专利名称：PEG干扰素α－2a的位置异构体的制作方法
技术领域：
本发明涉及单聚乙二醇化干扰素α-2a的位置异构体和分离其的方法及其在制备用于治疗疾病，特别是用于治疗病毒性疾病的药物中的应用。
干扰素α-2a在治疗慢性丙型肝炎方面发挥重要作用，但其功效因体内半衰期短而受限。为了改善半衰期和功效，将干扰素α-2a和聚乙二醇部分结合在一起。聚乙二醇化改变了蛋白质的物化和生物性质。一种效果是蛋白水解性降解和肾清除率的降低。这增加了血液中聚乙二醇化蛋白质的半衰期。另一种效果是体内分布发生改变，该分布取决于蛋白质的聚乙二醇部分的大小。用大聚乙二醇部分(PEG部分)聚乙二醇化的干扰素α-2a具有改善的生物学活性，并表现出持续的吸收和降低的肾脏清除率，导致在一周一次的给药时间表内强烈的抗病毒压，参见Perry M.C等，Drugs，2001，15，2263-2288和Lamb M.W等，The Annals of Pharmacotherapy，2002，36，933-938，所述聚乙二醇部分例如40kDa、支化的聚乙烯部分， 其中，R和R’独立地是低级烷基；n和n’是具有从600至1500的和的整数，所述偶联物中聚乙二醇单元的平均分子量为大约26,000道尔顿至大约66,000道尔顿。
在EP A 809 996中描述了聚乙二醇化干扰素α-2a的方法。由于这种聚乙二醇化是通过反应下式的PEG2-NHS与干扰素α的例如赖氨酸上的伯氨基或其N-末端来进行，
所以可以附着一个或更多的PEG部分，形成未聚乙二醇化、单聚乙二醇化和多聚乙二醇化的干扰素的混合物。通过本领域熟知的方法能从混合物中分离出单聚乙二醇化干扰素α。而且，由于干扰素α-2a分子显示12个聚乙二醇化位点(11个赖氨酸和N末端)，因此它是位置异构体的混合物。这些可能的12个异构体中，分离并表征了9个，这些中的每一个在特定的赖氨酸结合支化的聚乙二醇G链，即在赖氨酸(31)处结合，形成在赖氨酸(31)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(31)]，在赖氨酸(49)处结合，形成在赖氨酸(49)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(49)]，在赖氨酸(70)处结合，形成在赖氨酸(70)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(70)]，在赖氨酸(83)处结合，形成在赖氨酸(83)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(83)]，在赖氨酸(112)处结合，形成在赖氨酸(112)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(112)]，在赖氨酸(121)处结合，形成在赖氨酸(121)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(121)]，在赖氨酸(131)处结合，形成在赖氨酸(131)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(131)]，在赖氨酸(134)处结合，形成在赖氨酸(134)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(134)]，在赖氨酸(164)处结合，形成在赖氨酸(164)处聚乙二醇化的干扰素α-2a[表示为PEG-Lys(164)]。
已经发现在抗病毒试验中，PEG-Lys(31)和PEG-Lys(134)具有比混合物更高的活性，PEG-Lys(164)的活性和混合物相同，而PEG-Lys(49)、PEG-Lys(70)、PEG-Lys(83)、PEG-Lys(112)、PEG-Lys(121)和PEG-Lys(131)的活性较低。
所以本发明涉及聚乙二醇化干扰素α-2a的新的位置异构体，即PEG-Lys(31)、PEG-Lys(49)、PEG-Lys(70)、PEG-Lys(83)、PEG-Lys(112)、PEG-Lys(121)、PEG-PEG-Lys(131)、PEG-Lys(134)和PEG-Lys(164)，其特征在于所述聚乙二醇化干扰素中聚乙二醇部分的平均分子量约为26,000道尔顿至约66,000道尔顿，特别是约40000道尔顿。
