡咯烷酮)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(乙烯醇)，聚(丙烯酸)，聚丙烯酰胺，聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物，聚(乙二醇)，聚(甲基丙烯酸)，等。在进一步优选的实施方案中，使用生物可降解聚合物以有利于药物送递。这样的聚合物包括聚交酯(PLA)，聚乙交酯(PGA)，聚(交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)，聚酐类，和聚原酸酯。美国专利6,072,041；6,041,253；6,018,678；6,017,318；6,002,961；5,879,712；5,849,331；5,792,451；5,783,212；5,766,633；5,759,566；5,690,954；5,681,811；5,654,000；5,641,511；5,438,040；4,810,499；和4,659,558描述了药物送递装置，和它们的使用方法。
因此，本发明的另一方面涉及药物组合物和治疗需要这种治疗的哺乳动物的方法，该方法包括施用治疗有效量的包括本发明聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的化合物，或者其药学可接受盐。所谓″药学可接受盐″意指保持了本发明的多肽的生物学效力和性质并且不是生物学或者其它方面不期望的盐。盐可以从酸或碱衍生。酸加成盐从无机酸和有机酸衍生，所述无机酸是例如盐酸，氢溴酸，硫酸(得到硫酸盐和硫酸氢盐)，硝酸，磷酸等，所述有机酸是例如乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，马来酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，杏仁酸，甲磺酸，乙磺酸，唾液酸，对-甲苯磺酸等。碱加成盐可以从无机碱衍生，并且包括钠盐，钾盐，锂盐，铵盐，钙盐，镁盐等。从有机碱衍生的盐包括从下面的化合物形成的那些伯、仲和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代的胺，环胺，包括异丙基胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺，乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，氨基三丁醇，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，哈胺，胆碱，甜菜碱，乙二胺，葡萄糖胺，N-烷基葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶等。优选的有机碱是异丙胺，二乙基胺，乙醇胺，哌啶，氨基三丁醇，和胆碱。
这里使用的术语″治疗″包括哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，并包括(i)对可能易于患有这种疾病但是还没有诊断患有这种疾病的受试者预防这种疾病的发生；(ii)抑制疾病，即阻止其发展；或者(iii)减轻疾病，即使疾病消退。
这里使用的术语″通过用蛋白质拮抗剂或激动剂治疗而预防或减轻哺乳动物的疾病状态″意指包括一般来说用蛋白质抑制剂有用治疗的本领域一般所知的所有的疾病状态，和发现通过用本发明特定化合物治疗而有用地预防或减轻的那些疾病状态。这些包括，详细说明而不是限制，哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，病毒性疾病，动脉粥样化/动脉粥样硬化，类风湿性关节炎和器官移植排异。
这里使用的术语″治疗有效量″指当对需要它的哺乳动物施用时足以有效治疗(如上定义)的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的量，例如，作为抗炎药物，抗哮喘药物，免疫抑制剂，或抗自身免疫疾病药物，以抑制哺乳动物病毒感染。构成″治疗有效量″的量随着蛋白质衍生物，要治疗的哺乳动物的症状或疾病及其严重程度，其体重，年龄等而不同，但是本领域普通技术人员根据经验和这里公开的内容可常规决定。这里使用的，术语″足量(q.s.)″指加足以实现所述功能的量，例如使溶液达到期望的容积(例如，100mL)。
以治疗有效剂量，即当对需要它的哺乳动物施用时，如上所述，足以有效治疗的量施用本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质及其药学可接受盐，即活性成分。这里描述的合成的生物活性蛋白质的施用可以通过具类似用途的药物的任何可接受的给药途径施用。如这里使用的，术语″本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质″、″本发明的多肽的药学可接受盐″和″活性成分″可互换使用。
制剂中聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的含量可以在本领域技术人员使用的全范围内变化，例如以制剂总体为基础大约0.01重量百分比(％w)至大约99.99％w的蛋白质拮抗剂或激动剂和大约0.01％w至99.99％w的赋形剂。更典型地，聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质以大约0.5％w至大约80％w水平存在。
对于本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质还优化了人剂量水平，一般情况下，施用的化合物的量当然取决于预防或减轻所针对的受试者和疾病状态，病痛的性质或严重程度，给药方式和时间表，和主治医师的判断。这样的使用优化在本领域普通技术人员的判断之内。
可以通过任何可接受的全身或局部途径施药，例如通过肠胃外，口服(特别是幼儿用制剂)，静脉内，鼻，支气管吸入(即，气雾剂)，经皮或局部途经，形式是固体，半固体或液体，或气雾剂形式，例如片剂，丸剂，胶囊，粉末，液体，溶液，乳状液，可注射液，悬浮剂，栓剂，气雾剂等。本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质也可以以持续或控制释放剂量形式施药，包括贮存注射液，渗透泵，丸剂，透皮贴(包括电运输)等，用于以预定速度延时施用多肽，优选以适合一次施用精确剂量的单位剂量形式。组合物包括常规药用载体或赋形剂和本发明的蛋白质拮抗剂或激动剂，和，另外，可以包括其它药用试剂，药学试剂，载体，佐剂等。载体可以选自各种油，包括石油，动物油，植物油或合成油来源的那些，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。水、盐水、葡萄糖水溶液、二元醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物载体包括淀粉，纤维素，滑石，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸镁，硬脂酸钠，甘油一硬脂酸酯，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇等。其它合适的药物载体和它们的制剂描述于″Remington′s PharmaceuticalSciences″，由E.W.Martin著。
如果期望，要施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等，例如，乙酸钠，脱水山梨糖醇一月桂酸酯，三乙醇胺油酸盐等。
虽然可能需要多种活性成分，可以使用口服给药来送递本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质，应用常规的每天给药剂量方案，根据期望的预防程度或者病痛减轻的程度调整给药方案。对于这样的口服给药，通过混入任何常规使用的赋形剂制备药学可接受的无毒性组合物，所述赋形剂例如制药级甘露糖醇，乳糖，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，croscarmellose钠，葡萄糖，明胶，蔗糖，碳酸镁等。这样的组合物采用的形式是溶液，悬浮液，可分散片剂，丸剂，胶囊，粉末，缓释制剂等。口服制剂特别适合治疗肠胃失调。对于一般全身目的的口服生物利用率可以通过使用赋形剂改善全身循环吸收的来调节，例如含有乙酰化氨基酸的制剂，参见，例如，US5,935,601和US 5,629,020。
组合物可以采用胶囊、丸剂或片剂形式，因此组合物可以含有活性成分和稀释剂，例如乳糖，蔗糖，磷酸二钙等；崩解剂，例如croscarmellose钠，淀粉或者其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；和粘合剂，例如淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮，阿拉伯胶，明胶，纤维素和其衍生物等。
液体药学可施用的组合物可以例如通过将本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质(大约0.5％至大约20％)和任选的制药佐剂溶解、分散等于载体中等来制备，所述载体是例如水，盐水，葡萄糖水溶液，甘油，二元醇，乙醇，防腐剂等，从而形成溶液或悬浮液。如果期望，要施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，例如湿润剂，悬浮剂，乳化剂或增溶剂，pH缓冲剂等，例如，乙酸钠，柠檬酸钠，环糊精衍生物，聚氧乙烯，脱水山梨糖醇一月桂酸酯或硬脂酸酯等。制备这样的剂量形式的实际方法是公知的，并且对于本领域技术人员是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，宾夕法尼亚。在任何情况下，要施用的组合物或制剂含有有效预防或减轻接受治疗的受试者症状的量的活性成分。对于对婴儿口服，优选液体制剂(例如糖浆或悬浮液)。
对于含有液体、溶液或悬浮液的固体剂量形式，例如碳酸丙二醇酯，植物油或甘油三酯，优选在明胶胶囊中制成胶囊。对于液体剂量形式，例如在聚乙二醇中的溶液，可以用足量的药学可接受液体载体例如水稀释至施用易于测量的程度。
或者，通过将活性成分溶解或分散于植物油，二元醇，甘油三酯，丙二醇酯(例如碳酸丙二醇酯)等中，可以制备液体或半固体口服制剂，并且在硬或软明胶胶囊壳中将这些溶液或悬浮液制成胶囊。
在施用本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质治疗上述症状中，优选肠胃外进行这里描述的活性成分的给药。肠胃外给药一般特征在于注射，或者皮下，或肌内或静脉内，并且可以包括经皮或腹膜内注射或胸骨内注射或灌注技术。可以用常规方法制备可注射药，制成液体溶液或悬浮液，适合在注射之前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式或者乳液形式，或者生物相容聚合物-基微球体(例如脂质体，聚乙二醇衍生物，聚(D，C)交酯等)形式。合适的赋形剂是例如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等。另外，如果期望，要施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，增溶剂，蛋白质载体等等，例如，乙酸钠，聚氧乙烯，脱水山梨糖醇一月桂酸酯，三乙醇胺油酸盐、环糊精、血清清蛋白等。
本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质可以肠胃外施用，例如，通过将化合物溶解于合适的溶剂(例如水或盐水)中或者掺入脂质体制剂中，接种分散到可接受的输入用液体中。本发明的多肽的典型的日用剂量可以通过一次输注施用，或者通过一系列固定时间间隔的输注进行。对于肠胃外给药，特别合适的是水溶形式的活性成分的水可溶形式，例如水溶性盐形式，或者含有增粘物质的含水注射悬浮液，所述增粘物质是例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖，如果期望，和稳定剂。任选地混合有赋形剂的活性成分也可以是冻干物形式，并且可以在肠胃外给药之前通过加入合适的溶剂而制备成溶液。
最近提出的肠胃外给药的方法利用缓慢释放或持续释放体系植入法，这样保持恒定水平的剂量。参见，例如，US3,710,795，US5,714,166和US5,041,292，将它们在此引入本文作为参考。
这样的肠胃外用组合物中含有的活性成分百分比高度取决于多肽的特定性质，以及多肽活性，和受试者的需要。然而，溶液中活性成分的百分比是0.01％至10％是可使用的，如果组合物是固体，则可以更高一些，固体接着被稀释至上述百分比。优选地，在溶液中组合物含有0.02-8％的活性成分。
施用本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的另一种方法使用大丸剂注射和连续输注。
气雾剂给药是将本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质直接送递给呼吸道的有效方法。该方法有一下几点好处1)它防止了酶降解作用，胃肠道不好的吸收作用，或者由于肝的第一道作用的治疗物质的损失；2)施用活性成分，而这些活性成分否则由于它们的分子大小、电荷或者对肺外位点的亲合力而不能达到它们在呼吸道中的目标位点；3)通过肺泡对身体提供了快速吸收；和4)避免其它器官体系接触活性成分，在接触可能引起不期望的副作用的情况下这一点是重要的。因为这些原因，气雾剂给药对于治疗哮喘，肺部局部感染和肺部和呼吸道的其它疾病或病状是特别有利的。
有三种类型的药物吸入装置雾化器吸入器、剂量计量吸入器和干粉吸入器。雾化器装置产生高速空气流，其使得蛋白质衍生物(配制成液体形式)象雾一样喷出，雾载着药物进入患者呼吸道。剂量计量吸入器一般具有装有压缩气体的制剂，并且在开动时，通过压缩气体放出计量量的多肽，这样提供了施用确定用量药物的可靠方法。干粉吸入器施用能够通过仪器在呼吸时分散在患者呼吸的空流中的自由流动的粉末形式的多肽。为了获得自由流动粉末，蛋白质衍生物与赋形剂例如乳糖一起配制。计量用量的蛋白质衍生物贮存在胶囊形式中，并且每次开动都分配给患者。所有上述方法都可以用于施用本发明。
以脂质体为基础的药物制剂也适用于本发明的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质。例如，参见，US5,631,018，US5,723,147，和5,766,627。相信脂质体的优点与药物的脂质体包埋得到的组织分布和药物动力学参数的有利变化相关，并且可以由本领域技术人员对本发明的多肽应用。也可以利用用于注射或口服施用的控制释放脂质体液体药物制剂。
对于通过栓剂的全身给药，传统的粘合剂和载体包括例如聚乙二醇类或甘油三酯类，例如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。这样的栓剂可以从含有大约0.5w/w％至大约10w/w％；优选大约1w/w％至大约2w/w％范围的活性成分的混合物形成。
本说明书中提到的所有的公开物和专利申请在这里并入本文作为参考，其引入程度就象各个公开物或专利申请被具体地和各自地指出并入本文作为参考的程度一样。包括这里对本发明背景的讨论，以解释本发明的内容。这不是承认任何引用的材料在世界任何地方到任何权利要求的优先权日之时为止是公开的、已知的、或者是现有技术的一部分或公知常识。现在已一般性描述了本发明，通过参考下面的实施例更容易理解本发明，提供实施例是为了详细说明而不是要限制本发明，除非具体指出。
实施例缩写Acm＝乙酰氨基甲基硫醇-保护基团[即-CH2NHCOCH3]
AoA＝氨基氧基乙酰基Arg(Tos)＝L-精氨酸(侧链NG甲苯磺酰基-保护的)ART＝绝对网状细胞计数Asp(cHex)＝L-天冬氨酸(侧链环己基酯-保护的)AUC＝曲线下面积Boc＝叔丁氧羰基CD＝环状二向色性CDI＝羰基二咪唑CHO＝中国仓鼠卵巢CL＝清除率(mL/hr/kg)Cmax＝最大浓度Cys(4MeBzl)＝L-半胱氨酸(侧链(4-甲基)苄基-保护的)Cys(Acm)＝L-半胱氨酸(侧链乙酰氨基甲基[即-CH2NHCOCH3]-保护的)DCM＝二氯甲烷DIC＝二异丙基碳化二亚胺DIEA＝二异丙基乙胺DMF＝二甲甲酰胺DMSO＝二甲亚砜DPC＝十二烷基胆碱磷酸Dpr＝L-1，2-二氨基丙酸ED50＝达到50％最大效果所需要的有效剂量EDA＝(4，7，10)-三氧杂十三烷-1，13-二胺ELISA＝酶联免疫测试EPO＝红细胞生成素ES-MS＝电子喷射离子化作用质谱FBS＝胎牛血清Glu(cHex)＝L-谷氨酸(侧链环己基酯-保护的)GM-CSF＝粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子HATU＝O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐HCT＝血细胞比容HGB＝血红蛋白
His(Dnp)＝L-组氨酸(侧链NIm二硝基苯基-保护的)HOBT＝N-羟基苯并三唑HPLC＝高压液相色谱IMDM＝Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基IPA＝异丙醇Lev＝乙酰丙酸Lys(CIZ)＝L-赖氨酸(侧链2-氯苄氧羰基)-保护的MBHA＝4-甲基二苯甲基胺MRT＝平均停留时间MTT＝4-甲基三苯甲基MTT＝噻唑基蓝NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺-OCH2-Pam-树脂＝-O-CH2-Bz-CH2CONHCH2(苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)-树脂Pbo＝4-(CH3S(O)-)苄基PBS＝磷酸盐缓冲盐水PCV＝压缩的细胞体积RBC＝血红细胞RET＝网状细胞rhEPO＝重组人EPORSA＝大鼠血清白蛋白SDS＝十二烷基硫酸钠SDS-PAGE＝SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Ser(Bzl)＝L-丝氨酸(侧链苄基-保护的)氨基酸的单字母代码A＝丙氨酸；C＝半胱氨酸；D＝天冬氨酸；E＝谷氨酸；F＝苯丙氨酸；G＝甘氨酸；H＝组氨酸；I＝异亮氨酸；K＝赖氨酸；L＝亮氨酸；M＝甲硫氨酸；N＝天冬酰胺；P＝脯氨酸；Q＝谷氨酰胺；R＝精氨酸；S＝丝氨酸；T＝苏氨酸；V＝缬氨酸；W＝色氨酸；Y＝酪氨酸；SPPS＝一步一步固相肽合成Succ＝丁二酰基[即-COCH2CH2CO-]TCEP＝三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
TFE＝2，2，2-三氟乙醇Thr(Bzyl)＝L-苏氨酸(侧链苄基-保护的)氨基酸的三字母代码Ala＝丙氨酸；Arg＝精氨酸；Asn＝天冬酰胺；Asp＝天冬氨酸；Chg＝环己基甘氨酸；Cys＝半胱氨酸；Gln＝谷氨酰胺；Glu＝谷氨酸；Gly＝甘氨酸；His＝组氨酸；Ile＝异亮氨酸；Leu＝亮氨酸；Lys＝赖氨酸；Met＝甲硫氨酸；Phe＝苯丙氨酸；Pro＝脯氨酸；Ser＝丝氨酸；Thr＝苏氨酸；Thz＝4-硫代脯氨酸；Trp＝色氨酸；Tyr＝酪氨酸；Val＝缬氨酸Trp(甲酰基)＝L-色氨酸(侧链NIn甲酰基-保护的)TTD＝(4，7，10)-三氧杂十三烷-1，13-二胺Tyr(BrZ)＝L-酪氨酸(侧链2-溴苄氧羰基-保护的)Vc＝中心腔隙分布体积实施例1合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-0的合成制备合成的红细胞生成刺激蛋白(SEP)。该全长合成蛋白的序列(指定″SEP-0(1-166)″)是APPRLICDSR VLERYLLEAKEAEKITTGCAEHCSLNEKITVPDTKVNFYA WKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKψAISPPDAASAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO1)其中ψ表示在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基。在溶液中从四个多肽片段合成SEP-0蛋白质片段SEP-01(GRFN1711；由SEQ ID NO1的残基1-32构成)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯片段SEP-02(GRFN1712，由SEQ ID NO1的残基33-88构成)CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSEAVLRGQALLV KSSQPW-硫酯(其中Cys33是Acm保护的)
