专利名称：抗人4－1bb(cd137)的完全人抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及完全人抗体，具体涉及人4-1BB(CD137)的完全(fully)人抗体。
背景技术：
多种证据明确证明，一定程度的抗癌免疫反应存在人和动物中。癌症患者中，免疫系统的细胞组分能识别肿瘤细胞表达的抗原，诸如癌胚抗原的分化或突变的基因产物(S.Rosenberg，Nature，411380-4(2001)；P.van derBruggen等，Immunological Rev.，18851-64(2002))。多种临床研究显示肿瘤浸润性淋巴细胞的具有有利的预后意义(E.Halapi，Med.Oncol.，15(4)203-11(1998)；Y.Naito等，Cancer Res.，58(16)3491-4(1998)；L.Zhang等，N.E.J.Med.，348(3)203-13(2003))。此外，利用免疫调节剂诸如细胞因子或细菌产物，癌症疫苗或获得性免疫治疗的疗法可导致肿瘤在许多患者中的退变(S.Rosenberg，Cancer J.Sci.Am.6(S)2(2000)；P.Bassi，Surg.Oncol.，11(1-2)77-83(2002)；S.Antonia等，Current Opinion in Immunol.，16130-6(2004))。尽管存在这些反应，针对癌症的免疫力经常不能有效消除肿瘤细胞。导致所述失败的原因可分为三组主要类型(i)免疫细胞的肿瘤识别受损，由肿瘤抗原的可变表达或I类主要组织相容性复合体(MHC)的表达降低所导致；(ii)免疫抑制性肿瘤微环境，作为肿瘤细胞分泌抑制性细胞因子的结果(例如，TGF-β)；和(iii)由于缺乏共刺激分子在肿瘤细胞上的表达而产生的肿瘤免疫原性差，其导致肿瘤细胞不能有效刺激T细胞。我们对于肿瘤抗原识别和免疫效应物功能的需要的理解的进展表明用于增强抗肿瘤免疫反应的可能的策略是通过辅助分子提供共刺激。肿瘤抗原特异性T细胞需要共刺激以启动和保持效应物功能。因此，靶向共刺激分子的疗法可用于调节和增强对肿瘤的免疫反应。
目前T细胞活化的模型假定初始T细胞需要两种信号以充分活化(i)经加工的抗原的结合提供的信号，其通过主要组织相容性复合体(MHC)I类分子呈递给T细胞受体；和(ii)T细胞表面的共刺激分子与抗原呈递细胞上的其配体的相互作用提供的其它信号。通过初始T细胞识别抗原本身对于激发T细胞活化而言是不足的。没有共刺激信号，T细胞可通过死亡或诱导无活性来消除。通过CD28共刺激分子的信号似乎是T细胞反应启动的关键。然而，CD137(4-1BB)信号显示对于保持和扩大对抗原的免疫反应，以及对于产生记忆T细胞是重要的。
CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)基因家族的成员，其包括参与调节细胞增殖、分化和程序性细胞死亡的蛋白。CD137是30kDa的I型膜糖蛋白，其作为55kDa的同源二聚体表达。所述受体首先在小鼠中描述(B.Kwon等，P.N.A.S.USA，861963-7(1989))，随后在人中鉴定(M.Alderson等，Eur.J.Immunol.，242219-27(1994)；Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995))(也参见公开的PCT出版物WO95/07984和WO96/29348，和美国专利6,569,997,包含在本文作为参考(见，SEQ ID NO2.))。人和小鼠形式的CD137在氨基酸水平有60％的同一性。保守的序列存在细胞质结构域以及分子的5个其它区域中，表明这些残基对于CD137分子的功能而言可能是重要的(Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995))。CD137的表达主要在淋巴细胞系诸如活化的T-细胞，活化的天然杀伤(NK)细胞，NKT-细胞，CD4CD25调节T-细胞上，也在活化的胸腺细胞以及皮内淋巴细胞上。此外，CD137也在骨髓源性细胞诸如树突细胞，单核细胞，中性粒细胞，以及嗜酸性细胞上表达。尽管CD137表达主要限制在免疫/炎性细胞，有报道描述其在与少数来自炎性位点和肿瘤的组织相关的内皮细胞上表达。
T细胞上的CD137的功能活性已经充分表征。通过CD137在存在亚最佳剂量的抗CD3抗体下的信号已经显示诱导T细胞增殖和细胞因子合成(主要是IFN-γ)，并抑制活化的细胞死亡。这些效应已经利用小鼠和人T-细胞观察到(W.Shuford等，J.Exp.Med.，186(1)47-55(1997)；D.Vinay等，Semin.Immunol.，10(6)481-9(1998)；D.Laderach等，Int.Immunol.，14(10)1155-67(2002))。在人和小鼠中，共刺激改进效应物功能，诸如IFN-γ生成和细胞毒，者通过提高抗原特异性和效应CD8+T-细胞的数量来实现。在缺乏抗-CD3信号的情况下，通过CD137的刺激不改变T细胞功能，表明CD137是共刺激分子。
CD137刺激T细胞以后的观察到的生理事件是由具有不同生理功能的NF-κB和PI3K/ERK1/2信号介导的。NF-κB信号激发Bcl-XL这种抗凋亡分子的表达，由此导致存活率提高，而PI3K和ERK1/2信号具体负责CD137-介导的细胞周期进展(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。CD137活化对活化诱导的细胞死亡的抑制作用在体外通过Hurtado等(J.Hurtado等，J.Immunol.，158(6)2600-9(1997))显示，并且也在体内系统中，其中抗CD137单克隆(mab)显示通过防止克隆缺失产生超抗原活化的CD8+T-细胞的长期存活(C.Takahashi等，J.Immunol.，1625037(1999))。随后，两个报告显示，在不同试验条件下，CD137信号调节CD8+T-细胞的克隆扩增和存活(D.Cooper等，Eur.J.Immunol.，32(2)521-9(2002)；M.Maus等，Nat.Biotechnol.，20143(2002))。共刺激后观察到降低的凋亡与CD8+T-细胞中增加的Bcl-XL水平相关，而Bcl-2表达不变。抗凋亡基因Bcl-xL和bfl-1经由4-1BB上调显示由NF-κB活化介导，这是由于PDTC这种NF-κB-特异性阻断物抑制4-1BB-介导的Bcl-xL上调(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。另一方面，活化的T细胞的克隆扩增显示由细胞周期蛋白D2，D3，和E的表达增加以及p27kip1蛋白的下调介导。该效果以IL-2依赖的和非依赖的方式出现(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。
总而言之，CD137刺激导致新激发的CD8+T-细胞扩增、存活和效应功能增强，部分直接作用于这些细胞。CD4+和CD8+T-细胞已经显示对CD137刺激反应，但显示T细胞功能的增强在CD8+细胞中更高(W.Shuford等，J.Exp.Med.，186(1)47-55(1997)；I.Gramaglia等，Eur.J.Immunol.，30(2)392-402(2000)；C.Takahashi等，J.Immunol.，1625037(1999))。基于CD137刺激在CD8+T-细胞功能和存活的重要作用，CD137/CD137L系统的操作提供治疗肿瘤和病毒抗原的似乎合理的方法。
最近，CD137在新鲜分离的树突细胞(DC)上的构成型表达在小鼠(R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002)；T.Futagawa等，Int.Immunol.，14(3)275-86(2002))和人(S.Pauly等，J.Leukoc.Biol.72(1)35-42(2002))中证实。这些报道显示刺激DC上的CD137导致IL-6和IL-12的分泌，并且更重要的是，其增强了DC刺激T细胞对同种异体抗原发生反应的能力。此外，Pan等证实DC中的CD137信号导致MHC I类分子和共刺激分子上调，并使得DC浸润肿瘤的能力增强(P.Pan等，J.Immunol.，172(8)4779-89(2004))。因此，DC上的CD137共刺激似乎是DC增殖、成熟和迁移的新途径。
活化的天然杀伤(NK)细胞在用细胞因子刺激后表达CD137(I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002))。数篇报道证实NK细胞对于由激动性CD137抗体诱导的抗肿瘤自身免疫而言是重要的((I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；R.Miller等，J.Immunol.，169(4)1792-800(2002)；R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002))。NK细胞的耗竭明显降低抗-CD137 mabs的抗肿瘤活性。CD137在NK细胞上的连接诱导增殖和IFN-γ分泌，但不影响它们的细胞溶解活性。明显地，在体外，CD137刺激的NK细胞表现对于CD8+细胞溶解型T-细胞的免疫调节或“辅助物”活性导致活化的T-细胞的扩增。因此，NK细胞上的CD137信号可调节对肿瘤的内在免疫力。