基于局部电荷差异，已经开发了用于分离聚乙二醇化干扰素α-2a的位置异构体的色谱法。该方法由通过离子交换层析2步分离组成。
因此，在本发明的另一个实施方案中，涉及一种分离聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体的方法，其由下述步骤组成a)在弱阳离子交换基质的制备型液相层析柱上分离位置异构体；b)在制备型柱，优选强阳离子交换基质的HPLC柱，进一步分离和纯化来自第一步的级分。
通过使用约pH3.8-pH8.0的线性pH梯度在弱阳离子交换基质上进行分离步骤a)。
使用线性pH梯度的醋酸钠缓冲液(A)-磷酸钾缓冲液(B)进行分离步骤b)，所述线性梯度从pH 4.2-约4.6，优选约pH4.4的起始pH，到pH约6.4-约6.8、优选pH6.6的最终pH，所述缓冲液另外含有高达12％的乙醇和高达1.5％的二甘醇，优选10％的乙醇和1％的二甘醇。
异构体的洗脱可能受缓冲液起始浓度的影响。缓冲液的浓度为约3-约15mM醋酸钠，优选约3-7mM，理想地从3.4mM或6.8mM。
在室温，或约27℃-约35℃的温度范围，优选约30℃-32℃进行分离步骤b)。
这种方法还可以用于干扰素α-2a聚乙二醇化反应中获得的位置异构体的成分分析。
收集得到的蛋白质样品，用各种蛋白质化学方法进行分析和鉴定，所述分析方法例如质谱肽绘图法(mass spectrometry peptide mapping)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)肽绘图法、未消化的蛋白质的MALDI-TOF光谱法、大小排阻HPLC(SE-HPLC)和SDS-PAGE，参见实施例2-6。
首先，通过MALDI-TOF光谱法测定每个异构体的分子量，以确保聚乙二醇化的干扰素α-2a分子在IEC层析(离子交换层析)后仍然是完整的，和确认单一聚乙二醇化。测定每个IEC峰，无进一步修饰。所有分子的光谱显示了预期的最大值63kDa的宽M+峰，和相应的32kDa的M2+峰和21kDa的M3+峰(图5)。
其次，用C端赖氨酸内切蛋白酶来蛋白水解每个异构体，将得到的MALDI-TOF肽谱与衍生自聚乙二醇化的干扰素α-2a参考标准的图谱进行比较。
基于下述考虑解释位置异构体的光谱和结构鉴定1.因为整个分子的分子量的确定(如上所述)，所以能够排除异构体的二次聚乙二醇化。
2.C端赖氨酸内切蛋白酶(2)不能识别出附着有聚乙二醇化的聚合物基团的特定异构体的单个赖氨酸，New England Journal of Medicine，2000，343，1666-1172，因此，多肽链在那个特定位置未被切割。
3.因此预计特定异构体的肽谱中缺失涉及其单一聚乙二醇化的赖氨酸的肽(和仅仅那些肽)。
4.没有预计到当为非聚乙二醇化的肽的精确检测所选择的质量范围为850-6000Da时，在MALDI-TOF肽谱中检测到具有附着的PEG残基的肽的质峰。PEG部分本身的分子量已有40000Da。但是，利用同样的消化和反式-3-吲哚丙烯酸(IAA)为基质，也已检测到聚乙二醇化的肽。对于每个C端赖氨酸消化的异构体，观察到在46-47kDa的宽峰，证实存在单聚乙二醇化的肽。由于PEG残基诱导的宽质量分布，在这些实验中无法进行附着肽的直接鉴定(数据未显示)。
得到的肽谱如图6所示。与标准进行对照，缺失的峰在图中用箭头标出。
关于干扰素α-2a和聚乙二醇化的IFN α-2a的两个参考光谱，没有看出显著的差异。由于聚乙二醇化的干扰素α-2a是不同的聚乙二醇化异构体的混合物这一事实，用于检测干扰素的所有肽峰也用于检测聚乙二醇化的干扰素α-2a。
从IEC级分1得到的内-C端赖氨酸消化的蛋白质光谱中，850和6,000Da之间的区域中缺失包含氨基酸24-31和32-49的肽，所有其它的峰都存在。所以PEG残基一定是连接在赖氨酸31。