片段SEP-03(GRFN 1713，由SEQ ID NO1的残基89-116构成)CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-硫酯(其中Cys89是Acm保护的)片段SEP-04(GRFN 1714，由SEQ ID NO1的残基117-166构成)CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中C-末端半胱氨酸(Cys161)带有吡啶甲基(pico)保护基)通过在ABI433A自动肽合成仪上对于Boc(叔丁氧羰基)化学过程的原位中和作用方法和使用确定的SPPS，侧链保护作用和硫酯-树脂策略(Hackeng，等，PNAS(1999)9610068-10073；和Schnolzer，等，Int.J.Pept.Prot.Res.，(1992)40180-193))的一步一步固相肽合成(SPPS)，或者通过人工链组装，在硫酯-产生树脂上合成肽SEP-01和SEP-02和SEP-03，或者从商家定购或购买。例如，使用一套标准的Boc SPPS保护基团，即Arg(Tos)；Asp(cHex)；Cys(4MeBzl)&Cys(Acm)；Glu(cHex)；His(DNP)；Lys(CIZ)；Ser(Bzl)；Thr(Bzl)；Trp(甲酰基)；Tyr(BrZ)；Met，Asn，Gln没有侧链保护。类似地在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-04。根据标准Boc化学方法，使用HF/对-甲酚将肽去保护，同时从树脂载体上裂解。然而，那些包含在HF/对-甲酚中没有去除的含保护基团的肽，保护基团仍然保留着。通过制备C4反相高压液相色谱(HPLC)纯化肽。应用ES-MS(电子喷射离子化质谱)鉴定含有纯肽的级分，集中并且冻干，用于下面的连接作用。
步骤1连接#1 片段SEP-04和片段SEP-03溶解于TFE，浓度是15mM。加入含有6M盐酸胍和1％苯硫酚的饱和的磷酸缓冲液(pH 7.9)，得到肽片段澄清溶液。连接之后，将连接混合物加到2ml TFE(三氟乙醇)，6ml 6M盐酸胍，含有25％β-巯基乙醇的100mM磷酸盐的溶液中，并且温育20分钟。用15mg/ml TCEP(三(2-羧基乙基)膦.HCl)的冰醋酸溶液将该溶液酸化，并且加载到制备C4反相HPLC柱子上(1英寸直径)。然后通过制备梯度反相HPLC纯化肽。通过ES-MS鉴定含有期望的连接产物SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04的级分，并且合并这些级分。
步骤2Acm-去除#1 对于Acm去除，用HPLC级水将含有SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04合并级分的乙腈水溶液稀释一倍，并且加入固体脲使最终浓度是2摩尔浓度。加入三倍摩尔过量的(相对总的预期的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备反相HPLC柱子，并且梯度步骤纯化。通过ES-MS鉴定含有期望产物SEP-03+SEP-04的级分并且冻干过夜。
步骤3连接#2 将等量的SEP-03+SEP-04和SEP-02一同溶解于纯TFE中，浓度是15mM。加入含有6M盐酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，得到肽片段的澄清溶液。进行一天连接作用之后，将连接混合物加给10ml TFE，10mlβ-巯基乙醇，10ml哌啶和20ml 6M盐酸胍，pH4的溶液中，并且温育20分钟，以去除任何残留的保护基团。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述溶液酸化，加载给制备反相HPLC柱子，并且用线性梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望连接产物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04的级分并且冻干过夜。
步骤4羧甲基化作用 SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04溶解于TFE，浓度是15mM。加入两倍摩尔过量的(v/v)含有6M盐酸胍的200mM磷酸缓冲液(pH 7.9)，得到肽片段的澄清溶液。加入25倍过量的溶解于最少量甲醇的溴乙酸，使该溶液反应2小时。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述溶液酸化，加载给制备反相HPLC柱子，并且用步骤梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的羧甲基化产物SEP-0Aem+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et的级分并且将这些级分合并。
步骤5吡啶甲基去除 锌屑在2M HCl中活化30分钟。将肽SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et溶解于纯TFE中，浓度大约10mg/ml。用含有(新加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸(即N-十二烷酰基肌氨酸钠)的6M盐酸胍，100mM乙酸盐，pH4将上述溶液稀释4倍(v/v，相对于TFE)。将该溶液加给活化的锌粉。以约1小时时间间隔监测反应，5小时之后反应完全。反应完全之后，去除上清液，并且用含有20％TFE的含有35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸的6M盐酸胍，pH4，100mM乙酸盐，将残留的锌粉洗涤两次5分钟，并且用含有20％β-巯基乙醇的相同的溶液洗涤一次。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述合并的产物酸化，加载给制备反相HPLC柱子，并且用步骤梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的修饰的产物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的级分并且将这些级分合并。
步骤6Acm-去除#2 用HPLC级水将SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico合并溶液稀释三倍，并且加入固体脲使最终浓度是2摩尔浓度。加入三倍摩尔过量的(相对总的预期的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备反相HPLC柱子，并且步骤梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望产物SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的级分，用含有2倍(w/w，相对于肽质量)DPC(十二烷基胆碱磷酸)的水稀释2倍(v/v)并且冻干过夜。
步骤7连接#3 将等量的SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico和SEP-01一同溶解于纯TFE中，浓度是15mM。加入含有6M盐酸胍的250mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，向该溶液加入1％苯硫酚。进行一天连接作用之后，将连接混合物加给10ml TFE，10ml β-巯基乙醇，10ml哌啶和20ml 6M盐酸胍，pH4的溶液中，并且温育20分钟，去除任何残留的保护基团。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述溶液酸化，加载给制备反相HPLC柱子，并且用线性梯度纯化。通过电子喷射质谱鉴定含有期望连接产物SEP-0(1-166)(SEQ ID NO1)的级分，用含有2倍(w/w，相对于肽质量)十二烷基肌氨酸的水稀释2倍(v/v)并且冻干。
步骤8折叠将全长连接肽SEP-0(1-166)溶解于含有6M盐酸胍和20％TFE和10倍摩尔过量(相对于蛋白质中Cys残基)的半胱氨酸的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)。室温下该溶液用含有3M盐酸胍的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)透析过夜。然后室温及4℃下该溶液用含有1M盐酸胍的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)透析4小时，并且最后4℃下用10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)透析4小时，得到最终折叠的产物。通过电子喷射ES-MS和CD(环状二向色性)光谱法证实折叠。
步骤9纯化在centricon浓缩器小瓶中将折叠的多肽浓缩5倍，并且加载给用10mM磷酸盐，pH 7.0平衡过的Resource S阳离子交换柱。用10分钟内达到500mM NaCl的线性盐梯度洗脱折叠的蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定含有期望的折叠产物SEP-0(1-166)的级分，并且在-80℃下冷冻并贮存。折叠蛋白质产物的分析反相HPLC色谱和ES-MS谱和CD谱证实折叠蛋白质的存在。
实施例2合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-L30的合成合成在SEP-0的位置24和126包含形成肟的基团的第二种合成的红细胞生成刺激蛋白(指定为SEP-1-L30)。然后使用这些基团生成SEP-1-L30，其中线性(EDA-Suce-)18羧酸酯(EDA＝(4，7，10)-三氧杂十三烷-1，13-二胺，也称为TTD；Succ＝-CO-CH2CH2CO-)聚合物与蛋白质主链连接。全长SEP-1(1-166)序列是APPRLICDSR VLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYA WKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)
其中ψ代表由在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基，并且其中KOX代表在ε-氨基处化学修饰有通过肟键与指定的水溶性聚合物偶联的肟连接基团的非天然赖氨酸。SEP-1-L30的结构也在图17中给出。
图16说明下面描述的SEP1-L30化学合成的图示说明。简要地说，在图16(A)和16(B)中，通过形成肟键的化学连接反应，水溶性聚合物GRFN32(GP32)与肽SEP-11和SEP-14连接。如图所示，肽SEP-11在位置32带有C-末端Yaa基团，其包括用于接下来的天然化学连接的组氨酸α-羧基硫酯，和位置24(天然人EPO的糖基化位点)处非天然赖氨酸残基，其侧链经化学修饰而带有Un＝1基团，其包括氨基氧基酰基部分。给出相应于最终全长产物的位置1的N-末端丙氨酸为参考。肽SEP-14在包括一个半胱氨酸的位置117具有一个未保护的N-末端Xaa基团，在位置126(天然人EPO的糖基化位点)有包括氨基氧基酰基修饰的赖氨酸的Un＝1基团，和位置161处有吡啶甲基保护的侧链硫醇的半胱氨酸(形成二硫化物的半胱氨酸)。保护Cys161，防止其在下面的在天然化学连接位点导入的半胱氨酸的转化中发生硫代烷基化作用(参见图16(D))；还有，使用吡啶甲基保护基，因为它的去除与在第一天然化学连接反应中去除Acm(乙酰胺基甲基)保护的半胱氨酸所要求的条件交叉(参见图16(C))。通过形成肟的化学连接实现在位置24和126处的GP32聚合物构建体的定点专一连接，得到精确聚合物修饰的肽SEP-11+GP32和SEP-14+GP32。图16C说明SEP-14+GP32与中间肽片段SEP-13的天然化学连接和SEP-13-SEP+14+GP32的产生，其连接位点在Lys1166和Cys117。如图所示，肽SEP-13在包括Acm保护的半胱氨酸的位置89包括一个N-末端Xaa基团，和包括赖氨酸α-羧基硫酯的位置116处的C-末端Yaa基团。天然化学连接之后，去除Acm保护基，制备连接产物，用于下面的连接反应。图16D说明SEP-13+SEP-14+GP32和中间肽片段SEP-12的天然化学连接和SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP32的产生，其连接位点是Trp88和Cys89。如图所示，SEP-12包括带有Acm半胱氨酸的位置33处的N-末端Xaa基团，和带有色氨酸α-羧基硫酯的位置89处的C-末端Yaa基团。天然化学连接之后，使连接产物接触溴乙酸，使连接位点半胱氨酸89和117的侧链硫醇进行羧甲基化作用，这样它们转化为假谷氨酸。羧甲基化作用之后，去除Acm和吡啶甲基保护基，制备没有保护的聚合物修饰的连接产物，用于下面的连接反应。图16E说明SEP-13-SEP14+GP32和肽片段SEP-11+GP32(相应于全长产物N-末端片段)的天然化学连接和全长SEP-1-L30产物SEP-11+GP32+SEP-12+SEP13+SEP-14+GP32的产生，其最后连接位点是His32和Cys33。如图所示，全长SEP-1-L30产物包括在使用者确定的位点处专一连接的两个水溶性聚合物(G32)，即，糖基化位点相应于天然人EPO的位置24和126。下面描述合成细节。
A.GRFN1776和GRFN1711与GRFNP32的肟化作用实现肟生成，使带有氨基氧基乙酰基的水溶性聚合物与带有酮羰基的肽连接。为了实现它，合成下面的肽片段片段SEP-14(GRFN1776；由SEQ ID NO2的残基117-166组成)CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸残基，并且其中Cys117被Acm保护)片段SEP-11(GRFN1711，由SEQ ID NO2的残基1-32组成)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中Lys24修饰有乙酰丙酸残基)片段SEP-11(GRFN1711)和实施例1一样，在产生硫酯的树脂上合成，并且在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基团在ε-氨基处保护这两个肽片段的赖氨酸24和126。链组装完全后，根据标准Fmoc去保护程序将带有Fmoc的氨基去保护，并且分别使乙酰丙酸与各肽树脂连接而修饰。然后按实施例1所述方法，将肽去保护，同时从树脂载体上裂解。通过制备C4反相HPLC纯化肽。应用ES-MS鉴定含有纯肽的级分，合并并且冻干，用于下面的连接。根据标准方法在产生羧基的Sasrin树脂上组装GRFNP32[-(EDA-Succ)18羧酸酯](Rose，K.等，美国专利申请顺序号No.09/379,297；Rose，等，J Am Chem Soc.(1999)1217034)。通过偶联5倍过量的活化的Boc-氨基氧基乙酸，使氨基氧基乙酰基(AoA)部分连接聚合物的N-末端氨基。应用常规的Fmoc-化学方法使聚合物链从树脂载体上裂解。通过制备C4反相HPLC纯化聚合物链。应用ES-MS鉴定含有纯聚合物的级分，合并并且冻干，用于下面的连接。
片段SEP-14和GRFNP32一起以等摩尔比例溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后冻干溶液。溶解干燥的粉末，并且通过制备梯度C4反相HPLC从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP-14+GP32的级分，合并并且冻干。
片段SEP-11和GRFNP32一起以等摩尔比例溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后冻干溶液。溶解干燥的粉末，并且通过制备梯度C4反相HPLC从未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP-11+GP32的级分，合并并且冻干。
B.合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-L30的合成从四个多肽片段在溶液中合成SEP-1-L30片段SEP-11+GP32(GRFN1711+GRFNP32，相应于SEQ IDNO2的残基1-32)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过以KOX表示的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键与GRFNP32偶联)片段SEP-12(GRFN1712，相应于SEQ ID NO2的残基33-88)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中Cys33被Acm保护)片段SEP-13(GRFN 1713，相应于SEQ ID NO2的残基89-116)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中Cys89被Acm保护)片段SEP14+GP32(GRFN 1776+GRFNP32，相应于SEQ IDNO2的残基117-166)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过以KOX表示的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键与GRFNP32偶联，并且其中C-末端半胱氨酸带有吡啶甲基(pico)保护基)
和实施例1所述一样进行另外的肽的制备，连接反应，羧甲基化作用，保护基去除反应，折叠和纯化，得到全长的折叠的SEP-1-L30。折叠蛋白质产物的分析反相HPLC色谱和ES-MS谱和CD谱证实折叠蛋白质的存在。
实施例3合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-L26的合成合成在SEP-0的位置24和126包含形成肟的基团的第三种合成的红细胞生成刺激蛋白(指定为SEP-1-L26)。然后使用这些基团生成SEP-1-L26，其中线性聚合物(EDA-Succ)18羧酸酯和(EDA-Succ)6-酰胺一起分别通过位置24和126处的肟键与蛋白质主链连接。全长SEP-1(1-166)序列是APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ代表由在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基，并且其中KOX代表在ε-氨基处化学修饰有通过肟键与指定的水溶性聚合物偶联的肟连接基团的非天然赖氨酸。
与SEP-1-L30相反，设计SEP-1-L26构建体使带有在位置126处连接的更小的不带电荷的水溶性聚合物。位置24处连接的聚合物与SEP-1-L30中的相同。按实施例2所述组装全长产物。SEP-1-L26的结构如图18所示。
A.GRFN1776与GRFNP6的肟化作用和GRFN1711与GRFNP32的肟化作用进行肟生成作用，使带有氨基氧基乙酰基的水溶性聚合物与带有酮基羰基的肽连接。为了实现它，合成下面的肽片段片段SEP-14(GRFN 1776；由SEQ ID NO2的残基117-166组成)
CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸残基，并且其中Cys117被Acm保护)片段SEP-11(GRFN1711，由SEQ ID NO2的残基1-32组成)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中Lys24修饰有乙酰丙酸残基)按实施例1所述，在产生硫酯的树脂上合成片段SEP-11(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基团在ε-氨基处保护这两个肽片段的赖氨酸24和126。链组装完全后，根据标准Fmoc去保护程序将带有Fmoc的氨基去保护，并且在校准偶联程序后，分别使乙酰丙酸与各肽树脂连接而修饰。和实施例1一样按照标准Boc-化学方法，然后将肽去保护，同时从树脂载体上裂解。通过制备C4反相HPLC分离纯化肽。对于每个肽，应用ES-MS鉴定含有纯肽的级分，合并并且冻干，用于下面的连接。