对于CD137刺激描述了可能的效果，其中激动性CD137抗体可在灵长类中和小鼠模型中诱导对T细胞抗原的体液反应的抑制(H.Hong等，J.Immunother.，23(6)613-21(2000)；R.Mittler等，J.Exp.Med.，190(10)1535-40(1999))。明显地，CD137激动性抗体显示导致与抗体依赖性自身免疫疾病诸如系统性红斑狼疮和试验性自身免疫性脑脊膜炎相关症状的明显缓解(J.Foell等，N.Y.Acad.Sci.，987230-5(2003)；Y.Sun等，Nat.Med.，8(12)1405-13(2002))。最近，Seo等证实，在类风湿性关节炎的小鼠模型中，利用激动性抗-CD137抗体的治疗防止了疾病的发生，并明显阻断了疾病的进展(S.K.Seo等，Nat.Med.10；1099-94(2004))。导致该效果的机制没有很好确定，但在类风湿性关节炎模型中，显示利用CD137激动性抗体的治疗导致产生IFN-γ的CD11C-CD8+T细胞的扩增。IFN-γ反过来刺激树突细胞产生吲哚胺(indolamine)-2，3-双加氧酶(IDO)，其显示免疫抑制活性。已经推定抗原-活化的CD4+T-细胞上的CD137信号导致IFN-γ分泌的诱导，其活化巨噬细胞。活化的巨噬细胞可反过来产生B细胞死亡信号。通过CD4+T-细胞上的CD137的连续信号可随后诱导这些CD4+活化的T-细胞的活化诱导的细胞死亡。因此，通过消除抗原活化的T-细胞和B细胞，观察到降低的抗体反应，由此观察到Th2-介导的炎性疾病明显减轻(B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002))。这些研究提示利用激动性CD137抗体治疗炎症或自身免疫病的用途，而无需诱导对免疫系统的全面抑制。
CD137的天然配体，CD137配体(CD137L)，TNF超家族的34kDa糖蛋白成员，主要在活化的抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞，巨噬细胞，树突细胞上检出，并且也在鼠B-细胞淋巴瘤，活化的T-细胞，和人上皮来源的癌细胞系中检出(R.Goodwin等，Eur.J.Immunol.，23(10)2631-41(1993)；Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995)；H.Salih等，J.Immunol.，165(5)2903-10(2000))。人CD137L与其鼠对应物共享36％同源性(M.Alderson等，Eur.J.Immunol.，242219-27(1994))。
除了将信号递送给CD-137-表达型细胞，CD137与CD137L的结合启动双向信号，导致对CD137L-表达型细胞的功能效应。Langstein等证实CD137-Ig融合蛋白与活化的单核细胞上的CD137L的结合诱导IL-6，IL-8，和TNF-α的产生，上调ICAM，并抑制IL-10，导致粘附增加(J.Langstein等，J.Immunol.，160(5)2488-94(1998))。此外，单核细胞的增殖显示伴随高比例的凋亡(J.Langstein等，J.Leukoc.Biol.，65(6)829-33(1999))。这些观察通过Ju等(S.Ju等，Hybrid Hybridomics，22(5)333-8(2003))的研究证实，其显示功能性抗-CD137L抗体诱导外周血单核细胞的高速率增殖。阻断所述配体导致T细胞活化的抑制。此外，可溶性CD137L见于类风湿性关节炎以及血液恶性疾病患者的血清中(H.Salih等，J.Immunol.，167(7)4059-66(2001))。由此，CD137与CD137L的相互作用影响并导致对T-细胞和APC的功能效果。
T细胞功能的另一重要方面中，证实激动性抗-CD137抗体拯救(rescue)了对老年小鼠中的蛋白抗原的T细胞反应。关于对抗原的免疫反应的年龄相关性出现减少在很多文献中有记载，这是已知为免疫衰老的过程(R.Miller，Science，27370-4(1996)；R.Miller，Vaccine，181654-60(2000)；F.Hakim等，Curr.Opinion Immunol.，16151-156(2004))。这种现象是由于细胞扩增和细胞存活或死亡的程度之间的平衡改变导致的。Bansal-Pakala等检测了该假设，次级共刺激通过CD137可用于在由于CD3或CD28的表达降低，或信号的质量降低造成的T-细胞未接受足够的刺激的情况下增强T-细胞反应。他们的研究表明与年轻小鼠相比，老年小鼠缺乏体外回忆反应(P.Bansal-Pakala等，J.Immunol.，169(9)5005-9(2002))。但是，用抗-CD137 mab处理的老年小鼠中，T细胞的增殖和细胞因子反应与在年轻小鼠中观察到的情况相同。虽然导致这一效应的具体机制不明，认为抗凋亡分子例如Bcl-XL的表达增强以及促进IL-2的体内分泌在拯救缺陷T细胞反应中起作用。这些研究证实了激动性抗CD137抗体拯救老年免疫受损的个体中的弱的T细胞反应的可能性，并且对于抗CD137抗体在癌症患者中的应用有意义深远的启示。
CD137靶向疗法在癌症治疗中的作用通过利用激动性抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内效力研究表明。在Melero等的文献中，激动性抗-小鼠CD137抗体在P815肥大细胞瘤(mastocytoma)以及低免疫原性肿瘤模型Ag104中导致治愈(I.Melero等，Nat.Med.，3(6)682-5(1997))中抗-肿瘤效果需要CD4+、CD8+T-细胞和NK细胞，这是由于每种亚群的选择性体内耗竭导致抗肿瘤效应的减少或完全缺失。多个研究者使用抗CD137抗体证实该方法对于癌症治疗的有效性(J.Kim等，Cancer Res.，61(5)2031-7(2001)；O.Martinet等，Gene Ther.，9(12)786-92(2002)；R.Miller等，J.Immunol.，169(4)1792-800(2002)；R.Wilcox等，Cancer Res.，62(15)4413-8(2002))。
为支持激动性CD137抗体的抗肿瘤效力数据，CD137L提供的信号显示激发CTL活性和抗肿瘤反应(M.DeBenedette等，J.Immunol.，163(9)4833-41(1999)；B.Guinn等，J.Immunol.，162(8)5003-10(1999))。数个报道证实CD137配体向小鼠肉瘤中的基因转移导致肿瘤排斥，证实了需要共刺激来产生有效的免疫反应(S.Mogi等，Immunology，101(4)541-7(2000)；I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；B.Guinn等，J.Immunol.，162(8)5003-10(1999)).Salih等报道了CD137L在人癌症和人癌细胞系中的表达(H.Salih等，J.Immunol.，165(5)2903-10(2000))，并证实了表达所述配体的肿瘤细胞能够向T细胞递送刺激信号，导致释放IFN-γ和IL-2，该效应与肿瘤上CD137L的水平有关。在人肿瘤中表达CD137L是否可使得这些肿瘤对于激动性CD137抗体更为敏感是未知的。
CD137L-/-小鼠已经降低了CD137/CD137L系统在T细胞对病毒和肿瘤反应中的重要性(M.DeBenedette等，J.Immunol.，163(9)4833-41(1999)；J.Tan等，J.Immunol.，164(5)2320-5(2000)；B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002))。利用CD137-和CD137L-缺陷小鼠的研究证实了CD137共刺激在移植物对宿主疾病，抗病毒溶细胞T细胞反应中的重要性。CD137缺陷小鼠中T细胞的增殖增强，但细胞因子产生和毒性T细胞活性降低(B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002)；D.Vinay等，Immunol.Cell Biol.，81(3)176-84(2003))。最近，显示敲除小鼠(CD137-/-)的肿瘤转移与对照小鼠相比频率更高(4-倍)。这些数据提示利用激动性抗-CD137抗体恢复CD137信号是增强对病毒抗原和癌症的细胞免疫反应的可行方法。
除了小鼠体内模型中的数据(其支持CD137信号在抗肿瘤免疫反应中的参与)，在原代人肿瘤样品中进行的研究证实了CD137在产生效应T细胞中的作用。在尤文肉瘤(Ewing sarcoma)的患者中，Zhang等显示肿瘤内效应T-细胞呈现CD3+/CD8+/CD28-/CD137+表型。出人意料地，观察到进展性肿瘤生长和抗肿瘤免疫(效应T细胞)的共存在。离体刺激研究利用患者的细胞证实肿瘤诱导的T细胞增殖且活化需要利用CD137L的共刺激。利用抗-CD3/CD137L，而非抗-CD3/抗-CD28刺激PBL导致溶肿瘤效应物。这些研究提供进一步证据，CD137介导的共刺激可导致肿瘤反应性CTL的扩增(H.Zhang等，癌症Biol.Ther.，2(5)579-86(2003))。此外，CD137的表达证实肝细胞癌(HCC)中的肿瘤浸润淋巴细胞(Y.Wan等，World J.Gastroenterol，10(2)195-9(2004))。通过RT-PCR在HCC中CD137表达的检出率是19/19，通过免疫荧光染色的检出率是13/19。反之，CD137在相同患者的外周单核细胞中没有检出。这些研究没有意图将临床疾病与CD137表达相关。因此，在尤文肉瘤中和肝细胞癌进行的研究显示表达CD137的TIL的存在，伴随疾病进展。在尤文肉瘤中，证实CD137+TIL能杀死离体肿瘤细胞，提示CD137途径在这些患者中完整，并且在肿瘤微环境中可能的抑制性因子抑制它们的功能。因此，可推定激动性CD137抗体的系统给药可提供扩增这些效应T细胞必需的信号。