以同样的方式对其他级分进行鉴定。与参照标准光谱进行比较，每种情况下都缺失聚乙二醇化的肽。对于级分3和4a，只缺失1个肽峰，对于第二个肽132-133，因质量太小，在限定的质窗中检测不到。只有级分4a不能用这种方法鉴定，不能作出结论。
为了鉴定异构体4a，已开发了用RP-HPLC/UV检测的内-C端赖氨酸肽绘图法。如MALDI-TOF MS肽绘图所述，用C端赖氨酸内切蛋白酶消化该蛋白质。通过水/乙腈/TFA(三氯乙酸)梯度分离肽。
关于聚乙二醇化的干扰素α-2a参照标准，观察到13个峰。手动收集所有的级分，并通过MALDI-TOF质谱法进行鉴定。
通过比较样品的层析谱与参考材料获得的色谱，再次排布IEC级分4a的聚乙二醇化位点。在该样品的色谱中，明显缺失包含两个肽134-164和134-165的峰，因此IEC级分4a可被指定为含在赖氨酸164位乙二醇化的异构体。聚乙二醇化的干扰素α-2a参考标准(46μg/mL)和级分4a的色谱如图7所示。
分离和表征的9个聚乙二醇化的干扰素α-2a位置异构体的图示在图9中给出。
依照J.Virol.，1981，37，755-758所述的程序，通过在Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞抵抗水泡性口炎病毒(VSV)感染的保护效果来分析分离的异构体的体外抗病毒活性，并与聚乙二醇化的干扰素α-2a标准进行比较。
因此，本发明的另外的实施方案是聚乙二醇化的干扰素α-2a分子的位置异构体，特别是在赖氨酸(31)、赖氨酸(49)、赖氨酸(70)、赖氨酸(83)、赖氨酸(112)、赖氨酸(121)、赖氨酸(131)、赖氨酸(134)和赖氨酸(164)聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体在制备用于抗增殖、抗病毒和免疫调节应用的药物中的应用。尤其优选的是在赖氨酸(31)、赖氨酸(134)和赖氨酸(164)聚乙二醇化的干扰素α-2a在制备这些药物中的应用。位置异构体可以进一步用于制备治疗病毒性疾病，特别是用于治疗丙型肝炎的药物中的应用。
本发明还包括基于式I的化合物或其盐的药物组合物及其制备方法。
本发明用于控制或预防疾病的药物组合物包括聚乙二醇化的IFN α-2a的位置异构体和治疗惰性的、无毒且治疗上能接受的载体物质，所述位置异构体尤其是PEG-赖氨酸(31)、PEG-赖氨酸(134)或PEG-赖氨酸(164)，更特别是PEG-赖氨酸(31)、PEG-赖氨酸(134)的IFN α-2a的位置异构体。使用的药物组合物可以以与考虑到待治疗疾病、个体患者的条件、聚乙二醇化的IFN α-2a的位置异构体的输送位点、给药方法及医师已知的其他因素的良好医学实践相一致的方式配制和给药。
以下更详细描述在分离和表征聚乙二醇化的干扰素α-2a位置异构体的中所用的方法和材料。
如EP A 809996和Bioconjugate Chem.，2001，12，195-202所述，在霍夫曼-拉罗奇有限公司，通过在干扰素分子表面的赖氨酸ε-氨基连接分子量为40,000Da的活性支化的聚乙二醇部分生产用于分离异构体的聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-IFN α-2a)。
使用分析的强阳离子交换柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，粒子大小10μm，直径7.5mm，长度7.5cm)，在位置异构体的分离过程中，检查每个纯化步骤的样品的纯度。分析柱用3.4mM醋酸钠、10％乙醇和1％二甘醇预平衡，并调节pH值到pH 4.4(缓冲液A)。装载PEG-IFN样品后，用缓冲液A洗涤柱，然后用增加的线性梯度至10mM磷酸氢二钾、10％乙醇和1％二甘醇、调节pH值到pH 6.6(缓冲液B)洗涤。流速为1.0mL/min，在218nm检测，结果见
图1。
类似于上述方法，下面的分析方法已经用于干扰素α-2a聚乙二醇化反应中获得的位置异构体的组成分析。