根据标准方法在产生羧基的Sasrin树脂上组装水溶性聚合物(EDA-Succ)18羧酸酯(GRFNP32)(Rose，K.等，美国专利申请顺序号No.09/379,297；Rose，等，J Am Chem Soc.(1999)1217034)。根据标准方法在产生酰胺的Sieber树脂上组装水溶性聚合物(EDA-Succ)6-酰胺(GRFNP6)(Rose，K.等，美国专利申请顺序号No.09/379,297；Rose，等，J Am Chem Soc.(1999)1217034)。通过偶联5倍摩尔过量的活化的Boc-氨基氧基乙酸使氨基氧基乙酰基(AoA)部分连接每个树脂键合的聚合物的N-末端氨基。应用常规的Fmoc-化学方法使两个聚合物链分别从各自树脂载体上裂解。通过制备反相HPLC纯化各聚合物链。对于各聚合物，应用ES-MS鉴定含有纯聚合物的级分，合并并且冻干，用于下面的连接。
片段SEP-14和GRFNP6一起以等摩尔比例溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后冻干溶液。溶解干燥的粉末，并且通过制备梯度C4反相HPLC从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP-14+GP6的级分，合并并且冻干。
片段SEP-11和GRFNP32一起以等摩尔比例溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，然后冻干溶液。溶解干燥的粉末，并且通过制备梯度C4反相HPLC从未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP-11+GP32的级分，合并并且冻干。
B.合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-L26的合成从四个多肽片段在溶液中合成SEP-1-L26片段SEP11+GP32(GRFN1711+GRFNP32，相应于SEQ IDNO2的残基1-32)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过以KOX表示的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键与GRFNP32偶联)片段SEP-12(GRFN 1712，相应于SEQ ID NO2的残基33-88)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中Cys33被Acm保护)片段SEP-13(GRFN1713，相应于SEQ ID NO2的残基89-116)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中Cys89被Acm保护)片段SEP14+GP32(GRFN1776+GRFNP6，相应于SEQ IDNO2的残基117-166)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过以KOX表示的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键与GRFNP6偶联，并且其中C-末端半胱氨酸[即Cys161]带有吡啶甲基(pico)保护基)和实施例1和2所述一样进行另外的肽的制备，连接反应，羧甲基化作用，保护基去除反应，折叠和纯化，得到全长的折叠的SEP-1-L26。折叠蛋白质产物的分析C4反相HPLC色谱和ES-MS谱和CD谱证实折叠蛋白质的存在。
实施例4合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B50的合成合成第四种合成的红细胞生成刺激蛋白(指定为SEP-1-B50)，全长SEP-1-B50的氨基酸序列与SEP-1-L30的相同APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRS LTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ代表由在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基，并且其中KOX代表在ε-氨基处化学修饰有通过肟键与指定的水溶性聚合物偶联的肟连接基团的非天然赖氨酸。
但是，蛋白质衍生有具有四个线性(Succ-EDA)12部分而不是线性(Succ-EDA)18聚合物的支化SEP-1-L30聚合物构建体。通过肟键完成衍生化作用。
图19图示说明下面详细描述的通过形成肟连接而与SEP-1-B50连接的支化的水溶性聚合物GRFNP29(GP29)的化学合成。如图19所示，使用正交保护的赖氨酸U-B前体产生U-B成分GRFN17(GP17)，其带有作为U基团的氨基氧基酰基，并且具有带有四个通过硫醚键与指定为GP29的线性水溶性聚酰胺环氧乙烷构建体依次偶联的侧链硫醇的3X赖氨酸支化核心B，其带有由琥珀酸残基带来的侧链羧酸酯。按实施例2所述组装全长产物。SEP-1-B50结构如图20所示。
A.带有多个硫醇基团的模板GRFNP17的合成以0.4毫摩尔规模，在生成酰胺的(4-甲基)二苯甲胺(MBHA)-树脂上人工合成模板GRFNP17。应用标准偶联方法偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH(Schnlzer，M.，Int J Pept Protein Res.(1992)40180-93)。使用3.8ml 0.5M HBTU中的2.1毫摩尔氨基酸，10％DIEA；即5倍过量的氨基酸。去除Fmoc保护基后，应用标准氨基酸偶联方法偶联Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(3.8ml 0.5M HBTU中2.1毫摩尔氨基酸，10％DIE A；即5倍过量的氨基酸)。第二个Fmoc去除步骤之后，应用标准氨基酸偶联方法偶联Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(7.6ml 0.5M HBTU中4.2毫摩尔氨基酸，10％DIEA；即相对自由胺来说5倍过量的氨基酸)。最后将Fmoc去保护步骤之后，在DMF中将5倍过量的(相对自由胺来说)S-乙酰基巯基醋酸五氟苯基酯(SAMA-oPfp)偶联30分钟。通过用纯TFA批量洗涤两次一分钟去除C-末端赖氨酰残基侧链的Boc保护基，接着通过用10％DIEA的DMF溶液洗涤而将树脂中和。2毫摩尔Boc-氨基氧基乙酸和2毫摩尔N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于3毫升DMF。加入2毫摩尔DIC(二异丙基碳化二亚胺)之后，将酸活化30-60分钟。将该溶液加给中和的树脂并且偶联1小时。最后，用20％哌啶的DMF溶液处理30分钟去除S-连接的乙酰基。根据标准Boc-化学方法在作为自由醛清除剂存在的半胱氨酸的存在下用HF/对-甲酚将模板去保护并且同时从树脂载体上裂解下来(Schnlzer，M.，IntJ Pept Protein Res.(1992)40180-93)。将50％B[即含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液]中回收的聚酰胺(没有醛)冷冻并且冻干。对于纯化，将模板粗产物溶解于2ml的50％B，并且加入100ml 100％A[即0.1％TFA水溶液]来稀释样品(避免加入盐酸胍或乙酸盐，因为要保证加入醛)。将模板加载到在T＝40℃的3％B中平衡过的C4制备反相HPLC柱子上。无梯度洗脱盐，并且线性梯度纯化期望的模板GRFNP17。通过ES-MS鉴定含有期望的产物的级分，合并并且冻干。
B.支化的水溶性聚合物GRNP29的合成通过纯化的含有硫醇的模板GRFNP17和线性聚合物GRFNP31，Br-乙酰基-(EDA-Succ)12羧酸酯的产生硫醚的连接作用，合成GRFNP29，分子量是15kDa的支化的(EDA-Succ)12聚合物，其中GRFNP31在产生羧基的Sasrin树脂上，根据标准方法(Rose，K.等，美国专利顺序号No.09/379,297；Rose，等，J Am Chem Soc.(1999)1217034)合成。
1.3倍摩尔过量(相对于全部硫醇)的纯化的GRFNP31，Br-乙酰化的(EDA-Succ)12，和纯化的包含硫醇的模板GRFNP17一同溶解于0.1M Tris-HCl/6M盐酸胍，pH8.7中，浓度大约10mM。溶解之后，用0.1M Tris-HCI，pH8.7缓冲液将上述溶液稀释三倍(v/v)。室温下将连接混合物搅拌并且通过反相HPLC和ES/MS监测反应。根据需要为基础加入另外的GRFNP31反应物，直到期望的反应产物是主要产物。对于后处理，加入3倍(v/v，相对于连接混合物)的0.1M乙酸盐/6M盐酸胍，pH 4，将该溶液加载给制备C4反向HPLC柱子，并且线性梯度纯化。利用ES-MS鉴定含有纯GRFNP29构建体的级分，合并并且冻干。
C.GRFN1776和GRFN1711与GRFNP29的肟化作用根据实施例2所述制备片段SEP-14，和片段SEP-11。片段SEP-14和GRFNP29以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中。将溶液冻干。干燥的粉末加载到制备反相HPLC柱子(1英寸直径)上。通过制备梯度C4反向HPLC从未修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP14+GP29的级分并且合并。
片段SEP-11和GRFNP29以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中。将溶液冷冻并且冻干。干燥的粉末溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且加载到制备GPC(凝胶渗透色谱)柱子(1英寸直径)上。通过无梯度(isocratic)洗脱，从未修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟化产物SEP11+GP29的级分并且合并。
D.合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B50的合成从四个多肽片段在溶液中合成SEP-1-B50(SEQ ID NO2)片段SEP-11+GP29(GRFN1711+GRFNP29，相应于SEQ ID NO2的残基1-32)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过指定KOX的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(Lev-AoA)肟键与GRFNP29偶联)片段SEP-12(GRFN1712，相应于SEQ ID NO2的残基33-88)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中Cys33被Acm保护)片段SEP-13(GRFN1713，相应于SEQ ID NO2的残基89-116)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中Cys89被Acm保护)片段SEP114+GP29(GRFN1776+GRFNP29，相应于SEQ IDNO2的残基117-166)
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中Lys126在ε-氨基处修饰有乙酰丙酸肟连接基团，其通过指定KOX的乙酰丙酸-氨基氧基乙酰基(LeV-AoA)肟键与GRFNP29偶联，并且其中C-末端半胱氨酸带有吡啶甲基(pico)保护基)按实施例1和2所述进行另外的肽的合成、连接反应、羧甲基化作用、保护基去除反应、折叠和纯化，所不同的是，纯化在Resource Q柱上进行，得到全长的折叠的SEP-1-B50(SEQ ID NO2)。折叠蛋白质产物SEP-1-B50的分析C4反相HPLC色谱和ES-MS谱和CD谱证实折叠蛋白质的存在。
实施例5合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-3-L42的合成合成第五个合成的红细胞生成刺激蛋白(称为SEP-3-L42)。全长SEP-3蛋白质的氨基酸序列是APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECITVPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAISPPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO3)用马来酰亚胺-官能化的(EDA-Succ)18(GRFNP32)聚合物单元(通过米歇尔加成反应)修饰位置24，38，83，和126处的半胱氨酸残基，生成SEP-3-L42。图22给出了SEP-3-L42的结构。
图21说明下面描述的SEP-3-L42的化学合成的图示说明。简要地说，图21A和21B说明四个SEP-3-L42肽片段SEP-31通过SEP-34的天然化学连接，在相应于人EPO中所有四个天然糖基化位点的连接位点产生半胱氨酸。特别地，图21B说明带有所有被保护的形成二硫化物的半胱氨酸的全长多肽，使得四个带电荷的线性水溶性聚合物(指定为GRFN32-马来酰亚胺(GP32-马来酰亚胺))在半胱氨酸连接位点通过米歇尔加成反应进行定点连接。图21B还说明形成二硫化物的半胱氨酸的最后去保护步骤，和全长的聚合物修饰的产物的产生。
详细地说，在溶液中从四个多肽片段合成SEP-3片段SEP-31(GRFN 1747，相应于SEQ ID NO3的残基1-37)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-硫酯(其中Cys7，Cys29，和Cys33被Acm保护)片段SEP-32(GRFN1774，相应于SEQ ID NO3的残基38-82)CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LA-硫酯(其中Cys38是被Acm基团保护的侧链)片段SEP-33(GRFN 1749，相应于SEQ ID NO3的残基83-125)CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSTTLLR ALGAQKEAISPPDAA-硫酯(其中Cys83是被Acm基团保护的侧链)片段SEP-34(GRFN1750，相应于SEQ ID NO3的残基126-166)CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Cys161被Pbo[即，4-(CH3S(O)-)苄基-]保护)肽合成。应用实施例1描述的确立的侧链保护策略，其中如上文对具体的肽所提到的在保护基团策略上有所变化，通过对于Boc化学SPPS的原位中和方法，在产生硫酯的树脂上合成肽SEP-31和SEP-32和SEP-33。类似地在-OCH2-Pam-树脂上合成片段SEP-34。按实施例所述将肽去保护并且同时从树脂载体上裂解下来。通过制备RP-HPLC纯化上述得到的肽。利用ES-MS鉴定含有纯肽的级分，合并并且冻干，用于下面的连接作用。
步骤1连接#1片段SEP-34和片段SEP-33溶解于TFE，浓度是15mM。加入含有6M盐酸胍和1％苯硫酚的饱和的磷酸缓冲液(pH 7.5)，得到肽片段澄清溶液。连接之后，将连接混合物(定义为1体积)加给2体积的溶液{2ml TFE，6ml 6M盐酸胍，含有25％β-巯基乙醇的100mM磷酸盐}，并且温育20分钟。用15mg/ml TCEP的冰醋酸溶液将该溶液酸化，并且加载到制备C4反相HPLC柱子上并且用线性梯度纯化肽。通过ES-MS鉴定含有期望的连接产物SEP-3Acm+SEP-33+SEP-34的级分，并且合并这些级分。
步骤2Acm-去除#1对于Acm去除，用HPLC级水将含有SEP-3Acm+SEP-33+SEP-34合并级分的乙腈水溶液稀释一倍，并且加入固体脲使最终浓度是2摩尔浓度。加入三倍摩尔过量的(相对总的预期的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备C4反相HPLC柱子，并且步骤梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望产物SEP-33+SEP-34的级分并且冻干过夜。
步骤3连接#2将等量的SEP-33+SEP-34和SEP-32一同溶解于纯TFE三氟乙醇中，浓度是15mM。加入含有6M盐酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，得到肽片段的澄清溶液。进行一天连接作用之后，将连接混合物(定义为1体积)加给2体积的10ml TFE，10mlβ-巯基乙醇，10ml哌啶和20ml 6M盐酸胍，pH4的溶液中，并且温育20分钟，去除所有残留的保护基团。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述溶液酸化，加载给制备C4反相HPLC柱子，并且用线性梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的连接产物SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34的级分并且冻干过夜。
步骤4Acm-去除对于Acm去除，用HPLC级水将含有SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34的合并级分的乙腈水溶液稀释一倍，并且加入固体脲使最终浓度是2摩尔浓度。加入三倍摩尔过量的(相对总的预期的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/mlHg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到C4半制备反相HPLC柱子，并且逐步梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望连接产物SEP-32+SEP-33+SEP-34的级分，并且冻干过夜。
步骤5连接#3将等量的SEP-32+SEP-33+SEP-34和SEP-31一同溶解于纯TFE中，浓度是15mM。加入含有6M胍盐和1％苯硫酚的250mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，得到肽片段的澄清溶液。进行一天连接作用之后，将连接混合物(定义为1体积)加给2体积的10ml TFE，10ml β-巯基乙醇，10ml哌啶和20ml 6M胍盐，pH4的溶液中，并且温育20分钟，去除所有残留的保护基团。用20％乙酸水溶液中的15mg/ml TCEP的溶液将上述溶液酸化，加载给制备C4反相HPLC柱子，并且用线性梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望连接产物SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34的级分，并且冻干过夜。
步骤6聚合物GRFNP32的连接。根据生成马来酰亚胺-官能化(EDA-Succ)18聚合物[即马来酰亚胺-(EDA-Succ)18]的厂商说明，通过用BMPS(3-马来酰亚氨基丙酸NHS酯，Pierce，USA)将GRFNP32官能化，制备称之为GRFNP32-马来酰亚胺的马来酰亚胺-官能化线性(EDA-Succ)18聚合物。SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34溶解于最少量必需的TFE中。三倍过量的GRFNP32-马来酰亚胺溶解于6M盐酸胍，100mM磷酸盐，pH 7.5，并且加给TFE溶液。米歇尔加成反应之后进行分析反相HPLC。反应完全之后，将溶液加载给制备C4反相HPLC柱子并且用线性梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的聚合物修饰的产物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+pPEG[即带有与Cys24，Cys38，Cys83和Cys126的侧链硫醇连接的GRFNP32的四个拷贝的连接的全长166残基多肽链，因此也称作SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32]的级分，并且冻干过夜。
步骤7Pbo去除对于Pbo还原，SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32的冻干的粉末溶解于含有5％乙烷二硫醇的纯TFA中。然后通过加入10％硫代苯甲醚和15％溴代三甲基硅烷将Pbo基团裂解30分钟。在旋转蒸发器上将溶液干燥，并且溶解于含有0.1％TFA的乙腈水溶液中。将得到的溶液加载到半制备反相HPLC柱子上，并且用逐步梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的Cys161-去保护产物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo的级分并且冻干过夜。