除了其在癌症免疫力进展中的作用，试验数据支持了利用CD137激动性抗体治疗自身免疫和病毒疾病中的用途(B.Kwon等，Exp.Mol.Med.，35(1)8-16(2003)；H.Salih等，J.Immunol.，167(7)4059-66(2001)；E.Kwon等，P.N.A.S.USA，9615074-79(1999)；J.Foell等，N.Y.Acad.Sci.，987230-5(2003)；Y.Sun等，Nat.Med.，8(12)1405-13(2002)S.K.Seo et al，Nat.Med.10；1099-94(2004))。
因此，基于4-1BB在调节免疫反应中的作用，需要产生具有激动活性的抗-人4-1BB抗体，其可用于治疗或预防人疾病诸如癌症，感染疾病，和自身免疫病。
发明简述本发明提供完全人抗体，其结合人4-1BB(H4-1BB)并允许H4-1BB结合人4-1BB配体(H4-1BBL)。因此本发明涉及结合H4-1BB并不阻断H4-1BB与H4-1BBL结合的抗体，由此允许本发明的抗体以及H4-1BBL与H4-1BB的结合。本发明还提供具有激动性活性的抗体，其中抗体与H4-1BB的结合导致H4-1BBL介导的免疫反应的增强和刺激。这些抗体可用作免疫增强物抗肿瘤或抗病毒免疫反应的免疫增强物，或T细胞介导的自身免疫病的免疫调节物。所述抗体也可用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其它疾病的患者的血液或组织中的H4-1BB。
一方面，本发明提供单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合H4-1BB，包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含如图4所示的CDR1(互补决定区1)，CDR2(互补决定区2)，和CDR3(互补决定区3)，重链可变区包含如图3或图7所示的CDR1(互补决定区1)，CDR2(互补决定区2)，和CDR3(互补决定区3)。单克隆抗体(mab)可为，例如，IgG4抗体或IgG1抗体。
另一方面，本发明提供单克隆抗体或其抗原结合部分，其中轻链包含如图4所示的可变区，重链包含如图3或图7所示的可变区。
另一方面，本发明提供单克隆抗体，其包含轻链和重链，其中轻链包含SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236，重链包含SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467。另一方面，本发明提供单克隆抗体，其包含轻链和重链，其中轻链包含SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236，重链包含SEQ ID NO9的氨基酸残基20-470。
本发明的抗体作为疾病的免疫调节物具有广泛的治疗用途，所述疾病诸如癌症，自身免疫病，炎性疾病，和感染疾病。
本发明还提供治疗受试者中的癌症的方法，包括给药受试者治疗有效量的本发明的抗体。一方面，该方法还包含给药疫苗。适宜疫苗包括，例如，肿瘤细胞疫苗，DNA疫苗，GM-CSF-修饰的肿瘤细胞疫苗，或加载抗原的树突细胞疫苗。所述癌症可为，例如，前列腺癌，黑素瘤，或上皮癌。
另一方面，本发明提供用于增强免疫反应的方法，包含给药本发明的抗体和SIV gag疫苗。另一方面，本发明提供用于增强免疫反应的方法，包含给药本发明的抗体和PSA疫苗。另一方面，本发明提供用于增强对SIV gag疫苗的免疫反应的方法，包含给药本发明的抗体。另一方面，本发明提供用于增强对PSA疫苗的免疫反应的方法，包含给药本发明的抗体。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的抗体，或其抗原结合部分，和可药用载体。所述药物组合物可单独或与其它药剂联用给药，例如，治疗癌症的药剂诸如化疗剂或疫苗或其它免疫调节剂。
本发明还提供分离的多核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列(a)核苷酸，其编码氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467；(b)核苷酸，其编码氨基酸序列SEQ ID NO3；(c)核苷酸，其编码氨基酸序列SEQ IDNO6的氨基酸残基21-236；(d)核苷酸其编码氨基酸序列SEQ ID NO6；(e)核苷酸，其编码氨基酸序列SEQ ID NO9的氨基酸残基20-470；(f)核苷酸其编码氨基酸序列SEQ ID NO9；和(g)核苷酸，其编码氨基酸序列(a)-(f)的片段，诸如可变区，恒定区，或一或多个CDR。本发明分离的多核苷酸还包括编码图3的至少一个CDR，图4的至少一个CDR，或图7的至少一个CDR的核苷酸序列。本发明提供分离的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQID NO1，SEQ ID NO4,或SEQ ID NO7。
本发明还提供分离的多肽，包含选自SEQ ID NO3，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO9组成的组的氨基酸序列。另一方面，本发明提供分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467，分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236，分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO9的氨基酸残基20-470。另一方面，本发明提供分离的多肽，其包含图3，图4，或图7的至少一个CDR的氨基酸序列，或图3，图4，或图7的至少可变或恒定区。
本发明还包括免疫球蛋白，其具有结合特异性H4-1BB，所述免疫球蛋白包含抗原结合区。一个方面中，所述免疫球蛋白是本发明的抗体的Fab或F(ab’)2。
本发明还包括产生本发明的抗体或其抗原结合部分的细胞系，包括本发明的核苷酸的重组表达载体，以及通过培养产生抗体的细胞系产生本发明的抗体的方法。
附图简述
图1显示pD17-20H4.9.h4a的质粒图。
图2显示pD16gate-20H4.9.LC的质粒图。
图3(图3A-3H)显示质粒pD17-20H4.9.h4a的核苷酸序列，包括编码链(SEQ ID NO1)，互补链(SEQ ID NO2)，和所述编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO3的氨基酸残基1-19；重链是SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467)。
图4(图4A-4F)显示质粒pD16gate-20H4.9.LC的核苷酸序列，包括编码链(SEQ ID NO4)，互补链(SEQ ID NO5)，和所述编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO6的氨基酸残基1-20；轻链是SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236)。
图5显示20H4.9-IgG1重链序列构建体的示意图。
图6显示20H4.9轻链序列构建体的示意图。
图7(图7A-7D)显示20H4.9-IgG1重链构建体的核苷酸序列和氨基酸序列，包括编码链(SEQ ID NO7)，互补链(SEQ ID NO8)，和所述编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO9的氨基酸残基1-19；重链是SEQ IDNO9的氨基酸残基20-470)。
图8(图8A-8B)图示获自mab 20H4.9-IgG1与人CD137的结合的ELISA结果(图8A)和mab 20H4.9-IgG1对CD137-CD137L相互作用的影响(图8B)。
图9(图9A-9B)图示获自mab 20H4.9-IgG1与PMA-伊屋诺霉(ionomycin)素刺激的人或猕猴(cynomolgus monkey)细胞的结合的结果。人CEM(图9A)或猴PBMC(图9B)与20H4.9-IgG1或人CD137L融合蛋白一起保温。
图10(图10A-10B)图示利用抗-CD137抗体在共刺激研究中诱导IFN-γ所得的结果，其表示为相对于对照的pg/ml增加倍数。由于供者的背景反应各异，数据相对于对照处理(＝1)标准化。用单独的抗-CD3刺激从人T-细胞(图10A)或猴PBMC(图10B)的中值IFN-γ基线水平分别为592pg/ml和505pg/ml。
图11提供mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1与人CD137结合的胞质团共振绘图。
图12图示20H4.9-IgG4与PMA伊屋诺霉素刺激的人CEM细胞的浓度依赖性结合，但不结合未经刺激的CEM细胞。
图13(图13A-B)图示利用抗-CD137抗体的共刺激研究中对IFN-γ的诱导。结果表示为相对于对照的pg/ml增加倍数。由于由于供者的背景反应各异，数据相对于对照处理(＝1)标准化。用单独的抗-CD3刺激的人T-细胞(图13A)或猴PBMC(图13B)的中值IFN-γ基线水平分别为592pg/ml和505pg/ml。