通过本领域已知的方法从反应混合物中分离单聚乙二醇化的干扰素α后，利用分析的液相HPLC(高压液相色谱)法在填充以强阳离子交换基质的柱上分离位置异构体，所述基质例如TosoH Bioscience公司的粒子大小为2.5μm的无孔SP-NPR相。流动相由缓冲液A(10％乙醇(v/v)、1％二甘醇(v/v)、2.3mM醋酸钠和5.2mM醋酸的纯水溶液，不调节pH值)和缓冲液B(10％乙醇(v/v)、1％二甘醇(v/v)、16.4mM KH2PO4和4.4mMK2HPO4的纯水溶液，不调节pH值)组成，结果如图8所示。
下述实施例将进一步解释本发明。
实施例1A位置异构体的分离使用2步分离和纯化方案来制备PEG-干扰素α-2a的单聚乙二醇化异构体。
a)第一步是在弱阳离子交换基质的制备型低压液相色谱柱(TOSOH-BIOSEP，Toyopearl CM-650S，例如，编号为82A的树脂批次，柱直径16mm、长度120cm)上分离位置异构体。以流速0.7mL/min施加线性pH值梯度的增加浓度的醋酸钠(25mM、pH4.0增加至75mM、pH7.8)。在280nm进行检测。利用该层析步骤，可以收集到种类1，2，5，6和3、4、4a、7、8的混合物，见表1。
b)在第二制备步骤中，进一步分离和纯化级分。所使用的制备柱与如上所述的分析强离子交换柱(树脂批次为No.82A、离子交换能力为123mEq/mL)的基质相同，但尺寸相对更大一些(直径30mm、长度70mm)，流速更高，运行时间延长。分析方法中，该柱用3.4mM醋酸钠、10％乙醇和1％二甘醇、调节pH值到pH 4.4(缓冲液A)预平衡。装载PEG-IFN样品后，用缓冲液A洗涤柱，然后用增加的线性梯度至10mM磷酸氢二钾、10％乙醇和1％二甘醇、调节pH值到pH 6.6(缓冲液B)洗涤。流速为1.0mL/min，在218nm进行检测。
基于PEG-IFN α-2a的蛋白质部分的280nm光吸收度，通过分光光度法测定PEG-IFN α-2a异构体的蛋白质浓度。
图1显示了180μg PEG-IFN α-2a的分析洗脱曲线图。这个方法的结果是分离出8个峰，2个峰是基线分离，6个峰是部分分离。朝向色谱图终端的基线吸收的减小提示不存在在更高的停留时间洗脱的其它单聚乙二醇化类别的IFN α-2a。
另外，仔细观察IEC色谱图，看到在峰2和峰3之间靠近检出限处另一个峰，表明存在另外的位置异构体，它应该也对PEG-IFN α-2a混合物的特异性活性负责。期待另外的类别如干扰素α-2a分子显示12个聚乙二醇化的位点(11个赖氨酸和N-末端)。然而，如果这些类别的吸收度较低，则<p>表1
a)对比实施例。
b)本发明实施例。
c)通过x射线衍射测定的层间距离。
d)Nafo 11822+2EO是通式I的线性聚乙烯-嵌段-聚(环氧乙烷)
其中m是1，n是1，x平均值是20，y平均值是2，z是0，和R1是氢。
e)相对于在相似条件下加工的聚丙烯(＝1.0)标准化的弹性模量。
f)PE-b-PEO(MW 920)(RTM)是通式I的线性聚乙烯-嵌段-聚(环氧乙烷)，其中m是1，n是1，x平均值是32，y平均值是10，z是0，和R1是氢。
g)PE-b-PEO(MW 1400)(RTM)是通式I的线性聚乙烯-嵌段-聚(环氧乙烷)，其中m是1，n是1，x平均值是50，y平均值是15，z是0，和R1是氢。
h)Aduxol GA8-03(RTM)是通式Id的化合物实施例1B单聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体的分析分离HPLC仪器 HP1100柱SP-NPR、TosoH Bioscience、粒子大小2.5μm、无孔、定单号13076注入 5-10μg单聚乙二醇化的干扰素流动相缓冲液A10％v/v 乙醇1％v/v二甘醇2.3mM 醋酸钠5.2mM 醋酸的纯水溶液，不调pH缓冲液B10％v/v 乙醇1％v/v二甘醇16.4mMKH2PO44.4mM K2HPO4的纯水溶液，不调pH梯度 0分钟 40％B2分钟 40％B2.1分钟 48％B25分钟68％B27分钟75％B30分钟75％B34分钟40％B40分钟40％B流速 1.0ml/min柱温度25℃检测 218nm图8所示为典型的色谱图。