步骤8Acm去除对于从Cys7，Cys29，和Cys33的侧链最终去除Acm，用HPLC级水将含有SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo的合并级分的乙腈水溶液稀释一倍，并且加入固体脲使最终浓度是2摩尔浓度。加入三倍摩尔过量的(相对总的预期的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备C4反相HPLC柱子，并且逐步梯度纯化。通过ES-MS鉴定含有期望的连接的聚合物修饰的产物SEP-3(1-166)的级分，并且冻干过夜。
步骤9折叠将全长连接的聚合物修饰的肽SEP-3(1-166)溶解于含有6M盐酸胍和20％TFE和10倍摩尔过量(相对于SEP-3中Cys残基)的半胱氨酸的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)。室温下该溶液用含有3M盐酸胍的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)的溶液透析过夜。然后4℃下该溶液用含有1M盐酸胍的200mM Tris缓冲液(pH 8.7)的溶液透析4小时，并且最后4℃下用10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)透析4小时，得到最终折叠的产物。通过电子喷射ES-MS和CD光谱法证实折叠。
步骤10纯化在centricon浓缩器小瓶中将折叠的多肽浓缩5倍，并且加载给用10mM磷酸盐，pH 7.0平衡过的Resource S阳离子交换柱。用10分钟内以线性盐梯度将折叠的蛋白质洗脱到达到500mM NaCl。通过SDS-PAGE鉴定含有期望的折叠产物SEP-3-L42的级分，并且在-80℃下冷冻并贮存。
实施例6合成的红细胞生成刺激蛋白的生物活性测定使用商业重组红细胞生成素作为对照标准，在因子依赖性细胞系增殖测试中，使用UT/7和32D 103197细胞系，测定折叠的合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-0，SEP-1-L26，SEP-1-L30，SEP-1-B50，和SEP-3-L42的生物活性。UT-7是人megakaryoblastic白血病细胞系，其生长和存活绝对依赖于白细胞介素-3，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或红细胞生成素(EPO)之一(Miura Y，等，Acta Haematol(1998)99180-184)；Komatsu N，等，Cancer Res.(1991)51341-8)。32D 103197是鼠红细胞生成素细胞系(Metcalf，D.Int J Cell Cloning(1992)10116-25)。
在Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基(IMDM)，10％FBS(胎牛血清)，谷氨酰胺和Penstrep中制备SEP构建体原种溶液，并且向多孔平板加入这些原种溶液的系列2x稀释液，向其中加入5000个细胞/50微升浓度的人UT/7EPO细胞。平板在5％CO2存在下在37℃下温育，每天检测生长。四天之后，加入20微升2.5mg/ml MTT(甲基噻唑四唑鎓)的PBS(磷酸缓冲盐水)溶液，并且将平板温育4小时。加入150微升IPA，并且在562nm处读取每一个孔的吸光度。测定SEP化合物的ED50(达到最大作用的50％的有效剂量)值，并且与CHO(中国仓鼠卵巢)-细胞产生的rhEPO(重组人红细胞生成素)的值相比较。这些实验结果证明所有的合成的红细胞生成刺激蛋白表现出生物活性。表VI给出SEP-0，SEP-1-L26，SEP-1-L30，和SEP-1-B50的ED50结果。
表VI

表VII和图28针对SEP-0，SEP1-L26，SEP-1-L30，SEP-1-B50，SEP-3-L42，和SEP-1-B51(下面实施例7描述的SEP-1-B51化合物的合成)给出了当只使用通过聚合物修饰的SEP-1-L30的吸光度计算蛋白质浓度的消光系数标准化肽含量时从这些实验得到的另外的结果。总之，这些体外测定证明不同的聚合物结构和连接位点对体外生物活性的不同效果，其中这些化合物当针对(1)人EPO受体活性被测试时具有下面相对级别的效力(从最有效至最小效力)SEP-1-L26≈SEP-1-L30＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51＞SEP-3-L42＞SEP-0；和针对(2)小鼠EPO受体活性(从最有效至最小效力)SEP-1-L26＞SEP-1-L30＞SEP-0＞SEP-3-L42＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51。
表VII

表VII和图28中的结果还证明与非聚合物修饰的构建体SEP-0相比聚合物修饰的SEP构建体受体偏爱的显著差异。特别地，SEP-1-L26修饰有在相应于人EPO糖基化位点位置24(在此位点连接有带负电荷的侧基的5.5kDa线性聚合物)和位置126(在此位点连接有带中性电荷的侧基的1.8kDa线性聚合物)连接的不同的线性聚合物；该构建体具有相似的抗人和小鼠受体的活性。SEP-1-L30修饰有在相应的人EPO糖基化位点位置24和126带有负电荷侧基的5.5kDa线性聚合物；与小鼠受体相比，该构建体抗人受体的活性高大约5倍。SEP-3-L42，其修饰有在相应的人EPO糖基化位点位置24，38，83和126带有负电荷侧基的5.5kDa线性聚合物，与小鼠受体相比，该构建体抗人受体的活性高大约10倍。SEP-1-B50和SEP-1-B51观察到的最大差异，修饰有在相应的人EPO糖基化位点位置24和126连接的支化的带有负电荷的15kDa的聚合物，并且具有大约5的pI(接近于人EPO)；与小鼠受体相比，这两个构建体抗人受体的活性高大约60倍。
因为小鼠EPO在相应于人EPO位置126的位置少了一个糖基化位点(小鼠EPO具有非糖基化脯氨酸，而不是人EPO中发现的O-糖基化丝氨酸)，不同的受体活性可能部分是由于该差异，因此也是由于小鼠受体对EPO的偏好，其缺少相应的位置126的O-连接的糖基化作用。这符合SEP-1-L26和SEP-1-L30与SEP-1-B50和SEP-1-B52的比较。例如，SEP-1-L26在位置126具有1.8kDa不带电荷的聚合物，而SEP-1-L30在位置126有5.5kDa带负电荷聚合物。虽然对于抗人EPO受体观察到相等的活性，但是抗小鼠EPO受体发现有4倍的差异。观察SEP-1-B50和SEP-1-B51构建体观察到的最大差异是，在相应的人EPO糖基化位点位置126连接有带负电荷的15kDa聚合物。在相应于人EPO中所有四个天然糖基化位置，即24，38，83和126，的位点加上5.5kDa带负电荷的聚合物，SEP-3-L42构建体减小了对小鼠的偏好，但是小于SEP-1-B50和SEP-1-B51构建体。这些结果证明，通过相应于生物学制备的糖基化的蛋白质的糖基化位点的位点的精确修饰，和通过调节聚合物的大小，支化性质和电荷，可以调节受体特异性。
实施例7合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B51的合成A.SEP-1-B51的组成。合成第六种合成的红细胞生成刺激蛋白(指定为SEP-1-B51)。全长SEP-1-B51的氨基酸序列和SEP-1-B50的相同APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ代表由在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基，并且其中KOX代表在ε-氨基处化学修饰有通过肟键与指定的水溶性聚合物偶联的肟连接基团的非天然赖氨酸。
但是与SEP-1-B50相反，蛋白质衍生有带有四个通过酰胺键与赖氨酸支化核心偶联的线性(Succ-TTD)12-Succ-丙氨酸-OH[即，(Succ-TTD)12-Succ-Ala-OH，或(Succ-TTD)12Succ-Ala]聚合物的支化聚合物构建体。设计线性聚合物通过酰胺键与支化核心偶联以提高稳定性。也设计四个线性聚合物使带有丙氨酸部分和负电荷侧基，负电荷模拟唾液酸，并且丙氨酸疏水性特征类似于碳水化合物链的侧链糖部分。也设计支化的聚合物，使在支化点和蛋白质主链连接位点之间有水溶性间隔基团，以改善支化点模板的合成和加工性能，和模拟天然碳水化合物链中发现的在与蛋白质主链连接的糖的位点与碳水化合物第一个支化点之间的间距。
图23图示说明下面描述的通过形成肟的连接作用与SEP-1-B51连接的支化的水溶性聚合物GRFNP41(GP41)的化学合成。实施例2描述了全长产物的组装。图24给出了SEP-1-B51的结构。
B.用于偶联到支化模板(GRFNP40)的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5毫摩尔规模，在生成羧酸的Sasrin酸不稳定树脂上合成线性聚合物(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。0.5毫摩尔(大约0.5克)生成羧酸的Sasrin酸不稳定聚苯乙烯树脂(羟基取代作用是1.02毫摩尔/克)在DMF中溶胀15分钟，然后排除溶剂。向该羟基官能化的树脂加入溶解于含有500微升(3.9毫摩尔)DIEA(二异丙基乙胺)的8毫升DMF中的450mg(4.5毫摩尔)琥珀酸酐和488mg(4毫摩尔)4-(二甲基氨基)吡啶，并且涡流搅拌下反应30分钟，排干。重复偶联，并且通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。通过加入8毫升新鲜1.0M(8毫摩尔)CDI(羰基二咪唑)的DMF溶液并且使反应40分钟后排干来活化HOOC-CH2CH2CO-O-树脂(0.5毫摩尔)。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。加入溶解于4ml 0.5M(2毫摩尔)HOBT溶液的4毫升(4克，18.2毫摩尔)(4，7，10)-三氧杂十三烷-1，13-二胺(TTD)的DMF溶液，并且在涡流搅拌下反应30分钟然后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。向树脂加入溶解于含有500微升(3.9毫摩尔)DIEA的8ml的0.5M(4毫摩尔)HOBT(N-羟基苯并三唑)溶液的琥珀酸酐(450mg，4.5毫摩尔)，使涡流搅拌下反应15分钟后排干。重复三步反应(CDI活化；TTD偶联；琥珀酸酐反应)11次[即总共12次]。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。用8ml新鲜的1.0M(8毫摩尔)CDI的DMF溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂(0.5毫摩尔)，并且使反应40分钟后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。2.5毫摩尔H-AlaOtBu.HCl溶解于含有150微升(111mg，0.825毫摩尔)DIEA的DMF中4.75ml 0.5M(2.375毫摩尔)HOBT，并且涡流搅拌下使与CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂(0.5毫摩尔)反应1小时，然后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。用DCM(二氯甲烷)充分洗涤产物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂，排干后在真空下干燥树脂至恒重。一般情况下产物-树脂的重量是2克左右。
根据标准Fmoc-化学方法使用4％TFA的DCM溶液从树脂载体上裂解线性(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu聚合物。将沉淀出的粗产物溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且冻干。冻干的聚合物溶解于少量含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且稀释以将有机物的浓度降低至低于1％。将粗产物加载到在T＝40℃用3％B平衡过的C4制备反相柱子上。无梯度洗脱盐，并且用20-35％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)对0.1％TFA水溶液的线性梯度经60分钟纯化期望的模板。通过ES-MS鉴定含有期望的(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu材料(GRFNP39)的级分，冷冻并且冻干。
C.带有多个用于支化的胺基和用于(后面)与蛋白质(GRFNP40)连接的保护的氨基氧基的模板的合成以0.4毫摩尔规模在产生酰胺的Sieber树脂上人工合成模板GRFNP40。在每一偶联、去保护和活化步骤之间有一分钟的用DMF流动洗涤步骤。使用2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS在DCM/DMF(二甲基甲酰胺)中将NHS-酯预先活化30分钟，使2毫摩尔Nα-Fmoc-Nβ(Boc-氨基氧基乙酰基)-L-二氨基丙酸与树脂偶联1小时。去除Fmoc保护基团(2×3分钟，20％v/v哌啶的DMF溶液)并且洗涤，溶解于含有2.2毫摩尔DlEA的8ml的0.5M HOBT(N-羟基苯并三唑)溶液的4毫摩尔琥珀酸酐与树脂偶联10分钟。该步骤之后，用DMF中的8ml新鲜0.5M(4毫摩尔)CDI溶液活化羧基。在DMF中4ml 0.5M HOBT溶液中加入4ml(18.2毫摩尔)TTD并且偶联30分钟。
使用2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS在DMF中预先活化30分钟，使Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2毫摩尔)与得到的氨基-TTD-Succ-Dpr(BocAoA)-树脂(其中Dpr＝二氨基丙酸)偶联1小时。将该偶联重复一次。Fmoc去除步骤之后(2×3分钟，20％v/v哌啶的DMF溶液)，4毫摩尔Fmoc-Lys(Fmoc)-OH如上所述偶联，包括再次偶联。最后Fmoc保护步骤之后(2×3分钟，20％v/v哌啶的DMF溶液)，根据标准Fmoc-化学方法使用4％TFA的DCM溶液从树脂载体裂解该模板。将沉淀的产物溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且冻干。将冻干的粗产物溶解于少量含0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并稀释将有机物浓度减小至低于1％。将该模板加载到在T＝40℃的3％缓冲液B(0.1％TFA乙腈溶液)平衡过的C4制备反相HPLC柱子上。无梯度洗脱盐和其他非酰胺材料，并且用5-12％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)对0.1％TFA水溶液的线性梯度经60分钟纯化期望的模板。通过ES-MS鉴定含有期望的Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ-Dpr(BocAOA).酰胺材料(GRFNP40)的级分，冷冻并且冻干。
D.酰胺偶联的支化聚合物(GRFNP41)的组装和去保护通过偶联GRFNP39[(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu]和纯化的模板GRFNP40，来合成分子量是16kDa的支化的(TTD-Succ)49-聚合物GRFNP41。在20倍(摩尔)过量的DIEA存在下，用10mg/ml浓度的0.95摩尔的HATU{O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓(uronium)六氟磷酸盐}的DMSO溶液活化60℃下溶解于DMSO(二甲亚砜)至浓度是20mg/ml的纯化的(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0毫摩尔)。立即加入溶解于DMSO浓度是3.9mg/ml的纯化模板GRFNP40(0.24mole)。通过C4分析反相HPLC和ES-MS监测反应进程。典型地，偶联在几分钟之内完成。对于后处理，加入4体积(相对于连接混合物)的0.1M乙酸钠/6M盐酸胍，pH4，将该溶液加载给制备C4反相HPLC柱子。无梯度洗脱含有盐和其它非酰胺的物质，并且用线性梯度20-35％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)对0.1％TFA水溶液在80分钟之内纯化期望的支化聚合物产物。通过ES-MS鉴定含有期望的材料的级分，冷冻并且冻干。
将得到的纯化的聚合物以1mg/ml的浓度溶解于纯TFA中1小时，从氨基氧基乙酰基部分去除Boc基团，并且从-Ala-OtBu部分去除叔丁基酯。在旋转蒸发器中将溶液旋转蒸发至干，并且将干燥的聚合物溶解于50％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)。加入氨基氧基乙酸(a.k.a.′羧基甲氧基胺′)至最终浓度0.5M，清除形成加成物的杂质。20分钟之后，用3.3体积的缓冲液A(0.1％TFA水溶液)稀释上述溶液，并且加载给制备C4反相HPLC柱子，并且泵压加10％缓冲液B，直到所有的氨基氧基乙酸被去除，然后用15％至45％缓冲液B对0.1％TFA水溶液经80分钟逐步梯度纯化聚合物。将合并的含有期望的支化聚合物材料(GRFNP41)的级分冷冻并且冻干。
E.肽片段GRFN1776和GRFN1711与支化的聚合物GRFNP41形成肟的连接(肟化作用)根据上文实施例1所述，利用标准原位中和作用Boc化学SPPS合成片段SEP-14(GRFN1776，由SEQ ID NO2的残基117-166组成)和片段SEP-11(GRFN1711，由SEQ ID NO2的残基1-32组成)。也如上所述，根据标准方法在-OCH2-Pam-树脂上合成肽GRFN1776。如上所述，根据标准方法在产生硫酯的树脂上合成肽GRFN1771。包含Lys126上乙酰丙酸酰基部分的片段GRFN1776和包含AoA的GRFNP41以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中。将该溶液冻干。干燥的粉末粗产物再次溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且加载给制备反相(C4)HPLC柱子。通过制备梯度反相HPLC从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟连接的(肟化)产物SEP-14+GP41的级分，合并并且冻干。
包含Lys24上乙酰丙酸酰基部分的片段GRFN1711和包含AoA的GRFNP41以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中。将该溶液冷冻并冻干。干燥的粉末溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且加载给C4制备反相HPLC柱子。通过制备梯度洗脱C4反相HPLC从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟连接的(肟化)产物SEP-11+GP41的级分，合并并且冻干。
F.合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B51的合成在溶液中从四个多肽片段合成SEP-1-B51，具有(SEQ ID NO2)片段SEP-11+GP41(GRFN1711+GRFNP41；相应于SEQ IDNO2的残基1-32)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24具有与支化聚合物GRFNP41肟-连接的乙酰丙酸酰基侧链部分，以KOX表示；并且其中His32被Dnp保护)片段SEP-12(GRFN 1712；相应于SEQ ID NO2的残基33-88)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中Cys33被Acm保护；并且其中三个Trp残基被甲酰基保护)片段SEP-13(GRFN1713，相应于SEQ ID NO2的残基89-116)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中Cys89被Acm保护；并且其中His94被Dnp保护)片段SEP-14+GP41(GRFN1776+GRFNP41，相应于SEQ IDNO2的残基117-166)。
CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中C-末端半胱氨酸(即Cys161)带有吡啶甲基(pico)保护基团，并且其中Lys126具有与支化聚合物GRFNP41肟-连接的乙酰丙酸酰基侧链部分，以KOX表示)和实施例1-4所述一样进行另外的肽的合成、连接反应、羧甲基化作用、保护基去除反应、折叠和纯化，得到全长的折叠的SEP-1-B51(SEQ ID NO2)，有下面的修饰步骤1连接#1 片段SEP-14+PG41溶解于TFE(1体积)，浓度是3mM。片段SEP-13溶解于2体积的含有6M盐酸胍的300mM磷酸钠缓冲液(pH 7.9)中，浓度是2.25mM。将这两种溶液混合，得到1mM SEP-14+PG41和1.5mM SEP-13的最终片段浓度，并且加入1％苯硫酚，得到pH6.8-7.2的肽片段的溶液(“3体积”)。反应在室温下进行过夜。连接之后，向连接混合物加入β-巯基乙醇(“3体积”)，接着加入3体积的6M盐酸胍，300mM磷酸钠缓冲液(pH 7.9)，并且加入TCEP(占肽片段总重量的0.25(重量))，将该溶液搅拌20分钟。用0.6体积的冰醋酸将该溶液酸化至pH4.0+/-0.1，得到澄清溶液，向其中加入30体积的pH4.0，100mM乙酸钠稀释缓冲液，6M盐酸胍。将得到的溶液泵压加到制备反相(C4)HPLC柱子上。泵压加5％B[因此其余的是95％缓冲液A(0.1％TFA水溶液)]，直到从柱子中洗脱出全部的非肽物质。然后通过25-45％缓冲液B的梯度经80分钟纯化连接产物。通过电子喷射质谱鉴定含有期望的连接产物(Cys89(Acm)){SEP-13+SEP-14+GP41}的级分，并且合并这些级分。
步骤2Acm-去除#1 对于Acm去除，用HPLC级水将含有(Cys89(Acm)){SEP-13+SEP-14+GP41}合并级分的乙腈水溶液稀释一倍，并且加入固体脲使最终浓度是2M。加入三倍摩尔过量的(相对总的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备反相HPLC柱子，泵压加25％缓冲液B直到从柱子中洗脱出全部的非肽物质。然后用逐步梯度至50％缓冲液B纯化产物。通过电子喷射质谱鉴定含有期望的连接产物的{SEP-13+SEP-14+GP41}的级分，并且合并这些级分并且冻干。
步骤3连接#2 将步骤2得到的{SEP-13+SEP-14+GP41}产物[即1713-1776-GP41]溶解于TFE(1体积)，浓度是3mM。片段SEP-12(片段GRFN1712)溶解于2体积的含有6M盐酸胍的300mM磷酸钠缓冲液(pH 7.9)中，浓度是2.25mM。将这两种溶液混合，得到1mM{SEP-13+SEP-14+GP41}和1.5mM SEP-12的最终片段浓度，并且加入1％苯硫酚，得到pH6.8-7.2的肽片段的溶液(“3体积”)。反应在室温下进行过夜。然后用3体积(即相对于上述使用的TFE的体积)的稀释缓冲液将连接混合物稀释含有6M盐酸胍的100mM乙酸钠pH 4.0，然后加到溶液中，冷却至4℃，由3体积TFE，3体积β-巯基乙醇，3体积哌啶和6体积的6M盐酸胍，100mM乙酸钠pH4.0组成，并且室温下将该溶液搅拌20分钟，去除所有的残留的保护基。用1.8体积的冷冻的冰醋酸将该溶液酸化，得到澄清溶液，向其中加入TCEP(占肽片段的总重量的0.25(重量))，将该溶液温育20分钟。然后加入30体积的pH 4.0，100mM乙酸钠稀释缓冲液，6M盐酸胍，并且混合该溶液。将得到的溶液泵压加到制备反相(C4)HPLC柱子上。泵压加30％C[缓冲液C60％异丙醇/30％乙腈/10％水中的0.1％TFA]，直到从柱子中洗脱出全部的非肽物质。然后通过37-57％缓冲液C经80分钟纯化连接产物。通过ES-MS鉴定含有期望的连接产物(Cys33(Acm)){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的级分，并且合并这些级分，冻干。
步骤4残基Cys89和Cys117的羧甲基化作用(Cys33(Acm)){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}[即(Cys33(Acm))-1712-1713-1776-GP41]溶解于TFE，浓度是1mM。加入10体积的含有6M盐酸胍的300mM磷酸钠缓冲液(pH 7.9)。加入25倍过量(与硫氢基相比)的溶解于甲醇的溴乙酸(75mg/ml)，使该溶液在室温下搅拌下反应2小时。用11体积的100mM乙酸钠pH 4.0，6M盐酸胍稀释反应混合物，加载给制备反相(C4)HPLC柱子，泵压加20％缓冲液C，直到洗脱出全部的非肽成分。然后用最大55％缓冲液C逐步梯度纯化连接产物。通过ES-MS鉴定含有期望的修饰产物的(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的级分，并且合并这些级分，冻干。
步骤5吡啶甲基去除锌屑(对于每毫克肽用71毫克)在2MHCl中活化5分钟，重复活化一次，然后用6M盐酸胍，含有(新加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷酰基肌氨酸钠和10％v/vTFE的50mM甘氨酸pH2.2洗涤锌10分钟，去除过量的酸。再次洗涤。将包含Cys161(Pico)的肽(Cys33(Aem)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}溶解于纯TFE中，浓度大约30mg/ml。用4体积的(相对于TFE)含有(新加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷酰基肌氨酸钠和10％v/vTFE的6M盐酸胍，50mM甘氨酸pH2.2将上述溶液稀释。将该溶液加到活化的锌粉中，并且在室温下搅拌50分钟。以1小时时间间隔通过等分试样(用等体积的β-巯基乙醇和几粒TCEP处理，然后用2体积的6M盐酸胍，100mM乙酸钠，pH4.0稀释用于分析)的分析C4反相HPLC监测反应，2-5小时之后反应完全。完全去除吡啶甲基之后，根据分析HPLC峰的ES-MS分析显示(即质量减少91Da)，过滤去除上清液，并且用含有20％TFE的含有35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸的6M盐酸胍，pH 4，100mM乙酸盐将残留的锌粉洗涤三次，并且向合并的上清液加入BioRad SM-2小球(大约是溶液体积的三分之一)，洗涤并且室温下搅拌30分钟后过滤。加入β-巯基乙醇至10％v/v，然后加入0.25×(肽的合并重量)的TCEP，并且室温下将该溶液搅拌5分钟。用等体积的100mM乙酸钠，pH 4.0，6M盐酸胍将该溶液1∶1稀释，并且加载给制备(C4)反相HPLC柱子，泵压加35％缓冲液C，直到洗脱出全部的非肽物质。然后用最大55％缓冲液C逐步梯度纯化期望的产物。通过电子喷射质谱鉴定含有期望的Cys161-去保护产物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}级分，并且合并这些级分。
步骤6Acm-去除#2用HPLC级水将(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}(即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41)合并溶液稀释三倍，并且加入固体脲使最终浓度是2M。加入三倍摩尔比例的(相对总的半胱氨酸浓度)3％乙酸水溶液中的30mg/ml Hg(乙酸)2溶液，并且将该溶液在室温下搅拌1小时。然后在β-巯基乙醇中将该溶液制备成20％，并且加载到半制备(C4)反相HPLC柱子，泵压加20％缓冲液C，直到洗脱出全部的非肽物质。然后用最大55％缓冲液C逐步梯度纯化期望的产物。通过ES-MS鉴定含有期望的产物(Cys33；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}的级分，用含有2倍(w/w相对于肽质量)DPC(十二烷基胆碱磷酸)的水稀释2倍(v/v)，并且冻干过夜。
步骤7连接#3将(Cys33；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}(即(Cys33；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41)溶解于纯TFE(1体积)中，浓度是3mM。SEP-11(即1711-GP41)溶解于2体积的含有6M盐酸胍的300mM磷酸钠缓冲液(pH7.9)中。将这两种溶液混合，并且加入1％v/v苯硫酚。将连接混合物在室温下搅拌过夜。然后向溶液中加入3体积(即相对于上述TFE的体积)的β-巯基乙醇，和9体积的连接缓冲液(含有6M盐酸胍的300mM磷酸钠缓冲液pH 7.9)。向该溶液中加入0.25×(占肽片段的合并重量)的TCEP，将该溶液在室温下搅拌20分钟。加入冰醋酸(0.6体积)将溶液酸化至pH 4.0，然后用30体积的含有6M盐酸胍的100mM乙酸钠pH 4.0稀释该溶液。将得到的溶液加载到制备(C4)反相HPLC柱子上。泵压加缓冲液C(25％)，直到从柱子中洗脱出全部的非肽物质。然后通过35-55％缓冲液C的线性梯度经80分钟纯化连接产物。通过电子喷射质谱鉴定含有期望的连接产物SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-11(+GP41)+SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}(SEQ ID NO2)的级分，并且合并这些级分。
步骤8折叠向含有全长连接肽SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-11(+GP41)+SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}[即1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41]的合并级分中加入固体盐酸胍，1M Tris缓冲液(pH8.7)和蒸馏水，使得最终浓度是0.1毫克每毫升连接肽SEP-1(1-166)，6M盐酸胍，100mM Tris，这种连接的肽(′蛋白质′)溶液加载到15ml透析盒中，并且在4℃用含有3M盐酸胍，5微摩尔半胱氨酸和2微摩尔胱氨酸(cystine)的100mM Tris缓冲液(pH 8.5)的溶液透析过夜。然后4℃下用含有1M盐酸胍的100mM Tris缓冲液(pH 8.5)透析该蛋白质溶液8小时，最后4℃下用10mM Tris缓冲液(pH 7.0)透析14小时，得到最终的折叠产物。合并来自透析盒的含有折叠蛋白质的溶液。通过ES-MS、分析RP-HPLC，和通过CD谱证实折叠。
步骤9纯化将含有折叠蛋白质的溶液加载给用10mM Tris，pH7.0平衡过的Q-Sepharaose离子交换柱。使用至125mM NaCl的线性盐梯度洗脱折叠蛋白质。通过非还原SDS-PAGE鉴定含有期望的折叠产物SEP-1-B51的级分，并合并。通过超滤浓缩合并的级分，至浓度是大约2毫克每毫升，然后将蛋白质溶液加载到2.6×100cm S-300凝胶过滤柱。用10mM Tris pH7.0、137mM氯化钠洗脱纯化的SEP-1-B51。通过非还原SDS-PAGE鉴定含有高纯度SEP-1-B51的级分，并且合并，冷冻并且在-80℃下贮存。通过分析(C4)反相HPLC，ES-MS，通过非还原SDS-PAGE，和CD谱鉴定最后的纯化的折叠蛋白质SEP-1-B51。图27说明代表性等电聚焦凝胶(IEF)和非还原SDS-PAGE凝胶，表明折叠的纯化的SEP1-B51的相对分子量。在同一凝胶上分析分子量标准用于比较。如所示的，通过非还原SDS-PAGE测定SEP1-B51的相对分子量大约是73kDa。相对pI大约是5.0。还给出了折叠的纯化的SEP-1-B51产物的代表性RP-HPLC谱。这说明本发明精确的聚合物修饰的蛋白质的纯度和相对提高的分子量。
实施例8合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B52的合成A.SEP-1-B52的组成。合成第七个合成的红细胞生成刺激蛋白(指定为SEP-1-B52)。全长SEP-1-B52的氨基酸序列与SEP-1-B51的相同APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ代表由在硫氢基处羧甲基化的半胱氨酸组成的非天然氨基酸残基，并且其中KOX代表在ε-氨基处化学修饰有通过肟键与指定的水溶性聚合物偶联的肟连接基团的非天然赖氨酸。
与SEP-1-B51类似，SEP-1-B52蛋白在残基24和126处衍生有支化的(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物构建体，但是对于该类似物，该聚合物通过丙酮酸和氨基氧基乙酸之间的肟键被连接。此外，对赖氨酸在残基24和126处的ε-氨基进行修饰，使带有氨基氧基乙酰基官能团来代替乙酰丙酸酰基部分，制备支化的(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物构建体，使带有侧链丙酮酰基部分。设计这些变化以改进合成和操作，并且进一步提高肟键的稳定性。
图25图示说明如下所述通过形成肟的连接作用而与SEP-1-B52连接的支化的水溶性聚合物GRFNP43(GP43)的化学合成。根据实施例2所述组装全长产物。SEP-1-B52的结构如图26所示。
B.用于与支化模板(GRFNP42)偶联的(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5毫摩尔规模合成(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。0.5毫摩尔(大约0.5克)生成羧酸的Sasrin酸不稳定聚苯乙烯树脂(羟基取代作用是1.02毫摩尔/克)在DMF中溶胀15分钟，然后排除溶剂。向该羟基官能化的树脂加入溶解于含有500微升(3.9毫摩尔)DIEA(二异丙基乙胺)的8毫升DMF中的450mg(4.5毫摩尔)琥珀酸酐和488mg(4毫摩尔)4-(二甲基氨基)吡啶，并且涡流搅拌下反应30分钟，排干。重复偶联，并且通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。通过加入8毫升新鲜1.0M(8毫摩尔)CDI的DMF溶液并且使反应40分钟后排干来活化HOOC-CH2CH2CO-O-树脂(0.5毫摩尔)。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。加入溶解于4ml 0.5M(2毫摩尔)HOBT溶液的4毫升(4克，18.2毫摩尔)TTD的DMF溶液，并且在涡流搅拌下反应30分钟然后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。向树脂加入溶解于含有500微升(3.9毫摩尔)DIEA的8ml的0.5M(4毫摩尔)HOBT(N-羟基苯并三唑)溶液的琥珀酸酐(450mg，4.5毫摩尔)，使涡流搅拌下反应15分钟后排干。重复三步反应(CDI活化；TTD偶联；琥珀酸酐反应)11次[即总共12次]。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。用8ml新鲜的1.0M(8毫摩尔)CDI的DMF溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂(0.5毫摩尔)，并且使反应40分钟后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。2.5毫摩尔H-AlaOtBu.HCl溶解于含有150微升(111mg，0.825毫摩尔)DIEA的DMF中的4.75ml 0.5M(2.375毫摩尔)HOBT，并且涡流搅拌下使与CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂(0.5毫摩尔)反应1小时，然后排干。通过用DMF(大约50毫升)经1分钟涡流洗涤去除过量的反应物和可溶性联产品后排干。用DCM充分洗涤产物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-丁二酰)12-O-树脂，排干后在真空下干燥树脂至恒重。一般情况下产物-树脂的重量是2克左右。
根据标准Fmoc-化学方法使用4％TFA的DCM溶液从树脂载体上裂解线性GRFNP39。将沉淀出的粗产物溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且冻干。冻干的聚合物溶解于少量含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且稀释以将有机物的浓度降低至低于1％。将粗产物加载到在T＝40℃用3％B平衡过的C4制备反相HPLC柱子上。无梯度洗脱盐，并且用线性梯度的20-35％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)对0.1％TFA水溶液经60分钟纯化期望的模板。通过ES-MS鉴定含有期望的(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu材料(GRFNP39)的级分，冷冻并且冻干。
C.带有多个用于支化的胺基和用于(后面)与蛋白质(GRFNP42)连接的侧链丙酮酸酰基部分的模板的合成以0.4毫摩尔规模在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上人工合成模板。在每一次偶联、去保护和活化步骤之间有一分钟用DMF流动洗涤步骤。通过用纯(即100％)TFA处理去除Boc基团。DMF洗涤之后，在用含有1毫升DIEA的1.8毫摩尔HBTU的3.8毫升DMF活化之后，使2毫摩尔的Fmoc-(Rink-连接基团)-OH与树脂偶联。去除Fmoc保护基团(2×3分钟，20％哌啶的DMF溶液)之后，使用DMF中的2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS进行NHS-酯活化作用，使2毫摩尔的Fmoc-Lys(MTT)-OH[MTT＝4-甲基三苯甲基]与树脂偶联。去除Fmoc保护基团(2×1分钟，0.5％DBU的DMF溶液)之后，溶于含有2.2毫摩尔DIEA的8ml的0.5M HOBT溶液中的4毫摩尔琥珀酸酐与树脂偶联10分钟。该步骤之后，用DMF中用8ml新鲜0.5MCDI溶液活化结合树脂的羧基。在4ml 0.5M HOBT溶液中加入4mlTTD并且偶联30分钟。
使用2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS在DMF中将NHS-酯活化，使2mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与树脂偶联。Fmoc去除步骤之后(2×1分钟，5％DBU的DMF溶液)，4毫摩尔Boc-Lys(Boc)-NHS在3毫升DMF中偶联。
通过用2％TFA的DCM溶液多次洗涤去除MTT保护基团。当上清液没有黄颜色时去保护完成。用10％DIEA的DMF溶液将树脂中和1分钟。使用2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS在DMF中将NHS-酯活化，使2毫摩尔丙酮酸与树脂偶联45分钟。使用含有5％水的纯TFA从树脂载体上将模板去保护并且裂解。在旋转蒸发器上将裂解溶液蒸发至干。残余物溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中并且冻干。将冻干的模板溶解于少量含0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并稀释以将有机物浓度减小至低于1％。将该包含丙酮酸酯的模板加载到在T＝40℃的0％缓冲液B(即100％缓冲液A＝0.1％TFA水溶液)平衡过的C4制备柱子上。无梯度洗脱盐，并且用线性梯度的5-12％缓冲液B对0.1％TFA水溶液经60分钟纯化期望的模板。通过ESI-MS鉴定含有期望的材料(GRFNP42)的级分，冷冻并且冻干。