图14(图14A-14B)图示通过mab 20H4.9-IgG4对IFN-γ合成的剂量依赖型增强的结果(图14A)，以及加入交联型抗-人IgG抗体(7μg/ml)的抗体交联的效果(图14B)。
图15图示mab 20H4.9-IgG4对T-细胞存活和细胞周期进展的影响。人T-细胞用抗-CD3(1ug/ml)±mab 20H4.9-IgG4在所列浓度进行共刺激。试验开始6天后，收集细胞并用膜联蛋白-V和碘化丙啶染色以确定存活细胞数(Annexin V/PI阴性)，或用PE-偶联的细胞周期蛋白D2以染色检测处于周期中的细胞。结果表示平行检测的mab 20H4.9-IgG4的4个组的平均值(±SD)。
图16(图16A-16D)显示利用DNA疫苗±抗-人4-1BB抗体处理之后，猕猴中抗原特异性IFN-γ反应，如利用ELISPOT测定的那样。动物用SIV gag疫苗(第0，28，56天；图16A)，SIV gag疫苗(第0，28，56天)和mab20H4.9-IgG4(第12，15和19天；图16B)，或SIV gag疫苗(第0，28，56天)和hu39E3.G4(第12，15和19天；图16C)处理。一组动物未经处理(图16D)。处理后各个时间，收集血液，分离PBMC并评估它们在抗原刺激存在下分泌IFN-γ的能力。
发明详述本发明涉及抗体及其抗原结合片段的制备和定性(包括融合蛋白包含本发明抗体的抗原结合片段)，其用于治疗疾病诸如癌症，感染性疾病，炎性疾病或自身免疫病。所述癌症可为例如，前列腺癌，黑素瘤，或上皮癌。
所述抗体能结合H4-1BB，并可对H4-1BB表现高亲和力以及有效增强T细胞反应。一方面，所述抗体诱导共刺激测定法中IFN-γ的生成，但是不影响H4-1BB与其相应配体H4-1BBL的结合，且不固定补体。
本发明的抗体可通过本领域已知的方法制备。一方面，所述抗体可通过在转染的细胞诸如永生化的真核细胞诸如骨髓瘤或杂交瘤细胞中表达来制备本发明的抗体可单独使用，或与其他治疗剂诸如放射治疗(包括辐照)，激素治疗，细胞毒剂，疫苗，以及其它免疫调节剂，诸如细胞因子和生物反应修饰物一起使用。这些药剂具体可用于治疗癌症和免疫增殖性疾病。
一方面，本发明提供单克隆抗体(mab)20H4.9-IgG4。图1和2分别提供pD17-20H4.9.h4a和pD16gate-20H4.9.LC的质粒图，所述质粒可用于制备mab 20H4.9-IgG4。图3(图3A-3H)提供质粒pD17-20H4.9.h4a的核苷酸序列，包括编码链(SEQ ID NO1)，互补链(SEQ ID NO2)，和所述编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO3的氨基酸残基1-19；重链是SEQ IDNO3的氨基酸残基20-467)。图4(图4A-4F)显示质粒pD16gate-20H4.9.LC的核苷酸序列，包括编码链(SEQ ID NO4)，互补链(SEQ ID NO5)，和所述编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO6的氨基酸残基1-20；轻链是SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236)。
另一方面，本发明提供单克隆抗体(mab)20H4.9-IgG1。图5图示了mab20H4.9-IgG1的重链序列构建体。图6图示了mab 20H4.9的轻链序列构建体，用于mab 20H4.9-IgG4和20H4.9-IgG1。图7提供图5的重链序列构建体的核苷酸序列(编码链(SEQ ID NO7)和互补链(SEQ ID NO8))，以及编码链编码的氨基酸序列(前导肽是SEQ ID NO9的氨基酸残基1-19；重链是SEQ ID NO9的氨基酸残基20-470)。mab 20H4.9-IgG1的轻链与mab20H4.9-IgG4的轻链相同。
本发明还包括具有来自SEQ ID NOS3，6，和9所示重链和轻链氨基酸序列的保守氨基酸取代的抗体，其基本上对H4-1BB结合没有影响。保守取代通常包括一种氨基酸对另一种性质相似的氨基酸的取代，例如下组中的取代缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
编码本发明多肽的多核苷酸通常还包括表达控制序列，其可操作连接于多肽编码序列，包括天然连接的和异源启动子区。优选，所述表达控制序列将为载体中的真核启动子系统，其能转化或转染真核宿主细胞，但用于真核宿主的控制序列也可使用。一旦载体被掺入适宜宿主，宿主在适于高水平表达所述核苷酸序列的条件下保持，如所需那样，然后可收集并纯化轻链，重链，轻/重链二聚体或完整抗体，结合片段或其它免疫球蛋白形式。(见，S.Beychok，Cells of Immunoglobin Synthesis，Academic Press，N.Y.(1979))。单链抗体或微型抗体(融合于一或多个CH结构域的单链抗体)也可通过将本发明公开的编码VL和VH区的核酸序列与编码多肽接头的DNA相连来制备。
原核宿主诸如大肠杆菌以及其它微生物诸如酵母可用于表达本发明的抗体。除了生物体，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达并制备本发明的抗体。真核细胞是优选的，因为能分泌完整免疫球蛋白的多种适宜宿主细胞系已经被开发，包括，例如，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系，COS(非洲绿猴纤维母细胞细胞系)细胞系，HeLa细胞，骨髓瘤细胞系，和杂交瘤。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如启动子或增强子和必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸位点，和转录终止序列，所有均为本领域已知的。
含有目的DNA片段的载体(例如，重链和/或轻链编码序列和表达控制序列)可通过已知方法转入宿主细胞，其有赖于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染常用于真核细胞，而磷酸钙处理，脂质转染或电穿孔可用于其它细胞宿主。(见，例如，T.Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1982))。
一旦表达，抗体，它们的二聚体，单个轻和重链，或其它免疫球蛋白形式，可根据本领域标准方法纯化，诸如硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等。均质度至少90-95％的基本纯的免疫球蛋白是所需的，均质度98-99％或更高的是更合意的。
本发明的抗体可用于调节T细胞和抗体介导的免疫反应。通常适于治疗的疾病状态包括癌症，感染疾病，炎性疾病，和自身免疫病诸如多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和重症肌无力。
本发明还提供药物组合物包含本发明的至少一种抗体和可药用载体.所述药物组合物可通过本领域已知常规灭菌技术灭菌。所述药物组合物也可含有可药用辅助物质，这是适宜生理条件所需的，诸如pH调节和缓冲剂，稳定性提高剂诸如甘露醇或吐温(tween)80，毒性调节剂等，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙或人血清白蛋白。
本发明的抗体和药物组合物具体可用于胃肠外给药，包括经皮下，肌内和静脉内给药。胃肠外给药的药物组合物可包括溶于可接受载体优选水性载体的抗体溶液。多种水性载体可使用，均为本领域已知，例如水，缓冲的水，盐水，甘氨酸等。这些溶液是无菌的通常没有颗粒物质。尤其有利地是配制单位剂量形式的胃肠外组合物用于易化给药和试剂的均一性。
所述药物组合物可进一步包括其它药剂用于治疗疾病。一方面，所述药物组合物包括用于治疗癌症，感染性疾病，炎性疾病和自身免疫病的药剂。本发明的抗体也可共给药或与另一种用于治疗疾病的药剂分别给药。
本发明的抗体可与其它药剂一同给药以增强患者中对癌性细胞的免疫反应。一方面，所述抗体与免疫原性药剂，诸如癌性细胞，纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白，肽和碳水化合物分子)，或用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞和细胞表面抗原联用。另一方面，所述抗体与疫苗诸如肿瘤细胞疫苗，DNA疫苗，基因-修饰的肿瘤细胞疫苗，诸如GM-CSF-修饰的肿瘤细胞疫苗，肽疫苗，或加载抗原的树突细胞疫苗联用。
许多针对肿瘤进行接种的试验策略已经被研发。在这些策略之一当中，疫苗利用自体或同种异基因肿瘤细胞制备。这些细胞疫苗已经显示当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时最为有效。GM-CSF显示是肿瘤接种的抗原呈递的有效活化物(Dranoff等，P.N.A.S.，903539-43(1993)；E.Jafee等，J.Clin.Oncol.，19145-56(2001)；R.Salgia等，J.Clin.Oncol.，21624-30(2003))。
各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究导致定义所谓的肿瘤特异性抗原(S.Rosenberg，Immunity 10281-7(1999))。许多情况中，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤中和产生肿瘤的细胞中表达的不同抗原，例如黑色素细胞抗原gp 100，MAGE抗原，Trp-2。这些抗原中有许多是宿主中的肿瘤特异性T细胞的靶。本发明的抗体可与多种在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽联用以扩增并指导对这些抗原的Th1免疫反应。这些蛋白通常作为自体抗原通过免疫系统观察到并由此对其耐受。