实施例2通过质谱肽图分析级分在MALDI-TOF MS仪器(PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR，具有延迟提取)上记录质谱。每个IEC(离子交换色谱)级分通过透析脱盐，用0.02M 1，4-二硫代-DL-苏糖醇(DTT)还原，并用0.2M 4-乙烯基嘧啶烷基化。然后在pH8.5、0.25M Tris(三(羟甲基)氨基乙烷)中用C端赖氨酸内切蛋白酶(Wako Biochemicals公司)消化该蛋白质，其中酶与蛋白的比例大约为1∶30。在37℃反应过夜。
使用20mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸和12mg/ml硝化纤维素的40/60(v/v)丙酮/异丙醇溶液的溶液作为基质(厚层应用)。首先，将0.5μL基质放置在靶目标上，自然干燥。然后加入1.0μL样品。在20,000V加速电压和95％栅极电压下以线性阳性电离模式获得光谱。对于每一个光谱，积聚了至少190个覆盖整个斑点的激光发射点。Des-精氨酸1-缓激肽和牛胰岛素用作内部标度。
实施例3高效液相色谱(RP-HPLC)肽图谱通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)肽绘图表征肽。如关于MALDI-TOF MS肽绘图所述，还原、烷基化和用C端赖氨酸内切蛋白酶消化IEC级分。在Waters Alliance HPLC系统，使用Vydac RP-C18分析柱(5μm，2.1×250mm)和装有相同包装材料的预备柱对消化后的异构体进行分析。用梯度为1％到95％的乙腈水溶液以0.2mL/min的流速洗脱105分钟。两种溶剂含有0.1％(v/v)TFA。注入100μL每份消化样品，在215nm处监测。
实施例4未消化蛋白的MALDI-TOF光谱将18mg/ml的反式-3-吲哚丙烯酸的70/30(v/v)乙腈/0.1％三氯乙酸溶液与相同体积的样品溶液预先混合。然后向靶平面施加1.0μL混合物。代表性地，以线性阳性电离模式平均150-200激光发射点。将加速电压设定为25,000V，栅极电压设定到90％。牛血清白蛋白M+和M2+用作外部标度。
实施例5SE-HPLC(大小排阻HPLC)利用配置有TosoHaas TSK凝胶G 4000SWXL柱(7.8×300mm)的WatersAlliance 2690HPLC系统进行SE-HPLC。使用含0.02M NaH2PO4、0.15MNaCl、1％(v/v)二甘醇和10％(v/v)乙醇(pH 6.8)的流动相，以0.4mL/min的流速对蛋白质进行洗脱，在210nm进行检测。注入量为每种异构体20μg。
利用大小排阻HPLC和SDS-PAGE测定不同IEC级分中寡聚PEG-IFNα-2a形式和聚集物的量。参考材料含2.3％聚集物和2.2％寡聚体(图4)。
峰1、4、4a、5、6和8包含小于0.7％的寡聚乙二醇化的干扰素α-2a形式，而峰2、3和7中，寡聚乙二醇化的干扰素α-2a形式的百分数在检出限以下(＜0.2％)。在聚集物的情况下，可能看到不同的趋势。所有峰中聚集物的量低于0.9％。
实施例6SDS-PAGE在非还原和还原条件下，使用16％的Tris-甘氨酸凝胶(1.5mm，10孔)进行SDS-PAGE。使用质量范围为2.5-200kDa的分子量标记Novex Mark 12作为标度，牛血清白蛋白(BSA)用作敏感度标准(2ng)。将大约1μg所有样品和0.5μg标准物加入凝胶中。运行条件是125V，6W，120分钟。固定蛋白质，并使用Novex的银染试剂盒SilverXpress染色。
对于IEC级分1-8在非还原条件下记录的凝胶(图2)显示了与PEG-IFNα-2a参考标准物相当的带型。
在还原条件下，与标准物比较，凝胶显示约90kDa较小带的强度增加。峰6、7和8显示出6kDa和10kDa之间的蛋白片段(图3)。两条带一起相当于大约1％的剪切材料。在异构体1、5、6、7、8的泳道中，可以看到另外的大于100kDa的条带，在标准物中也存在。这些可归类为寡聚体。因此，SDS-PAGE证实了SE-HPLC分析的结果。
总的说来，RP-HPLC和SDS-PAGE实验表明IEC级分的纯度可认为相当于PEG-IFN α-2a参考标志物。
基于使用上述策略的上述方法的结果，鉴定衍生自9个IEC级分的PEG-IFN α-2a类别的结构。