D.酰胺偶联的支化聚合物(GRFNP43)的组装和去保护通过偶联GRFNP39和纯化的模板GRFNP42，来合成分子量是16kDa的支化的(TTD-Succ)49-聚合物GRFNP43。在20倍(摩尔)过量的DIEA存在下，在10mg/ml的浓度用0.95摩尔的HATU的DMSO溶液活化60℃下溶解于DMSO浓度是20mg/ml的纯化的(Succ-TTD)12-Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0毫摩尔)。立即加入溶解于DMSO浓度是3.9mg/ml的纯化模板(0.24摩尔)GRFNP42。通过分析C4反相HPLC和ES-MS监测反应进程。典型地，偶联在几分钟之内完成。对于后处理，加入4体积(相对于连接混合物)的0.1M乙酸盐/6M盐酸胍，pH4，将该溶液加载给制备(C4)反相HPLC柱子。无梯度洗脱含有盐和其它非酰胺的物质，并且用线性梯度20-35％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)对0.1％TFA水溶液在80分钟之内纯化期望产物的支化聚合物。通过ES-MS鉴定含有期望材料的级分，冷冻并且冻干。
将得到的纯化的支化聚合物构建体GRFNP43以1mg/ml的浓度溶解于纯TFA中1小时，以去除Ala-OtBu叔丁基酯保护。在旋转蒸发器中将溶液蒸发至干，并且将干燥的聚合物溶解于50％缓冲液B(含有0.1％TFA的乙腈)。在制备反相HPLC上，用15％至45％缓冲液B对0.1％TFA水溶液经80分钟逐步梯度将聚合物脱盐。将含有期望物质(GRFNP43)的合并级分冷冻并且冻干，干燥粉末用于形成肟的连接步骤。
E.GRFN1776和GRFN1711与支化的聚合物GRFNP43形成肟的连接作用(肟化作用)根据上文实施例2，3，4和7所述根据标准偶联方法合成片段SEP-14和片段SEP-11，只是在各肽片段中取代乙酰丙酸而用氨基氧基乙酰基(AoA)部分连接到Lys24和Lys126上。因此，肽-树脂组装之后，从各肽-树脂去除侧链Fmoc保护基团，并且将2毫摩尔Boc-氨基氧基乙酸加给使用2毫摩尔DIC和2毫摩尔NHS在DMF中将NHS-酯活化后的树脂。将两种肽去保护，并且使用HF将其从树脂上裂解下来，并且通过C4反相HPLC纯化。适当小心以避免接触羰基化合物。片段SEP-14和GRFNP43以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA(三氟乙酸)的50％乙腈水溶液中。将该溶液冻干。干燥的粉末再次溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且加载给制备C4反相HPLC柱子。通过制备梯度反相HPLC从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟连接产物SEP-14+GP43的级分，合并级分。
片段SEP-11和GRFNP43以等摩尔比一起溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中。将该溶液冷冻并且冻干。干燥的粉末溶解于含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且加载给制备梯度C4反相HPLC柱子。通过制备反相梯度洗脱，从没有修饰的肽和未反应的聚合物分离聚合物修饰的肽。通过ES-MS鉴定含有期望的肟连接产物SEP-11+GP43的级分，并合并。
F.合成的红细胞生成刺激蛋白SEP-1-B52的合成在溶液中从四个多肽片段合成SEP-1-B52(SEQ ID NO2)片段SEP11+GP43(GRFN1711+GRFNP43；相应于SEQ IDNO2的残基1-32)APPRLICDSR VLERYL LEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24具有与支化聚合物GRFNP43肟-连接的AoA侧链部分，以KOX表示；并且其中His32被Dnp保护)片段SEP-12(GRFN1712；相应于SEQ ID NO2的残基33-88)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中Cys33被Acm保护；并且其中三个Trp残基被甲酰基保护)片段SEP-13(GRFN 1713，相应于SEQ ID NO2的残基89-116)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中Cys89被Acm保护；并且其中His94被Dnp保护)片段SEP-14+GP43(GRFN 1776+GRFNP43，相应于SEQ IDNO2的残基117-166)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中C-末端半胱氨酸(即Cys161)带有吡啶甲基(pico)保护基团，并且其中Lysq126具有与支化聚合物GRFNP43肟-连接的AoA侧链部分，以KOX表示)如上文实施例1，2，3，4，和7所述进行另外的肽的合成、连接反应、羧甲基化作用、保护基去除反应、折叠和纯化，得到全长的折叠的SEP-1-B52(SEQ ID NO2)，通过分析(C4)反相HPLC，ES-MS，和非还原SDS-PAGE对其表征。按照对于其它SEP构建体所述方法进行生物学测定。
实施例9SEP-3-L42的功效研究在加有0.25％大鼠血清白蛋白(RSA)的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中重新配制SEP-3-L42，并且以0、1、5、或10微克/千克的剂量，tiw，在第1，3，和6天对正常雄性大鼠(每组5只大鼠)静脉内给药。最后注射之后4天(第9天)收集血样并且分析血液学参数。当与对照组那些相比较时，以这些剂量最后注射SEP-3-L42之后第4天在血红细胞(RBC)，血红蛋白(HGB)，血细胞比容(HCT)，和网状细胞计数(RET)值方面没有统计学显著差异。
实施例10SEP-3-L42的药物动力学研究在加有0.25％RSA的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)pH6.9中重新配制SEP-3-L42，并且以5微克/kg剂量水平对正常雄性大鼠静脉内一次剂量给药。在给药之后0，1，2，4，6，12，24，48，72，96，120，144，168小时收集血样。用抗-EPO ELISA试剂盒(R & D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)根据生产商说明，测定血浆SEP-3-L42浓度。图29给出了结果。
如图29所示，与SEP3-L42相比，SEP-1-B50表现出稍微低的清除率。不考虑其循环半寿期，SEP3-L42在实验剂量下在促进血红细胞产生方面没有表现出统计学显著差异。相反，在相同剂量下，SEP-1-B50刺激血红细胞产生。这说明该聚合物结构可以被开发用于精细调整体内生物学性能，包括药物动力学行为和功效。
实施例11SEP-1-L30的功效研究在加有0.25％RSA的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中重新配制SEP-1-L30，并且以0，1，5，25或50微克/千克的剂量，tiw，在第1，3，和5天对正常雄性大鼠(每组5只大鼠)静脉内给药。最后注射之后4和8天(第9和13天)收集血样并且分析血液学参数。当与对照组那些相比较时，最后注射SEP-1-L30之后任何时间间隔的RBC，HGB，HCT，值没有统计学显著差异。使用25和50微克/千克最后注射处理大鼠之后4天(第9天)，网状细胞计数更高(当与对照组那些相比较时有统计学显著差异)。用SEP-1-L30处理任何动物第9天或第13天血液学参数没有发现其它差异[数据没有给出]。
实施例12SEP-1-L30的药物动力学研究在加有0.25％RSA的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)pH6.9中重新配制SEP-1-L30，并且以5或25微克/kg剂量水平对正常雄性大鼠静脉内一次剂量给药。在给药之后0，1，2，4，6，12，24，48，72，96，120，144，168小时收集血样。用ELISA试剂盒(R & D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)根据生产商说明，测定血浆SEP-1-L30浓度。在给定剂量在任何时间点没有可检测到的SEP-1-L30。
实施例13SEP-1-B50的功效研究在加有0.25％RSA的无菌PBS(磷酸缓冲盐水)中重新配制SEP-1-B50，并且以0，1，5，25或125微克/千克的剂量，tiw，在第1，3，和6天对正常雄性大鼠(每组5只大鼠)静脉内给药。最后注射之后4，9和14天(第10，15和20天)收集血样并且分析血液学参数。下面表VIII给出数据。对于接受5，25和125微克/千克SEP-1-B50的动物在最后注射之后第4天(第10天)观察到增高的RBC，HGB，HCT，和RET剂量相关响应(当与对照组那些相比较时有统计学显著差异)。在第15天，这些动物的RBC，HGB和HCT仍然比对照值高，并且对于用125微克/千克处理过的动物直至第20天(最后注射之后14天)继续显著高于对照值。在第10天，RET产生减少，对于25和125微克/千克处理的动物在第15和20天的计数显著低得多。
表VIII多次施用SEP-1-B50之后的血液学研究结果


*与对照的显著差异，p＜0.05**与对照的显著差异，p＜0.01实施例14SEP-1-B50的药物动力学研究在加有0.25％RSA的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)pH6.9中重新配制SEP-1-B50，并且以5或25微克/kg剂量水平对正常雄性大鼠静脉内一次剂量给药。在给药之后0，1，2，4，6，12，24，48，72，96，120，144，168小时收集血样。用ELISA试剂盒(R & D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)根据生产商说明，测定血浆SEP-1-B50浓度。对于5和25微克/千克剂量测得的消失半寿期分别是9.7和9.9小时。对于5和25微克/千克剂量观察到的MRT(平均滞留时间)分别是13.9和14.4小时。图29给出了SEP-1-B50代表性动力学曲线。
实施例15SEP-1-B51的功效研究在两个实验中对正常雄性大鼠静脉内施用SEP-1-B51。
实验1在加有0.25％RSA的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中重新配制SEP-1-B51，并且以0，1，5，或25微克/千克的剂量，tiw，在第1，3，和6天对雄性大鼠(每组5只大鼠)静脉内给药。最后注射之后4，9和14天(第10，15和20天)收集血样并且分析血液学参数。下面表IX给出数据。与对照组的值相比较，第三次和最后静脉内注射SEP-1-B51之后第4天(第10天)，对于接受25微克/千克SEP-1-B51的动物，观察到RBC，HGB，HCT，和绝对网状细胞计数(ART)方面的统计学显著增高。在第15天，这些动物的RBC值仍然比对照值高，并且在第20天与对照值相当。在第10天之后网状细胞产生减少，对于5和25微克/千克处理的动物在第15天显著低。
表IX多次施用SEP-1-B51之后的血液学研究结果

**与对照的显著差异，p＜0.01*与对照的显著差异，p＜0.05实验2.在加有0.25％人血清白蛋白的柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠+100mM氯化钠)中重新配制SEP-1-B51，并且以0，1，5，或25微克/千克的剂量，tiw，在第1，3，和5天对雄性大鼠(每组5只大鼠)静脉内给药。最后注射之后2，4和6天(第7，9和11天)收集血样并且分析血液学参数。另外，在剩余的研究天数中(第2，3，4，5，6，8，10，12和13)每天收集血样只用于测定血细胞比容[作为堆积的细胞体积(PCV)]。下面表X给出数据。第一次注射后的开始2天(第三天)，对于接受5和25微克/千克的动物，HCT(PCV或计算的)值显著提高并且持续至第三次并且最后注射之后的6天(第11天)。对于接受5和25微克/千克的动物，在对它们测定的那天(最后给药之后2，4和6天；第7，9和11天)RBC和HGB也显著提高。只有接受25微克/千克的组在最后给药之后2和4天(第7和9天)ART显著提高。
表X多次施用SEP-1-B51之后的血液学研究结果

*与对照的显著差异，p＜0.05**与对照的显著差异，p＜0.01注释第7天(第三次给药后2天)；第9天(第三次给药后4天)；第11天(第三次给药后6天)以25微克/千克对另外组的大鼠一次静脉内给药SEP-1-B51处理，在注射后18小时收集血样用于血液学参数分析。在注射之后8，24和72小时和第7天(第1，2，4，和8天)收集血样，只用于测定血细胞比容(作为堆积细胞体积)。在第三天(注射后两天)，用SEP-1-B51静脉内处理过的大鼠的HCT，HGB，和ART值高于对照动物的那些(统计学显著)，并且第四天这些动物的HCT也显著提高。
实施例16在红细胞增多和缺氧模型中对SEP-1-B51的功效研究在模拟高海拔室中，让10只一组的正常小鼠(赋形剂对照，4个剂量水平的CHO-细胞(″rhEPO″)中产生的重组糖基化人红细胞生成素，和4个剂量水平的SEP-1-B510.32，1，5，25微克/千克/剂量，记为100mU/ng)每天暴露给保持在506.5mb的空气氛18小时，生活20天。在缺氧后的第四天以200微升的体积静脉内注射(IV)在加有0.25％人血清白蛋白的柠檬酸缓冲液中配制的rhEPO或SEP-1-B51。两天之后，对各只小鼠腹膜内(i.p.)注射0.2μCi的59Fe。3天之后通过测定通过心脏穿刺取的500微升血液中存在的放射性量来估计RBC-放射性铁的摄取。
72-小时RBC-59Fe摄取(剂量的％)对于SEP-1-B51和rhEPO表明清楚的剂量相关响应，增加的剂量至多至5微克/千克伴随59Fe摄取增加，高于至5微克/千克则反应趋向平稳(25微克/千克)。因此利用最低的三个剂量水平来计算线性回归。图30给出了SEP-1-B51和rhEPO的线性回归分析。SEP-1-B51和rhEPO的响应基本相同。SEP-1-B51与rhEPO的“效能之比”是1.0035(0.6947至1.4498的95％可靠间距)，并且在该项测试中测得的SEP-1-B51效力是100mU/ng(69-145的95％可靠间距)。
SEP-1-B51表现出与rhEPO相似的体内活性，并且以剂量依赖性方式起作用，包括由于在该模型中对于rhEPO的典型的负反馈机理的诱导而在较高剂量下的响应平台。这说明在SEP-1-B51分子中，在精确的使用者确定的糖基化位点连接的聚合物结构模拟rhEPO糖链带来的体内活性。
实施例17
SEP-1-B51的药物动力学研究用在加有0.25％人血清白蛋白的柠檬酸盐缓冲液中配制的单一剂量的5微克/kg的SEP-1-B51，或者rhEPO(等于500U/kg)对正常雄性大鼠组静脉内给药，并且在给药之后5，30，60分钟，2，4，8和24小时，和2，3，4，5，6和7天取血样。使用R & D Systems抗-EPO ELISA试剂盒(R & D Systems，Human ErythropoietinQuantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00)根据生产商说明，通过ELISA分析，测定血浆样品中SEP-1-B51和rhEPO的浓度。
至少进行浓度对数的平方分析，得到下面表XI列出的药物动力学参数。10.5±0.5小时半寿期的单指数药物动力学处理函数可以描述接受一次静脉内施药5微克/千克的雄性大鼠SEP-1-B51血浆浓度随时间的变化。中心隔室(Vc)对于SEP-1-B51的分布体积是32.5±2.0mL/kg。清除率(CL)是2.15mL/hr/kg，平均滞留时间(MRT)是15.1±0.7小时。比较而言，利用双指数药物动力学处理函数最好地描述接受5微克/千克静脉内给药的雄性大鼠rhEPO血浆浓度的变化，α半寿期是1.24±0.22小时，β半寿期是5.51±0.40小时。Vc对于rhEPO是57.0±3.2mL/kg。CL是16.0±0.5mL/hr/kg，比SEP-1-B51的大大约8倍。rhEPO平均滞留时间(MRT)是5.73±0.17小时，比SEP-1-B51的短大约3倍。
表XI与rhEPO相比较的SEP-1-B51的药物动力学参数

图31图示说明SEP-1-B51和rhEPO血浆清除率。这些数据说明与糖基化重组人EPO相比，SEP-1-B51的循环半寿期显著提高，并且这种提高是由于该分子中在精确的使用者确定的位点连接的聚合物的结构。
实施例18聚合物修饰的合成的Rantes蛋白质的合成为了进一步说明本发明的聚合物修饰的蛋白质，制备两种RANTES 2-68的聚合物修饰的衍生物(RANTES G1755-01；图32和RANTES G1755；图33)和两种RANTES4-66的聚合物修饰的衍生物(RANTES G1805；图34和RANTES G1806；图35)。图32-35给出了这些聚合物修饰的蛋白质的结构。
RANTES类似物G1755-01的制备如下合成图32所示的RANTES类似物，G1755-01。
1.AOP-[RANTES(2-33)]-硫酯的制备氨基氧基戊烷-乙二醛基-PYSSDTTPCC FAYIARPLPRAHIKEYFYTS GK-硫酯通过在产生硫酯的树脂上组装RANTES(2-33)序列(Hackeng等，PNAS(1999)9610068-10073)来合成包含N-末端氨基氧基戊烷-乙二醛基肟部分(AOP)的N-末端肽片段AOP-[RANTES(2-33)-α硫酯(硫酯也称作-C(O)SR)，然后根据标准方法(Wilken等，Chemistry&Biology(1999)6(1)43-51)，通过氨基氧基戊烷-乙二醛基肟部分[即CH3(CH2)4-O-N＝CHCOOH]与树脂的直接偶联，在N-末端进行修饰。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相HPLC纯化，得到α-羧酸硫酯肽AOP-RANTES(2-33)-硫酯。实测质量＝4179.6Da；计算质量＝4178.6Da(平均同位素组成)。
2.[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70的制备CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L其中GP6与Lys 69的Nε键合 a.固相肽和在-{肽-树脂}上的水溶性聚合物合成根据Schnolzer，等，Int.J.Pep.Protein.Res.，(1992)40180-193所述，应用对于Boc化学SPPS的原位中和作用/HBTU活化方法，在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上通过常规SPPS合成C-末端肽片段[RANTES(34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70。
链组装完全之后，用20％哌啶的DMF溶液处理，从保护的肽-树脂去除Lys69的ε氮上的Fmoc基团。然后在含有DIEA的DMF中的HOBT溶液中琥珀酸酐与Lys69上的ε氮偶联。洗涤之后，通过加入CDI的DMF溶液活化树脂-键合的琥珀酸的自由羧基。又一次洗涤循环之后，加入DMF中0.5M HOBT中的50％TTD。洗涤之后，树脂-键合的聚合物准备好下一个琥珀酸酐偶联/CDI活化/TTD偶联循环。6次循环之后，在加有DIEA溶液的HOBT/DMF中，琥珀酸酐与最后的TTD胺偶联。
用氟化氢从树脂上裂解肽/线性水溶性聚合物树脂，并且通过反相制备HPLC纯化产物，得到[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70。实测质量＝6253Da；计算质量＝6252Da(平均同位素组成)。
3.G1755-01的制备氨基氧基戊烷-乙二醛基-PYSSDTTPCC FAYIARPLPRAHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREYINSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO4)根据Dawson等，Science 266776-779(1994)所述，通过天然化学连接将上述N-末端和C-末端肽片段连接在一起。应用反相HPLC用线性梯度乙腈对含有0.1％三氟乙酸的水纯化还原形式的全长多肽产物。实测质量＝10060Da。
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原偶联的含水缓冲液中伴随形成2个二硫化物键使带有GP6的全长多肽折叠，并且根据标准方法(Wilken等，Chemistry&Biology(1999)6(1)43-51)，通过反相HPLC纯化。折叠的产物在HPLC分析中是同质的。实测质量＝10056Da；计算质量＝10058Da(平均同位素组成)。