本发明一方面，所述抗体与免疫调节剂包含SIV gag抗原(作为模型HIV DNA疫苗)或前列腺特异性抗原(PSA)，或包含编码SIV gag抗原或前列腺特异性抗原(PSA)的核苷酸序列的DNA疫苗联用。PSA疫苗描述于例如，M.Pavlenko等，Br.J.Cancer，91(4)688-94(2004)；J.Wolchok等，Semin.Oncol.，30(5)659-66(2003)；J.Kim等，Clin.Cancer Res.，7(3Suppl.)882s-889s(2001)。SIV gag疫描述于，例如，B.Makitalo等，J.Gen.Virol.，85(Pt8)2407-19(2004)；N.Letvin等，J.Virol.，78(14)7490-7(2004)；S.Mossman等，AIDS Res.Hum.Retroviruses.，20(4)425-34(2004)；F.Bertley等，J.Immunol.，172(6)3745-57(2004)；L.Patterson等，J.Virol.，78(5)2212-21(2004)；E.O′Neill等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，19(10)883-90(2003)；Z.Bu等，Virology，309(2)272-81(2003)。
肿瘤抗原可包括，例如蛋白端粒酶，其是合成染色体端粒酶所需的，并在超过85％的人癌症和仅仅有限数目的躯体组织中表达(N.Kim等，Science，266，2011-2013(1994))。肿瘤抗原也为癌细胞中表达的″neo-抗原″，其原因是改变蛋白序列和产生两种无关序列之间的融合蛋白的体细胞突变或来自B细胞肿瘤的独特型。其它肿瘤疫苗也可包括来自与人癌症有关的病毒的蛋白质，诸如人乳头瘤病毒(HPV)，肝炎病毒(HBV和HCV)，和卡波奇疱疹肉瘤病毒(Kaposi′s Herpes Sarcoma Virus)(KHSV)。可与本发明的抗体一起使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是分离自肿瘤组织本身的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白的片段且这些HSP可高效递送到抗原呈递细胞以激发肿瘤免疫(R.Suot等，Science 2691585-1588(1995)；Y.Tamura等，Science 278117-120(1997))。
本发明的抗体也可用于增强疫苗对病毒抗原的免疫反应，所述病毒抗原诸如HIV或HCV。本发明的抗体也可用于增强对其它免疫调节剂的免疫反应，以及激发记忆性免疫反应。这些药剂的实例是细胞因子诸如GM-CSF，IL-2，IL-15，IL-12，F13配体，CD40配体，佐剂诸如CpG-寡聚脱氧核糖核苷酸(细菌DNA)，或抗OX-40或CTLA-4抗体。
本发明的药物组合物可给药用于预防性和/或治病性治疗。在治病性应用中，所述药物组合物以足以治愈或至少部分阻滞或治疗疾病的量给予已经患有疾病的患者。适宜实现这一结果的量定义为“治疗有效量”。这种用途的有效量将有赖于疾病状态的严重度和患者(包括，例如，疾病自身免疫系统的总体状态)，并可通过本领域技术人员确定。具体的应用中，将所述药物组合物给予并非已经处于疾病状态中的患者，以增强患者对疾病状态的抵抗力。所述量定义为“预防有效量”。在这种用途中，精确的量有赖于患者的健康状态(包括，例如，患者自身免疫系统的总体状态)，并可由本领域技术人员确定。一方面，所述预防应用是用于防止肿瘤复发。
实施例实施例1抗体的制备材料和方法人CD137(4-1BB)受体的完全人单克隆抗体在HuMAb-Mouse中产生(Medarex，Inc.，Princeton，New Jersey)。HuMAb小鼠经腹腔(i.p.)和皮下(s.c.)用RIBI佐剂(Ribi Immunochemical)中的25μg人CD137细胞外结构域免疫5次。输注前，小鼠经静脉内(i.v.)用相同量的抗原强化。来自具有适当抗huCD137抗体滴度的经免疫小鼠的脾细胞根据标准方法融合于小鼠骨髓瘤细胞。
抗-人CD3 mab(可隆HIT3a)，用于人和猴IFN-γ的ELISA试剂盒，细胞测定法珠阵列(cytometric bead array)(CBA)试剂盒，和所有偶联用于流式细胞术的抗体购自BD Pharmingen(San Diego，California)。人IgG1和人IgG1κ购自Sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri)。CEM细胞(ATCC-CRL 2265)购自ATCC，培养基(RPMI)，胎牛血清(FBS)购自Mediatech Inc.(Herndon，Virginia)。绵羊红细胞Alsevers购自Colorado Serum Co.(Denver，Colorado)。
杂交瘤筛选通过ELISA检测与huCD137的结合为鉴定分泌抗-人CD137抗体的杂交瘤，用1μg/ml人CD137-小鼠IgG2b融合蛋白PBS溶液在4℃包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)过夜。该板随后用含有0.01％吐温-80(PBS-T)的PBS洗涤三次，然后用PBS-T加1％牛血清白蛋白(BSA)在室温封闭20min。将在PBS-T中稀释的50微升上清加入板在环境温度保温1-2小时。然后如前述洗涤板，抗体的结合通过与碱性磷酸酶偶联的山羊F(ab’)2抗-人IgG抗体(Jackson Laboratories，West Grove，Pennsylvania)保温检测。板用pNPP显色并在405nm读板。
封闭试验通过ELISA评估识别huCD137的26种分泌抗体的杂交瘤允许CD137-CD137L反应的能力。这些分析最初在ELISA模式中进行。板用人CD137-muIgG2b、0.2μg/ml，100μl/孔包被。将mab 20H4.9-IgG1，或对照抗体，在PBS-T中的连续稀释液以及1％牛血清白蛋白被加入板。将CD137L-CD8融合蛋白以浓度0.2μg/ml加入板。抗体的结合利用生物素化的抗-CD8抗体(0.2μg/ml，Ancell Corporation，Bayport，Minnesota)检测。洗涤数次后，加入链霉抗生物素-碱性磷酸酶(1∶2000)和pNPP用于检测结合的抗体，在405nm读板。
为证实所选抗体不改变CD137-CD137L结合，纯化的抗体随后通过BIAcore分析定性。所有试验均在BIAcore 3000装置(BIAcore Inc.，Piscataway，New Jersey)上进行。人CD137以高密度共价固定在BIAcore传感芯片(sensorchip)(BIAcore Inc.，Piscataway，New Jersey)的羧基-甲基化的葡聚糖表面。注射以2μg/mL在10mM乙酸盐缓冲液，pH 5.0中进行。未占据的活性酯随后通过诸如过量乙醇胺封闭。表面的再生利用10mM甘氨酸，pH 2.0进行。
纯化的抗-CD137抗体样品利用HEPES缓冲的盐水，pH 7.4稀释到浓度200-1000nM，所述盐水中补充了0.15M NaCl和0.005％表面活性剂P20(HBS-EP)。人CD137L-CD8融合蛋白(huCD137L)用作CD137配体的来源。进行试验，其中huCD137L在抗-CD137抗体之前注入或反之。注射可以流速5μL/min进行。结合的配体和抗体通过利用10mM甘氨酸缓冲液，pH 2.0再生来去除。
人T-细胞纯化T-细胞或PBMC获自健康人供体。血液收集在EDTA中，悬浮于淘洗缓冲液(RPMI，其中含有2.5mM EDTA，10μg/ml多粘菌素B)，下层是淋巴细胞分离介质(Lymphocyte Separation Medium)(LSM，Mediatech Inc.，Herndon，Virginia)，1800rpm离心25分钟。收集细胞界面，1500rpm离心10分钟。随后，将细胞碎片重悬于淘洗缓冲液并洗涤绵羊红细胞(SRBC，1∶10稀释度)，在冰上保温1小时。细胞随后置于LSM上，2500rpm离心25分钟。去除界面并用SRBC裂解缓冲液裂解SRBC。洗涤分离的T-细胞并重悬于10％FBS/RPMI中。
流式细胞分析抗-人CD137抗体与细胞上表达的CD137的结合通过流式细胞术测定。人T-细胞白血病细胞系(CEM)或猕猴外周血单核细胞(PBMC)用于这些研究。这些细胞不构成型表达CD137，但受体可通过用佛波醇肉豆蔻酸盐(酯)(PMA，10ng/ml)和伊屋诺霉素(1μM)刺激18hr来诱导。随后洗涤细胞并用各种浓度抗体在各种染色缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水，PBS，加1％FCS，和0.01％叠氮化钠)中保温。抗体与刺激的或未刺激的细胞的结合通过萤光素(FITC)或phycoerithrin(PE)偶联的山羊抗-人IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania)检测。为证买CD137的表达，使用CD137配体细胞外结构域和小鼠CD8组成的融合蛋白(AncellCorporation，Bayport，Minnesota)，然后与PE-偶联的抗-小鼠CD8(BDPharmingen，San Diego，California)保温。样品在1％福尔马林中固定，保存在4℃，通过流式细胞术读数。