实施例7抗病毒活性(AVA)通过在Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞中抵抗水泡性口炎病毒(VSV)感染的保护作用和与PEG-IFN α-2a标准物相比较，评估抗病毒活性。用含10％牛胎儿血清的Eagle极限必需培养基(MEM)将样品和参考标准物稀释到10ng/mL的终浓度(试验初始浓度)。每份样品一式四份进行分析。
根据Virol.1981，37，755-758所述的方法，对Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞抵抗水泡性口炎病毒(VSV)的抗病毒保护进行测定。表2显示了在抗病毒试验中诱导活性的所有异构体。活性范围在1061和339U/μg之间，说明在位置异构体中蛋白的特异活性的差异是显著的。迄今为止的技术和结果将允许启动进一步的研究以建立位置异构体和α-干扰素受体之间的结构-功能关系。
表2PEG-IFN α-2a和个体PEG-IFN α-2a异构体的体外抗病毒活性。在感染了水泡性口炎病毒的MDBK细胞中测定抗病毒活性。结果表示独立进行的3个试验的平均值。
PEG-IFN的抗病毒试验
通过下面的图进一步解释该结果图1180μg的PEG-IFN α-2a的IEC-HPLC分析结果。使用分析性强阳离子交换柱来检查从每个纯化步骤中分离的位置异构体的纯度(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，粒子大小10μm，直径7.5mm，长度7.5cm)。
图2A/B使用Tris-甘氨酸(16％)的SDS-PAGE分析，样品在非还原条件下进行电泳。用银染对凝胶中的蛋白质进行染色。泳道M，分子量标记蛋白/2，峰1/3，峰2/4，峰3/5，峰4/6，峰4a/7，峰5/8，峰6/9，峰7/10，峰8/11，1×PEG-IFN标准物/12，1.5×PEG-IFN标准物/C1，IFN标准物。
图3A/B使用Tris-甘氨酸(16％)的SDS-PAGE分析，样品在还原条件下进行电泳。用银染对凝胶中的蛋白质进行染色。泳道M，分子量标记蛋白/2，峰1/3，峰2/4，峰3/5，峰4/6，峰4a/7，峰5/8，峰6/9，峰7/10，峰8/11，1×PEG-IFN标准物/12，1.5×PEG-IFN标准物/C1，IFN标准物。
图4使用大小排阻(SE-)HPLC测定不同IEC级分中的寡聚PEG-IFN形式和聚集物的量。使用TosoHaas TSK凝胶G 4000SWXL柱进行SE-HPLC(7.8×300mm)。
图5利用MALDI-TOF分光光度法测定每个异构体的分子量，以确保PEG-IFN分子在经过IEC层析后仍然是完整的，并确认单聚乙二醇化。
图6PEG-IFN参考标准物和峰1、2、3、4、4a、5、6、7、8的MALDI-TOFC端赖氨酸肽图。用箭头标出了和标准物相比缺失的峰。
图7PEG-IFN参考和峰4a的C端赖氨酸消化物的RP-HPLC色谱图。
图8使用装有如实施例1B所述的SP-NPR、TosoH Bioscience、粒子大小2.5μm、无孔的柱对5-10μg的PEG-IFN α-2a的位置异构体混合物进行的HPLC分析图。
图9显示聚乙二醇化位点的干扰素α-2a的带状结构。这是用NMR光谱法(参见J.Mol.Biol，1997，274，661-675测定的人的干扰素α-2a的高分辨率结构。聚乙二醇化的干扰素α-2a的聚乙二醇化位点涂成红色，并标注出残基类型和残基数。
权利要求
1.聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体，所述聚乙二醇化的干扰素α-2a选自在赖氨酸(31)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(31))，在赖氨酸(49)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(49))，在赖氨酸(70)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(70