实施例19RANTES类似物G1755的制备如下合成图33所示的G1755化合物。
1.正壬酰基-RANTES(2-33)的制备正壬酰基-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-硫酯根据上述实施例18所述，在产生硫酯的树脂上合成正壬酰基-RANTES(2-33)，然后通过正壬酸与树脂的直接偶联在N-末端进行修饰。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相HPLC纯化，得到正壬酰基-RANTES(2-33)。实测质量＝4177.0Da；计算质量＝4177.6Da(平均同位素组成)。
2.RANTES(34-68)-Lys69(GP6)-Leu70的制备CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEMSK(GP6)La.固相肽和在-{肽-树脂}上的水溶性聚合物合成根据上文实施例18所述，应用对于Boc化学固相肽合成的原位中和作用/HBTU活化方法，在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上通过常规固相肽合成来合成RANTES(34-68)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
链组装完全之后，根据上文实施例18所述，从保护的肽-树脂去除Lys69的ε氮上的Fmoc基团，并且在肽树脂上合成GP6构建体。用氟化氢裂解肽/线性水溶性聚合物，并且通过反相制备HPLC纯化产物，得到RANTES(34-68)-Lys69(GP6)-Leu70。实测质量＝6252.9Da；计算质量＝6252.2Da(平均同位素组成)。
3.G1755的制备壬酰基-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.5)a.通过天然化学连接的全长多肽的组装根据上文实施例18所述，通过天然化学连接将N-末端和C-末端肽片段连接在一起。应用反相HPLC用线性梯度乙腈对含有0.1％三氟乙酸的水纯化还原形式的全长多肽。实测质量＝10060.7Da；计算质量＝10058.7Da(平均同位素组成)。
b.修饰有水溶性聚合物的多肽的折叠和纯化在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原偶联的含水缓冲液中使连有GP6的全长多肽折叠，伴随形成2个二硫化物键，并且根据上文实施例18所述，通过反相HPLC纯化。折叠的产物在HPLC分析中是同质的。实测质量＝10057.4Da；计算质量＝10054.7Da(平均同位素组成)。
实施例20RANTES类似物G1805的制备如下合成图34所示的G1805化合物。
1.正壬酰基-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯的制备壬酰基-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-硫酯其中X＝L-环己基甘氨酸(Chg)根据上文实施例18所述，在产生硫酯的树脂上合成正壬酰基-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)，然后通过正壬酸与树脂的直接偶联在N-末端进行修饰。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相HPLC纯化，得到正壬酰基-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)。实测质量＝41512.0Da；计算质量＝4152.6Da(平均同位素组成)。
2.RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70的制备CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEK(Lev)SKL根据上文实施例18所述，应用对于Boc化学SPPS的原位中和作用/HBTU活化方法，在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上通过常规SPPS来合成RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
链组装完全之后，使用20％哌啶的DMF溶液处理，从保护的肽-树脂去除Lys67的ε氮上的Fmoc基团。用1，3-二异丙基碳化二亚胺活化乙酰丙酸作为对称酸酐，并且与在Lys67的ε氮偶联。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相制备HPLC纯化产物，得到RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70。实测质量＝4433.2Da；计算质量＝4434.2Da(平均同位素组成)。
3.G1805的制备壬酰基-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREYINSLEK(Lev-GP29)SKL(SEQ ID NO.6)其中X＝L-环己基甘氨酸(Chg)，并且其中GP29＝图34描述的支化的肟连接的水溶性聚合物构建体，并且如实施例4所述制备。
a.通过天然化学连接的全长多肽的组装根据上文实施例18所述，通过天然化学连接将N-末端和C-末端肽片段连接在一起。应用反相HPLC用线性梯度乙腈对含有0.1％三氟乙酸的水纯化还原形式的全长多肽。实测质量＝8213.6Da；计算质量＝8216.6Da(平均同位素组成)。
b.GP29与连接的全长多肽的连接用等摩尔量的包含氨基氧基乙酰基(AoA)的支化水溶性聚合物构建体GP29溶解冻干的全长多肽并且一起冻干。溶解干燥粉末并且通过反相HPLC纯化，得到通过与位置67处的赖氨酸的修饰的侧链上酮基官能团肟键共价连接的带有GP29的全长多肽。实测质量＝23836Da；计算质量＝23845Da(平均同位素组成)。或者多肽折叠之后共价连接GP29，但是发现这样的产率较低。
c.包含肟连接的GP29的多肽的折叠和纯化在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原偶联的含水缓冲液中使连有GP29的全长多肽折叠伴随形成2个二硫化物键，并且根据上文实施例18所述，通过反相HPLC纯化。折叠的产物在HPLC分析中是同质的。实测质量＝23832Da；计算质量＝23840Da(平均同位素组成)。
实施例21RANTES类似物G1806的制备如下合成图35所示的RANTES类似物，G1806。
1.正壬酰基-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯的制备壬酰基-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-硫酯其中X＝L-环己基甘氨酸(Chg)根据上文实施例18所述，在产生硫酯的树脂上合成肽片段正壬酰基-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯(硫酯也称为-COSR，其中R是烷基)，然后通过正壬酸与树脂的直接偶联在N-末端进行修饰。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相HPLC纯化，得到正壬酰基-RANTES(2-33)Tyr3Chg。实测质量＝4152.0Da；计算质量＝4152.6Da(平均同位素组成)。
2.RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(Palm)-Leu70的制备
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYINSLEK(Lev)SK(Palm)L其中K(Lev)是来自野生型RANTES的Met67Lys变化的Lys67的乙酰丙酸修饰的ε氮原子；并且其中K(Palm)是通过氨基-辛酸部分连接的Lys69的棕榈酸酯修饰的ε氮原子，具有结构式[ε氮原子Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3根据上文实施例18所述，应用对于Boc化学固相肽合成的原位中和作用/HBTU活化方法，在Boc-Leu-OCH2-Pam-树脂上通过常规SPPS来合成RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Palm)-Leu70。在69位偶联Boc-Lys(Fmoc)-OH之后，使用20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc基团。用HBTU/DIEA活化Fmoc-8-氨基-辛酸，并且与在Lys69的ε氮原子偶联。去除Fmoc基团之后，用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HATU)和1，3-二-异丙基碳化二亚胺活化棕榈酸，并且与树脂偶联。根据实施例18所述使用标准Boc化学SPPS方法完成链组装。链组装完全之后，使用20％哌啶的DMF溶液处理，去除Lys67的ε氮原子上的Fmoc基团。用1，3-二异丙基碳化二亚胺活化乙酰丙酸为对称酸酐，并且与在Lys67的ε氮原子偶联。用氟化氢裂解肽-树脂，并且通过反相制备HPLC纯化产物，得到RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(棕榈酸酯)-Leu70。实测质量＝4813.7Da；计算质量＝4813.8Da(平均同位素组成)。
3.G1806的制备壬酰基-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev-GP29)SK(Palm)L(SEQ ID NO.7)其中X＝L-环己基甘氨酸(Chg)，并且其中棕榈酸酯(“Palm”)脂肪酸连接是通过氨基辛酸部分[ε氮原子Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3a.通过天然化学连接的脂肪酸修饰的全长多肽的组装根据上文实施例18所述，通过天然化学连接将N-末端和C-末端肽片段连接在一起。应用反相HPLC用线性梯度乙腈对含有0.1％三氟乙酸的水纯化还原形式的全长多肽。实测质量＝8598.2Da；计算质量＝8596.3Da(平均同位素组成)。
b.水溶性聚合物GP29与连接的脂肪酸修饰的全长多肽的连接用等摩尔量的包含AoA的聚合物GP29溶解冻干的全长多肽并且一起冻干。溶解干燥粉末并且通过反相HPLC纯化，得到通过与位置67处的赖氨酸的修饰的侧链上酮基官能团肟键共价连接的带有GP29的全长多肽。实测质量＝24217Da；计算质量＝24224.Da(平均同位素组成)。或者多肽折叠之后可以共价连接GP29，但是发现这样的产率较低。
c.包含肟连接的GP29和脂肪酸的多肽的折叠和纯化在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化还原偶联的含水缓冲液中使连有GP29的全长多肽折叠伴随形成2个二硫化物键，并且根据上文实施例18所述，通过反相HPLC纯化。折叠的产物在HPLC分析中是同质的。实测质量＝24210Da；计算质量＝24220Da(平均同位素组成)。
图36说明最终折叠的纯化的合成的Rantes类似物的代表性分析数据。特别地，图36给出了在还原(R)和非还原(N)条件下野生型(Wt)RANTES相对于合成的趋化因子类似物RANTES G1806的相对分子量之比较的代表性SDS-PAGE凝胶。在各条凝胶的左侧标出了相对分子量，其相应于相同凝胶上分析的分子量标准(没有给出)。还示出了折叠的纯化的G1806产物的代表性RP-HPLC色谱。这说明与野生型天然RANTES相比，精确的聚合物修饰的构建体的纯度和提高的相对分子量。
实施例22G1755-01，G1755，G1805和G1806的细胞融合试验进行细胞融合试验来检测各种聚合物修饰的RANTES类似物的抗-HIV活性。使用经工程处理使其含有的病毒膜蛋白与携带CD4和CCR5并且包含报道基因受体系统的细胞融合的细胞测定给定一组化合物抑制CCR5-依赖性细胞融合的能力。基本上根据Simmons等(Science(1997)276276-279)所述，使用细胞系HeLa-P5L和HeLa-Env-ADA，进行CCR5-介导的病毒包被-介导的细胞融合测试，所述两种细胞系均由M.Alizon(巴黎)实验室友情提供。简要地说，将HeLa-P5L细胞接种于96-孔板中(每孔100微升中104个细胞)。24小时之后去除培养基并且对每孔加入含有104HeLa-Env-ADA细胞加趋化因子(200微升终体积)的培养基。又过24小时之后，用PBS将细胞清洗一次并且溶解于室温的50微升PBS/0.5％NP-40中15分钟。通过加入50微升2XCPRG底物(16mM氯代苯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷；120mM Na2HPO4，80mM NaH2PO4，20mM KCl，20mM MgSO4，和10mM β-巯基乙醇)，接着在室温下避光温育1-2小时，对溶胞产物测定对β-半乳糖苷酶的活性。然后在Labsystems微量板读数器上读取575nm下的吸收度。根据这些数值，计算各抑制剂浓度下的抑制百分率[100×(OD(试验)-OD(负对照))/OD(正对照)-OD(负对照))]。从融合抑制百分率对抑制剂浓度的图可以计算各化合物的IC50值。
下面表XII中给出了代表性结果。
表XIIHeLa P4-CCR5/HeLa-Env-ADA细胞融合数据化合物 EC50AOP-RANTES(2-68) 1.81×10-9MNNY-RANTES(2-68) 3.23×10-10MRANTES G1755-01 11.00×10-9MRANTES G1755 1.87×10-9MRANTES G1805 1.40×10-9MRANTES G1806 2.98×10-10M这些结果证明，线性或支化水溶性聚合物构建体定点修饰之后，抗融合活性基本上保持。该结果出人意料地给出这样的发现，即当疏水性部分例如脂肪酸，与C-末端连接时，各种RANTES类似物的活性提高，这支持了这样的假设，即一般来说RANTES类似物的疏水性提高将提高抗融合活性。相反，用于修饰特别是支化水溶生聚合物的水溶性聚合物亲水性很强并且带负电荷，但是只发现最低限度的活性降低，它就在体内活性的目标功效范围内。甚至还没有意料到的是，与较小的线性水溶性聚合物构建体相比，用较大的带负电荷的支化水溶性聚合物构建体修饰的RANTES类似物的活性相对保持，并且小的线性和大的支化聚合物修饰的类似物对活性基本上有相同的作用。当，根据设计，水溶性聚合物修饰使得野生型RANTES的侧链C-末端残基在聚集区内在化时，相信后面的发现部分是由于抗聚集性质，和/或水溶性聚合物的定位的抗融合性质。
相对AOP-RANTES和NNY-RANTES来说，另外的提高功效的改变补偿了水溶性聚合物连接带来的最低限度的活性损失。这些改变包括在N-末端导入一个或多个疏水性氨基酸衍生物，对C-末端加入疏水性脂肪酸部分。这些结果表明附加变化结合单分散性聚酰胺乙烯聚合物(或者其它水溶性聚合物)能够提高NNY-和AOP-型修饰的趋化因子分子的总功效，所述分子是例如具有N-末端组合的Pro2Thz和Tyr3Chg变化和/或C-末端加脂质部分的AOP-或NNY-RANTES。
实施例23G1755，G1805和G1806的药物动力学研究如下对雄性Sprague-Dawley大鼠进行聚合物修饰的RANTES类似物的药物动力学研究。就在注射pH7.0的磷酸缓冲盐水中冻干的蛋白质原种之前，将如上制备的RANTES类似物G1755，G1805，G1806(用AOP-RANTES作为对照)配制成用于静脉内(IV)注射。这样制备制剂以对各个实验动物提供等摩尔剂量的RANTES类似物[400微克/千克(AOP-RANTES)；510微克/千克(G1755)；1210微克/千克(G1805)；和1225微克/千克(G1806)(微克类似物/千克动物)]。需要时调节最终浓度，对每一只动物提供1毫升/千克总剂量体积(即剂量体积保持恒定)。实验第一天对大鼠的尾部静脉内施用各种配制的类似物，各动物接受一次施药。
注射之后，在实验过程中在每一个样品收集时间点从尾静脉/动脉收集大约0.25毫升血液，使用EDTA作为抗凝剂，根据标准方法和国家健康动物护理研究所指南来制备血浆或血清样品。根据采集的原始数据调整样品收集时间，以避免在3星期之内从所有的动物采集0.25毫升14个以上样品(根据国家健康动物护理研究所指南确立)。以一星期时间的间隔采集另外的样品，其中可检测的血液水平持续超过最初的样品。使用QuantikineElisa，人RANTES免疫测试，(R&D Systems Catalog#DRN00)，根据厂商说明，测定每一个时间点的各个RANTES类似物的血浆浓度。在整个实验过程内监测动物的整体健康，包括观察体重、饮食习惯、性情、外观等，和没有观察到显著的副作用。图37给出代表性结果。
这些结果证明，水溶性聚合物与各种前体RANTES类似物的连接提供了循环半寿期的大大提高，半寿期的表观增加G1805＞G1806＞G1755＞AOP-RANTES。相对于AOP-RANTES来说，对于G1805增加大约40倍，对于G1806大约20倍，对于G1755大约10倍。总之，期望对水溶性聚合物修饰的RANTES类似物保持高功效和显著改善的循环半寿期的平衡，以提高这些化合物的体内治疗功效，并且降低治疗所需要的剂量的数和量。
尽管与其具体的实施方案相结合描述了本发明，要理解能够对本发明进行进一步修饰，而且该应用意欲覆盖一般根据本发明原理的本发明的所有的变化，应用或适应，并且包括与本发明的公开相背离的成为本发明所述领域公知的或常规实践的那些，以及可能适用于上述基本特征的那些。
序列表序列表<110>格莱风科学公司<120>聚合物修饰的合成的蛋白质<130>03504.269<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<150>60/236,377<151>2000-09-29<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg ThrIle Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu GLn Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Lys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>166<212>PRT<213>人<400>3Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Cys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu CysIle Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Cys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>4<211>69<212>PRT<213>人<400>4Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Met Ser Lys Leu65<210>5<211>69<212>PRT<213>人<400>5Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val
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35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Lys Ser Lys Leu6权利要求
1.一种具有式蛋白质-Un-B-聚合物-J*的分离的合成的生物活性的蛋白质，其中蛋白质包含核糖体特异性蛋白质的多肽链，所述多肽链包含通过一个或多个化学连接位点共价键合的一个或多个不重叠的肽片段，U是与一个或多个所述不重叠的肽片段的一个或多个氨基酸的侧链n的相互反应独特官能团共价键合的独特官能团的残基，其中n是选自1-6的不连续的整数，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是基本上非抗原性的水溶性聚合物，J*是在生理条件下具有选自负电荷，中性和正电荷的净电荷的侧基。
2.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述合成的生物活性蛋白质具有大于25000道尔顿的单体分子量。