功能测定法获自健康供体的原代人T-细胞或猴PBMC用未固定的抗-CD3抗体刺激以提供T细胞活化的第一信号，并用人抗-人CD137抗体共刺激。作为非特异性对照，人源化抗癌抗体(BR96)以相同的抗体浓度使用。板用抗-CD3抗体(0.5-1μg/ml)在4℃保温过夜。第二天，T-细胞或PBMC以1-1.5×105/孔的浓度铺板。37℃培养72小时后，IFN-γ的合成通过细胞计数珠阵列(CBA)或ELISA测定。
细胞因子测定ELISA在各个时间刺激T-细胞后，离心板并去除培养基。细胞因子水平通过ELISA根据生产商说明(BD Pharmingen，San Diego，California)检测。简而言之，加入受试样品和标准品到抗细胞因子包被的96孔板中。在环境温度保温2小时后，在PBS-T中洗板3次，然后首先与工作检测抗体保温然后加入底物。405nm读取吸光度，基于标准曲线计算浓度。
细胞计数珠测定法用于测定体外细胞因子生成的方法是流式细胞术，其利用BD Pharmingen的细胞珠阵列(CBA)。IFN-γ，IL-2，IL-5，IL-4，IL-10，和TNF-α水平在培养上清中根据生产商说明测定。结果在流式细胞术中利用CBA分析软件分析。
结果与人CD137结合的杂交瘤分泌型抗体进一步扩增并亚克隆。分泌的抗体被纯化并检测其结合huCD137和允许CD137-CD137L相互作用的能力。在评估的抗-人CD137抗体组中，选择mab 20H4.9-IgG1以基于其结合图谱和非结合性质进行进一步评估。20H4.9-IgG1抗体是IgG1 kappa，如通过ELISA利用碱性磷酸酶抗-人IgG1，2，3，4，和抗-kappa以及lambda试剂(Southern Biotech，Birmingham，Alabama)测定的。图8(图8A-ELISA测定的与人CD137的结合；图8B-mab 20H4.9-IgG1对CD137-CD137L相互作用的影响)提供对mab 20H4.9-IgG1的初步定性。评估mab 20H4.9-IgG1，26G6(阻断型抗-CD137抗体)，或破伤风类毒素(tetanus toxoid)(TT，阴性对照)的连续稀释物改变CD137与CD137L结合的能力。浓度达10μg/ml的Mab20H4.9-IgG1不阻断CD137L结合，而mab 26G6浓度＞0.37μg/ml时抑制结合。
也检测Mab 20H4.9-IgG1对人T细胞(CEM)上表达的CD137的反应性以及用PMA和伊屋诺霉素刺激的猕猴外周血单核细胞(PBMC)中对CD137的反应性。以前的研究测定，CD137在T-细胞上上调，然后用PMA和伊屋诺霉素活化。对照分子为无关人IgG抗体(阴性对照)或CD137L-CD8融合蛋白(阳性对照，BD Pharmingen，San Diego，California)组成的。这些研究的结果表明mab 20H4.9-IgG1结合活化的人CEM以及来自猕猴的PBMC，与未经刺激的细胞的结合最少。阳性细胞的类似百分比利用mab 20H4.9-IgG1或CD137L检出。图9提供所得结果证实mab 20H4.9-IgG1与PMA-伊屋诺霉素刺激的人或猕猴细胞的结合。人CEM(图9A)或猴PBMC(图9B)与20H4.9-IgG1或人CD137L融合蛋白保温。加入次级抗体并通过流式细胞术读取样品。
随后，测定mab 20H4.9-IgG1能否在共刺激测定法在存在抗-CD3刺激的条件下诱导IFN-γ增加，这是激动性CD137抗体所需的关键功能效应。在人和猴淋巴细胞的功能研究中评估Mab 20H4.9-IgG1的共刺激活性。基于初始数据，浓度20ug/ml的抗-CD137抗体(过量抗体)用于这些研究中。检测0.2-1μg/ml的抗-CD3抗体，其导致10-20％CD137-阳性淋巴细胞。上清中的IFN-γ浓度在培养72h后测定。如图10所示，mab 20H4.9-IgG1使人和猴共刺激试验中的IFN-γ合成增加到明显高于对照的水平。利用分离自8名健康人供者的T细胞的研究结果显示，在其中的6名中，mab 20H4.9-IgG1相对于对照提高IFN-γ合成2.2-4.3-倍。另外两名供者之一显示1.6-倍的增加。增加的水平超过利用hu39E3.G4 PCT申请WO04/010947(包含在本文作为参考)提供的这种人源化抗-CD137抗体观察到的结果，其显示在8名供者中的5名中，IFN-γ增加并水平低于利用mab 20H4.9-IgG1的情况(1.5-2-倍增加)(图10A)。在猴共刺激研究中，mab 20H4.9-IgG1也证实增强的功能活性导致IFN-γ相对于对照的明显增加(图10B)。在人研究中，IFN-γ的增加一致性高于利用hu39E3.G4的情况。
TNF-α合成的诱导超过对照水平也在人培养物中观察到，但是水平比IFN-γ低得多。单独的抗-CD3抗体诱导的TNF-α水平(基线)比IFN-γ基线水平低约20-50倍。Mab 20H4.9-IgG1诱导8名供体中的3名出现～2到4.7-倍的增加。hu39E3.G4(平行检测)在此诱导相同供者中的～2-倍增加但水平较低。其它受试细胞因子，IL-2，IL-5，IL-10，和IL-4在每种处理的情况下没有明显改变。
这些研究共同证实mab 20H4.9-IgG1通过诱导Th1型反应表现人和猴中所需的功能活性。明显地，由于体内抗肿瘤活性与抗-CD137抗体诱导IFN-γ合成的能力相关，这些结果支持了mab 20H4.9-IgG1相对于同种型转换的选择。
实施例2mab 20H4.9-IgG4的体外定性基于其结合动力学，不能阻断CD137-CD137L作用，以及对人T细胞的功能作用，选择mab 20H4.9-IgG1转换成IgG4形式。mab 20H4.9-IgG1的IgG4形式是20H4.9-IgG4(图示于图3和4)。
该研究的第二阶段涉及比较mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1的体外性质。在该部分中，描述了抗体在人和猴淋巴细胞中的结合动力学性质以及功能效应。
结合动力学抗-人CD137抗体的动力学特性利用表面胞质团共振、利用BIAcore3000装置评估。抗原，人CD137-鼠IgG2a低密度共价固定在CM5传感芯片表面。Mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1以25-200nM的浓度注入。图11描述mab 20H4.9-IgG1h mab 20H4.9-IgG4以100nM的注射。利用BIAevaluation software(bivalent model，global curve fit analysis)计算数据，结果显示两种抗体的动力学参数相似(见表1)。mab 20H4.9-IgG1和mab20H4.9-IgG4的解离常数KD分别测定为11.2and 16.6nM。在相似试验条件下，mab 20H4.9-IgG4不结合鼠4-1BB。
表1-比较mab 20H4.9-IgG4与mab 20H4.9-IgG1的结合动力学
流式细胞分析检测浓度范围0.32ng/ml-5μg/ml的、生物素化的mab 20H4.9-IgG4与CEM细胞±PMA-伊屋诺霉素的结合。结合于PMA-伊屋诺霉素的Mab20H4.9-IgG4以浓度依赖的方式刺激CEM细胞。在0.2μg/ml达饱和。另一方面，如对其亲本分子所示那样，mab 20H4.9-IgG1，mab 20H4.9-IgG4不结合没有经PMA-伊屋诺霉素刺激的CEM细胞(图12)。mab 20H4-.9-IgG4的浓度依赖性结合在PMA-伊屋诺霉素刺激的CEM细胞中证实(图12)。样品通过流式细胞术读数。
细胞/功能测定法为证实转换mab 20H4.9-IgG1同种型的过程不改变抗体活性，进行体外试验以比较mab 20H4.9-IgG4与亲本mab 20H4.9-IgG1在猴PBMC和人T-细胞中的活性。测定mab 20H4.9-IgG4对人和猴T-细胞或PBMC的影响并与其亲本分子，mab 20H4.9-IgG1比较。获自健康人供体的原代人T-细胞或猴PBMC用抗-CD3抗体(0.5μg/ml-1μg/ml)+/-抗-人CD137抗体刺激。IFN-γ的合成在37℃培养72小时后利用细胞计数珠阵列(cytometric beadarray)(CBA)(对人样品)或通过ELISA(对猴样品)测定。抗体在共刺激试验中、在存在亚最佳浓度的抗-CD3抗体(1μg/ml)或Concavalin A(1μg/ml)的条件下检测(仅仅对于供体M5170和81)。结果表达为相对于对照的pg/ml增加倍数。由于供体的背景反应可变，数据相对于对照治疗(＝1)标准化。图13A提供人T-细胞结果，图13B提供猴PBMC结果。如图13A-13B所示，mab20H4.9-IgG4证实与对照相比，共刺激特性在人和猴细胞中产生高水平IFN-γ。IFN-γ合成水平的提高在人和猴样品中与其亲本分子的情况相比较。
随后，评估抗体交联对mab 20H4.9-IgG4的功能效应的影响。显示抗体的交联导致它们产生信号能力的增强。由此，进行试验以测定数批mab20H4.9-IgG4±抗-人IgG抗体的功能活性。如图14A所示，在交联型抗体存在下，对于所有受试组观察到IFN-γ合成明显增加，在浓度400ng/ml出现平台。mab 20H4.9-IgG4对IFNγ合成的促进通过加入图14B所示的抗-人IgG交联型抗体而进一步增强。不同批次的mab 20H4.9-IgG4具有可比的细胞活性。
由此mab 20H4.9-IgG4的交联导致抗体诱导IFN-γ合成的能力增强。抗体体内交联可通过免疫球蛋白Fc部分的细胞受体或通过抗体二聚化出现。Mab 20H4.9-IgG4是IgG4同种型，其与其它IgG同种型相比，对Fc受体的亲和力较低。然而，IgG4可结合单核细胞和中性粒细胞上表达的Fc RI(CD64)。