))，在赖氨酸(83)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(83))，在赖氨酸(112)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(112))，在赖氨酸(121)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(121))，在赖氨酸(131)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(131))，在赖氨酸(134)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(134))和在赖氨酸(164)处聚乙二醇化的干扰素α-2a(PEG-Lys(164))。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体，其选自PEG-Lys(31)，PEG-Lys(134)。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体，其特征在于所述聚乙二醇化的干扰素中聚乙二醇部分(PEG部分)的平均分子量为约26,000道尔顿—约66,000道尔顿，特别是约40000道尔顿。
4.一种分离聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体的方法，其特征在于所述聚乙二醇化的干扰素是a)在弱阳离子交换基质的制备型液相层析柱上分离成其位置异构体；及b)在强阳离子交换基质的制备柱上进一步分离和纯化级分。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于层析步骤a)是通过施加约pH3.8-pH8.0的线性pH梯度的增加的醋酸钠浓度进行的。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于层析步骤b)是使用从最初pH4.2-约4.6起始至约pH6.4-约6.8的最终pH的线性梯度的醋酸纳缓冲液(A)至磷酸钾缓冲液(B)进行，所述的缓冲液另外包含高达12％的乙醇和1.5％的二甘醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于层析步骤是在约27℃-约35℃，优选在约30℃-32℃的温度下进行。
8.药物组合物，其包含根据权利要求1-3的任一项所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体和治疗惰性载体。
9.用于治疗或预防免疫调节紊乱如肿瘤疾病或传染病的药物组合物，其包含根据权利要求1-3的任一项所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体和治疗惰性载体。
10.根据权利要求1-3的任一项所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体在制备用于治疗或预防疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求1-3的任一项所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体在制备用于治疗病毒性疾病的药物中的应用。
12.一种治疗或预防免疫调节疾病的方法，其包含给药根据权利要求1-3的任一项所述的聚乙二醇化的干扰素α-2a的位置异构体。
全文摘要
本发明涉及单聚乙二醇化的干扰素α－2a的位置异构体，分离其的方法及其在制备用于治疗疾病，特别是治疗病毒性疾病的药物中的应用。
文档编号C07K14/435GK1711109SQ200380103341
公开日2005年12月21日 申请日期2003年11月10日 优先权日2002年11月15日
发明者多丽丝·布鲁格, 斯特凡·福斯尔, 艾尔弗雷德·沙赫尔, 卡尔·韦耶 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司