3.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述合成的生物活性蛋白质具有模拟与所述核糖体特异性蛋白质相关的生物活性的生物活性。
4.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性蛋白质是哺乳动物蛋白质。
5.权利要求4的合成的生物活性蛋白质，其中所述哺乳动物蛋白质是细胞因子。
6.权利要求4的合成的生物活性蛋白质，其中所述细胞因子选自白细胞介素，红细胞生成刺激蛋白，干扰素，淋巴因子，趋化因子，生长因子，集落刺激因子，和信号肽激素。
7.权利要求4的合成的生物活性蛋白质，其中所述哺乳动物蛋白质是人蛋白质。
8.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性蛋白质包含核糖体特异性糖基化位点。
9.权利要求8的合成的生物活性蛋白质，其中U在相应于核糖体特异性糖基化位点的所述多肽链的一个位点与所述侧链n共价键连。
10.权利要求9的合成的生物活性蛋白质，其中U在相应于所述核糖体特异性糖基化位点的一个位点专一地与所述侧链n共价连接。
11.根据权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性蛋白质是重组制备的蛋白质。
12.权利要求11的合成的生物活性蛋白质，其中所述重组制备的蛋白质是非天然蛋白质。
13.权利要求12的合成的生物活性蛋白质，其中所述非天然蛋白质具有一个或多个非天然核糖体特异性糖基化位点。
14.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述多肽链包含一个或多个不规则氨基酸。
15.权利要求14的合成的生物活性蛋白质，其中所述不规则氨基酸具有除了20种遗传编码氨基酸的其他氨基酸的侧链。
16.权利要求15的合成的生物活性蛋白质，其中所述不规则氨基酸选自假氨基酸和疏水性氨基酸衍生物。
17.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述化学连接位点包含选自酰胺，肟，腙，硫酯，噻唑烷，噁唑烷和硫醚的键。
18.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述侧链n是非天然侧链。
19.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中U通过化学连接形成的键与所述侧链n共价键连。
20.权利要求19的合成的生物活性蛋白质，其中所述通过化学连接形成的键选自酰胺，肟，腙，硫酯，噻唑烷，和噁唑烷。
21.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中U、B、聚合物和J*的一个或多个由间隔基团或连接基团隔开，并且具有式U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*，其中s1，s2和s3是可以相同或不同的并且可以分别存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。
22.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中U是选自肟，酰胺，胺，尿烷，醚，硫醚，酯，硫酯，酰肼，噁唑烷和噻唑烷的键的残基。
23.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B的一个臂与U连接，B的第二个臂与聚合物连接。
24.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B包括四个或多个臂。
25.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述臂中至少一个包括选自肟，酰胺，胺，尿烷，硫醚，酯，硫酯，酰肼，噁唑烷和噻唑烷的键的残基。
26.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B包括选自氨基，羧酸酯和混合的氨基-羧酸酯的支化核心。
27.权利要求26的合成的生物活性蛋白质，其中所述氨基支化核心包括赖氨酸，所述羧酸酯支化核心包括谷氨酸或天冬氨酸，并且所述混合的氨基-羧酸酯支化核心包括γ-谷氨酸。
28.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中聚合物选自聚氧化烯，聚酰胺氧化烯及其衍生物。
29.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述侧链n在所述多肽链的化学连接位点。
30.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B-聚合物-J*具有1500和80000道尔顿之间的分子量。
31.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述侧链n是2个或多个，并且其中B-聚合物-J*的一个或多个是不同的。
32.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B-聚合物-J*具有在生理条件下选自负电荷，中性和正电荷的净电荷。
33.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中B-聚合物-J*是单分散性的。
34.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中所述合成的生物活性蛋白质是单分散性的。
35.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中聚合物是式-[C(O)-X-C(O)NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-100的整数，其中X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的水溶性重复单元。
36.权利要求35的合成的生物活性蛋白质，其中所述X是式-NH-X’-或-X’-NH-的二价基团，其中X’是包括可以是直链或支链的水溶性重复单元的二价基团。
37.权利要求35的合成的生物活性蛋白质，其中所述Y是式-CO-Y’-或-Y’-CO-的二价基团，其中Y’是二价基团。
38.权利要求35的合成的生物活性蛋白质，其中n是2-50的不连续整数。
39.权利要求35的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(O-CH2-CH2)-的环氧乙烷重复单元。
40.权利要求39的合成的生物活性蛋白质，其中所述环氧乙烷重复单元具有式-(CH2-CH2-O)n-或-(O-CH2-CH2)n-，其中n是2-50的不连续整数。
41.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中J是在生理条件下具有选自负电荷和正电荷的净电荷的可离子化基团。
42.权利要求41的合成的生物活性蛋白质，其中所述可离子化基团选自羧基，胺和羟基。
43.权利要求1的合成的生物活性蛋白质，其中J是在生理条件下具有净中性电荷的非可离子化基团。
44.权利要求35的合成的生物活性蛋白质，它具有与没有所述水溶性聚合物的相应的合成的生物活性蛋白质相比更大的、哺乳动物增加的循环半寿期。
45.一种合成的生物活性蛋白质，它包含多肽链，所述多肽链包括核糖体特异性糖蛋白的氨基酸序列，所述多肽链具有与之相连的一个或多个水溶性聚合物，并且具有的单体分子量大于大约25kDa。
46.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述合成的生物活性蛋白质具有模拟与所述核糖体特异性糖蛋白相关的生物活性的生物活性。
47.权利要求46的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性糖蛋白是细胞因子。
48.权利要求47的合成的生物活性蛋白质，其中所述细胞因子选自红细胞生成刺激蛋白，Rantes，和粒细胞集落刺激因子。
49.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性糖蛋白具有一个或多个糖基化位点。
50.权利要求49的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性聚合物在相应于所述一个或多个糖基化位点的一个或多个位点与所述多肽链连接。
51.权利要求50的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性聚合物在相应于所述一个或多个糖基化位点的一个或多个位点与所述多肽链专一地连接。
52.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述核糖体特异性糖蛋白是重组制备的糖蛋白。
53.权利要求52的合成的生物活性蛋白质，其中所述重组制备的糖蛋白是非天然糖蛋白。
54.权利要求53的合成的生物活性蛋白质，其中所述非天然糖蛋白具有一个或多个非天然糖基化位点。
55.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述多肽链包括一个或多个不规则氨基酸。
56.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性聚合物具有1500和80000道尔顿之间的分子量。
57.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性聚合物生理条件下具有选自负电荷，中性和正电荷的净电荷。
58.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中聚合物选自聚氧化烯、聚酰胺氧化烯及其衍生物。
59.权利要求45的合成的生物活性蛋白质，其中聚合物是式-[C(O)-X-C(O)NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-100的整数，其中X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的水溶性重复单元。
60.权利要求59的合成的生物活性蛋白质，其中n是2-50的不连续整数。
61.权利要求59的合成的生物活性蛋白质，其中所述水溶性重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(O-CH2-CH2)-的环氧乙烷重复单元。
62.一种药物组合物，它包含权利要求1至61任一项的合成的生物活性蛋白质，或者其药学可接受盐。
63.根据权利要求62的药物组合物，它含有一种或多种选自缓冲剂，载体蛋白质，氨基酸，洗涤剂，脂质，水溶性聚合物和保鲜剂的赋形剂。
64.根据权利要求63的药物组合物，其含有除所述合成的生物活性蛋白质之外的一种或多种附加的生物活性物质。
65.一种治疗人疾病或症状的方法，该方法包含对需要这样的治疗的个体施用有效量的一种药物组合物，所述药物组合物含有具有大于大约25kDa的单体分子量的并且具有模拟与天然人蛋白质受体或者其片段、蛋白质受体配体或者其片段、或者细胞因子相关的生物活性的生物活性的聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质的一种或多种分子同质药学成分。
66.权利要求65的方法，其中所述合成的生物活性蛋白质具有细胞因子的生物活性。
67.权利要求66的方法，其中所述细胞因子选自白细胞介素，红细胞生成刺激蛋白，干扰素，淋巴因子，趋化因子，生长因子，集落刺激因子，和信号肽激素。
68.权利要求62的药物组合物，它用于治疗与天然人蛋白质受体或者其片段，蛋白质受体配体或者其片段，或者细胞因子的生物活性相关的或者没有该生物活性的人疾病或症状。
69.权利要求68的药物组合物，其中所述聚合物修饰的合成的生物活性蛋白具有细胞因子的生物活性。
70.权利要求69的药物组合物，其中所述细胞因子选自白细胞介素，红细胞生成刺激蛋白，干扰素，淋巴因子，趋化因子，生长因子，集落刺激因子，和信号肽激素。
71.一种制备合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的聚合物修饰的多肽链的方法，所述方法包括化学连接包括所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的多肽链的非重叠氨基酸序列的肽片段，其中所述肽片段中的一个或多个具有与之连接的水溶性聚合物，从而制备所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的聚合物修饰的多肽链。
72.权利要求71的方法，其中所述多肽链包括核糖体特异性蛋白质的氨基酸序列。
73.权利要求72的方法，其中所述核糖体特异性蛋白质是哺乳动物蛋白质。
74.权利要求73的方法，其中所述哺乳动物蛋白质是细胞因子。
75.权利要求74的方法，其中所述细胞因子选自白细胞介素，红细胞生成刺激蛋白，干扰素，淋巴因子，趋化因子，生长因子，集落刺激因子，和信号肽激素。
76.权利要求71的方法，其进一步包括折叠所述聚合物修饰的多肽链，从而制备合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质。
77.权利要求71的方法，其中所述肽片段的一个或多个被部分保护。
78.权利要求71的方法，其中所述肽片段的一个或多个不被保护。
79.权利要求71的方法，其中所述肽片段的一个或多个包括一个或多个不规则氨基酸。
80.权利要求71的方法，其中所述化学连接包括选自天然化学连接，拓展的天然化学连接和假天然化学连接的化学选择性连接化学。
81.权利要求71的方法，其中所述水溶性聚合物具有1500至80000道尔顿之间的分子量。
82.一种制备合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的聚合物修饰的多肽链的方法，所述方法包括a.化学连接包括所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的非重叠氨基酸序列的肽片段，以形成相应于所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的氨基酸序列的全长多肽链，其中所述肽片段中的一个或多个具有第一个独特化学选择性基团；和b.化学连接水溶性聚合物到所述全长多肽链上，所述水溶性聚合物包括第二个化学选择性基团，其相互地且特定地与所述第一个独特化学选择性基团反应，从而制备所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的聚合物修饰的多肽链。
83.权利要求82的方法，其进一步包括折叠所述聚合物修饰的多肽链，从而制备合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质。
84.一种制备合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的方法，所述方法包括a.化学连接包括所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的非重叠氨基酸序列的肽片段，形成相应于所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的氨基酸序列的全长多肽链，其中所述肽片段中的一个或多个包含非天然侧链，后者包含第一个独特化学选择性基团，其与遗传编码的氨基酸的氨基酸的侧链官能团不反应；b.折叠所述全长多肽链，形成折叠的多肽链；和c.化学连接水溶性聚合物至所述折叠的多肽链上，所述水溶性聚合物包括第二个化学选择性基团，其相互地且特定地与所述第一个独特化学选择性基团反应，从而制备所述合成的生物活性聚合物修饰的蛋白质的聚合物修饰的多肽链。
85.下式的分子同质水溶性聚合物U-s1-B-s2-聚合物-s3-J*其中U是特定官能团的残基，B是具有可以是相同或不同的并且可以是存在或不存在的三个或多个臂的支化核心，聚合物是具有大于大约5000道尔顿的分子量的式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中X和Y是可以是相同或不同的并且可以是支链或直链的二价基团，n是2-50的不连续的整数，其中X和Y之一或两者包括可以是直链或支链的基本上非抗原性的水溶性重复单元，J*是在生理条件下具有选自负电荷，正电荷和中性的净电荷的基本上非抗原性的侧基的残基，并且其中s1，s2和s3是可以是相同或不同的并且各自可以存在或不存在的间隔基团或连接基团部分。
86.权利要求85的水溶性聚合物，其中U是选自下列的官能团的残基丙烯酸酯，醛，酮，氨基氧基，胺，羧酸，酯，硫酯，卤素，硫醇，氰基乙酸酯，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，环氧化物，酰肼，叠氮化物，异氰酸酯，马来酰亚胺，甲基丙烯酸酯，硝基苯基碳酸酯，正吡啶基二硫化物，硅烷，巯基，乙烯基砜，戊二酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸琥珀酰亚胺基酯，琥珀酸，tresylate和可活化的官能团。
87.权利要求85的水溶性聚合物，其中U是能形成选自碳酸酯，酯，尿烷，原酸酯，酰胺，胺，肟，酰亚胺，脲，硫脲，硫醚，硫代尿烷，硫酯，醚，噻唑烷，腙，和噁唑烷的键的官能团的残基。
88.权利要求85的水溶性聚合物，其中U是被保护的。
89.权利要求85的水溶性聚合物，其中存在s1，s2和s3的一个或多个并且选择其具有1-18个碳原子。
90.权利要求85的水溶性聚合物，其中存在s1，s2和s3的一个或多个并且被选择并且包括聚合物。
91.权利要求85的水溶性聚合物，其中s1包括聚合物。
92.权利要求85的水溶性聚合物，其中B包括四个或多个臂。
93.权利要求85的水溶性聚合物，其中所述分子量大于大约10000Da。
94.权利要求93的水溶性聚合物，其中所述分子量大于大约15000Da。
95.权利要求85的水溶性聚合物，其中B包括通过一个或多个酰胺键与s2或聚合物连接的支化核心。
96.权利要求85的水溶性聚合物，其中B包括通过酰胺键与聚合物连接的支化核心。
97.权利要求85的水溶性聚合物，其中所述重复单元包括式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的环氧乙烷。
98.权利要求85的水溶性聚合物，其中X，Y，或X和Y选自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中n1是1-6的不连续整数，n2是2-50的不连续整数。
99.权利要求85的水溶性聚合物，X或Y之一选自苯基，C1-C10亚烷基部分，C1-C10烷基，含有杂原子的苯基，含有杂原子的C1-C10亚烷基部分，含有杂原子的C1-C10烷基，和它们的组合。
100.权利要求96的水溶性聚合物，其中X是-(CH2-CH2)-。
101.权利要求100的水溶性聚合物，其中Y是-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-n，其中n是6-36。
102.权利要求85的水溶性聚合物，其中J*是被保护的。
103.权利要求85的水溶性聚合物，其中J*包括在生理条件下具有净中性电荷的非可离子化基团。
104.权利要求85的水溶性聚合物，其中J*包括在生理条件下具有净正电荷的可离子化基团。
105.权利要求85的水溶性聚合物，其中J*包括在生理条件下具有净负电荷的可离子化基团。
106.权利要求85的水溶性聚合物，其中X是-X’-NH-或-NH-X’-。
107.权利要求85的水溶性聚合物，其中Y是-Y’-NH-或-NH-Y’-。
108.权利要求107的水溶性聚合物，其中X’和Y’中至少一个包括式(-CH2-CH2-O-)n或(O-CH2-CH2-)n聚氧化乙烯，其中n是2-50。
109.权利要求85的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物是单分散性的。
全文摘要
本发明涉及用聚合物，特别是糖基模拟聚合物来修饰肽，多肽和蛋白质，以提高它们的生物学活性或药物动力学性质的方法和组合物。本发明还提供了这样的聚合物修饰的肽，多肽和蛋白质的方法和用途。本发明特别适合在聚合物修饰的合成的生物活性蛋白质(图1D)的合成中应用，和含有这样的蛋白质的药物组合物的合成中应用。
文档编号C07K19/00GK1454097SQ01815381
公开日2003年11月5日 申请日期2001年7月12日 优先权日2000年9月8日
发明者G·G·科亨德菲尔, S·B·H·肯特, P·博蒂, D·W·罗, J·A·布拉德博尼, S·－Y·陈, S·克雷斯曼, C·L·亨特, J·G·维尔肯 申请人:格莱风治疗公司