采用两种其它方法进一步定性mab 20H4.9-IgG4(i)对T-细胞存活的影响和(ii)对细胞周期蛋白D2表达的影响。为测定mab 20H4.9-IgG4是否激发通过CD137对人T-细胞的信号，并提供对T-细胞的共刺激信号导致细胞存活和扩增，已知诱导IFN-γ合成的浓度的抗-CD3抗体+/-mab20H4.9-IgG4刺激的人T-细胞用膜联蛋白-V和碘化丙啶染色以检测活细胞数(膜联蛋白V/碘化丙啶阴性)，并染色细胞周期蛋白D2以检测其对细胞进展的影响。图15显示4组不同mab 20H4.9-IgG4对细胞周期蛋白D2表达和T-细胞的存活的平均结果。浓度0.4-10μg/ml的mab 20H4.9-IgG4导致活细胞数增加大约1.8-2倍，细胞周期蛋白D2-表达型T-细胞数明显增加(2.5-3倍)。
实施例3在猕猴药效学模型中对4-1BB抗体的体内评估本实施例图示mab 20H4.9-IgG4和mab hu39E3.G4增强DNA疫苗激发的抗原特异性免疫反应的能力。
材料和方法试验动物组用于该试验的雌性和雄性猕猴(2.5-5.0kg)购自CharlesRiver BRF(Houston，Texas)并成对圈养。每只试验组由4只雄性和2只雌性组成，其通过体重随机分组。试验分组如下组1-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加盐水对照，i.v.，在第12，15和19天；
组2-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加mab hu39E3.G4，i.v.，在第12，15和19天；组3-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加mab 20H4.9-IgG4，i.v.，在第12，15和19天；组4-未经治疗的对照组。
免疫和抗体治疗PSA和SIV gag DNA疫苗获自David B.Weiner，Department of Pathology and Laboratory of Medicine，University ofPennsylvania。(见，Kim等，Oncogene 20，4497-4506(2001)；Muthumani等，Vaccine 21，629-637(2003).)猴子同时用PSA和SIV gag DNA构建体(2mg/构建体/免疫)经肌内途径免疫，然后进行间隔4周的两次增强(第0，28，和56天)。初次免疫后第12天，开始用mab 20H4.9-IgG4或mab hu39E3.G4治疗。首次免疫后第12，15和19天，抗体以50mg/kg i.v给药。选择该方案是因为其抑制对mabhu39E3.G4的抗体反应。
临床和临床病理整个研究过程中，由兽医对所有猴子进行身体检查。血液学和血清化学分析的血样在接种前以及免疫后第12，42，70，97，134，和168天收集。
免疫测定法为测定对这些治疗方案诱导的免疫反应的效果，利用酶联免疫点测定法(ELISPOT)检测抗原-特异性刺激的淋巴细胞的IFN-γ产生。ELISPOT分析的血样在接种前以及免疫后12，42，70，97，134，and 168天收集。对应SIVgag和PSA抗原的完整序列的合成肽用于离体刺激PBMC。
结果应答于PSA或SIV gag肽的抗原特异性IFN-γ分泌型细胞通过ELISPOT定量。图16(图16A-16D)分别图示组1-4的结果。对PSA的反应水平在所有组中非常低，表明与未经免疫接种的动物相比，疫苗本身不诱导可检测且固定的(consistent)免疫反应。另一方面，单独的SIV gag免疫接种在大量抗原-特异性IFN-γ分泌型细胞中随时间增强(图16A)。整个研究过程中，未经治疗的动物(未接种的)显示100-1,000点/106PBMC(图16D)。这些结果确定了对疫苗的域值反应；代表＜1,000点/106PBMC的动物被认为是无反应者。接受疫苗的动物组中，6只猴子中有5只显示反应随时间增强，第三次免疫后点的平均数目(第天70)为1,727点/106PBMC(SD＝242，范围＝1,403-1,968点/106PBMC)。一只猴被认为是无反应者(620点/百万PBMC)。由于在这些研究中没有进行MHC分型。很可能一些猴子由于MHC错配而缺乏对疫苗的T细胞免疫反应。明显地，在第70天，与对照动物(图16D)相比以及与用单独的DNA疫苗免疫的猕猴相比(图16A)，用SIV gag加mab20H4.9-IgG4处理的6只动物中有4只表现明显更高数目的IFN-γ点(图16C)。mab 20H4.9-IgG4-处理的组经过第三次免疫之后点的平均数目是3,465点/106PBMC(SD＝1,236，范围＝2,070-4,780点/106PBMC)。该组中的两只猴子对疫苗无反应(＜800点/百万PBMC)。第三次免疫(第70天)后，利用mab hu39E3.G4加DNA疫苗的治疗导致6只动物中有6被认为是反应者，平均点数目为2,348点/106PBMC(SD＝588，范围＝1,738-3,283)(图16B)。对于该组，点数目的范围与用mab 20H4.9-IgG4治疗的那些猕猴相比较低。
利用20H4.9-IgG4和mab hu9E3.G4的治疗被较好耐受并没有导致相对于对照猴子的临床病症，临床化学或血液学参数的明显改变。
这些数据显示mab 20H4.9-IgG4治疗联用DNA疫苗激发相对于对照或利用mab hu39E3.G4的治疗而言的、针对受试抗原的特异性反应的体内增强，例如通过抗原特异性IFN-γ-分泌细胞测定的。由于这些初步研究中仅仅使用一个剂量水平的抗体和一个剂量方案，不可能诱导最大反应，并需进一步工作研究最佳条件。然而，很明显，即使利用这些未优化的方案，对受试抗原的细胞反应也可增强利用mab 20H4.9-IgG4实现，提示CD137功能的调节是提高DNA疫苗的有效性的吸引人的方法。
尽管本发明通过举例和实施例详述，为了清楚和理解，很明显可进行一些改变和修饰，其包括在本发明的权利要求范围之内。
序列表<110>布里斯托尔-迈尔斯.斯奎布公司Jure-Kunkel，MariaHefta，LauraSantoro，MarcGanguly，Subinay<120>抗人4-1BB(CD137)的完全人抗体<130>10060 PCT<150>US 60/510193<151>2003-10-10<150>not yet assigned<151>2004-10-08<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>7057<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>1cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc60aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt120aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta180tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg240gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga300cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt360tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg420gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc480cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg540taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat600aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac660gactcactat agggagaccc aagcttggta ccgccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc720tcctggtggc agctcccaga tgggtcctgt cccaggtgca actacagcag tggggcgcag780gactgttgaa gccttcggag accctgtccc tcacctgcgc tgtctatggt gggtccttca840gtggttacta ctggagctgg atacgccagt ccccagagaa ggggctggag tggattgggg900
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aagcgaaaga agggaaggaa agagcggtgc aagcggcccg gagagttttt tccctttttt2580tcgtacgtag agttaatcag tcgttggtat cagggcgggg attgaggcgg gtagggcggg2640gattgaggcg ggtcaaggcg ggtaagaggc ggggtaccga ctgattaaaa aaaataaata2700cgtctccggc tccggcggag ccggagactc gataaggtct tcatcactcc tccgaaaaaa2760cctccggatc cgaaaacgtt tttcgaacct gtcgagtccc gacgctaaag cgcggtttga2820actgccgtta ggatcgcact tccgaccatc ctaaaatagg ggcgacggta gtaccaagct2880ggtaacttga cgtagcagcg gcacagggtt ttatacccct aaccgttctt gcctctggat2940gggaccggag gcgagtcctt gctcaagttc atgaaggttt cttactggtg ttggagaagt3000caccttccat ttgtcttaga ccactaatac ccatcctttt ggaccaagag gtaaggactc3060ttcttagctg gaaatttcct gtcttaatta tatcaagagt catctcttga gtttcttggt3120ggtgctcctc gagtaaaaga acggttttca aacctactac ggaattctga ataacttgtt3180ggccttaacc gttcatttca tctgtaccaa acctatcagc ctccgtcaag acaaatggtc3240cttcggtact tagttggtcc ggtggaatct gagaaacact gttcctagta cgtccttaaa3300ctttcactgt gcaaaaaggg tctttaacta aaccccttta tatttgaaga gggtcttatg3360ggtccgcagg agagactcca ggtcctcctt tttccgtagt tcatattcaa acttcagatg3420ctcttctttc tgattgtcct tctacgaaag ttcaagagac gaggggagga tttcgatacg3480taaaaatatt ctggtaccct gaaaacgacc gaaatctaga gaaacacttc cttggaatga3540agacaccaca ctgtattaac ctgtttgatg gatgtctcta aatttcgaga ttccatttat3600attttaaaaa ttcacatatt acacaatttg atgactaaga ttaacaaaca cataaaatct3660aaggttggat accttgacta cttaccctcg tcaccacctt acggaaatta ctccttttgg3720acaaaacgag tcttctttac ggtagatcac tactactccg atgacgactg agagttgtaa3780gatgaggagg ttttttcttc tctttccatc ttctggggtt cctgaaagga agtcttaacg3840attcaaaaaa ctcagtacga cacaaatcat tatcttgaga acgaacgaaa cgataaatgt3900ggtgtttcct ttttcgacgt gacgatatgt tcttttaata cctttttata agacattgga3960aatattcatc cgtattgtca atattagtat tgtatgacaa aaaagaatga ggtgtgtccg4020tatctcacag acgataatta ttgatacgag tttttaacac atggaaatcg aaaaattaaa4080catttcccca attattcctt ataaactaca tatcacggaa ctgatctcta gtattagtcg4140gtatggtgta aacatctcca aaatgaacga aattttttgg agggtgtgga gggggacttg4200gactttgtat tttacttacg ttaacaacaa caattgaaca aataacgtcg aatattacca4260atgtttattt cgttatcgta gtgtttaaag tgtttatttc gtaaaaaaag tgacgtaaga4320
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<223>人工序列<400>3Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys20 25 30Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe35 40 45Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln85 90 95Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp115 120 125Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys465<210>4<211>6435<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>4gacggatcgg gagatctgct agcccgggtg acctgaggcg cgccggcttc gaatagccag60agtaaccttt ttttttaatt ttattttatt ttatttttga gatggagttt ggcgccgatc120tcccgatccc ctatggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca180gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc240
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu355 360 365Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn370 375 380Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile385 390 395 400Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr405 410 415Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys420 425 430Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys435 440 445Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu450 455 460Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470
权利要求
1.特异性结合4-1BB的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含图4所示的CDR1，CDR2，和CDR3；和所述重链可变区包含图3所示的CDR1，CDR2，和CDR3。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含图4所示的可变区；和所述重链包含图3所示的可变区。
3.包含轻链和重链的单克隆抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236且所述重链包含SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467。
4.药物组合物，包含权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合部分；和可药用载体。
5.药物组合物，包含权利要求3的单克隆抗体；和可药用载体。
6.治疗受试者中的癌症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
7.分离的多核苷酸，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸残基20-467的核苷酸序列。
8.权利要求7的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO1。
9.分离的多核苷酸，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO6的氨基酸残基21-236的核苷酸序列。
10.权利要求9的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO4。
全文摘要
完整人抗体及其抗原结合部分，其结合人4－1BB并允许人4－1BB与人4－1BB配体的结合。一方面，所述抗体是IgG4抗体。还提供用于治疗受试者中的疾病的方法，包括将治疗有效量的抗体给予所述受试者。
文档编号C07K16/28GK1867585SQ200480029775
公开日2006年11月22日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月10日
发明者玛丽亚·朱尔-孔克尔, 劳拉·J·赫夫塔, 马克·桑托罗, 苏比内伊·甘古利, 爱德华·L·哈尔克 申请人:布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布公司