专利名称：Erb抗原的靶向作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的与哺乳动物Erb基因产物结合的缀合物和包含所述缀合物的药物组合物，涉及包含该药物组合物和体外设备的药盒，以及涉及治疗和/或诊断表达Erb基因产物的癌症的方法。
背景技术：
编码生长因子及其受体的原癌基因促使乳癌和其它人类恶性肿瘤的发展(Aronson，SA，Science，2541146-1153(1991))，因此是新治疗策略的潜在靶点。具体而言，在更危险的乳癌、膀胱癌、肺癌和胃癌中已观察到此基因的表达增强。
人表皮生长因子受体-2(HER2)编码细胞表面受体，并参与引起正常细胞生长和分化的信号转导通路(DiAgustine R&Richards RG，J.MammaryGland Biol Neoplasia 2109-118(1997))。然而，HER2受体在15-25％的人类乳癌中过表达(Hynes NE&Stern DF，1198165-184(1994)，Revillion F等人，Eur.J.Cancer 34791-808(1998))，并且这种过表达与患有淋巴结阳性和淋巴结阴性疾病的女性中的较差临床结果、包括降低的无病率和总存活率有关(Hynes NE&Stern DF，Biochim.Biophys.Acta，1198165-184(1994)；Slamon DJ等人，Science，244707-712；Ravdin PM&ChamnessGC，Gene，15919-27(1995)；Bell R.Oncology，63(增刊1)39-46(2002))。此外，目前有证据表明HER2预示了对标准抗癌治疗的应答。还参见PCT/US 00/18283；PCT/US 97/18385；PCT/US 98/26266；EP 1 106 183；PCT/US 00/12552和PCT/US 00/17366。
HER-2是erbB表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族的成员。在20世纪80年代早期，当发现鸟类成红细胞增多症肿瘤病毒编码与人表皮生长因子受体(HER-1，又称ErbB1和EGFR)高度同源的致癌基因时，开始将erbB受体酪氨酸激酶与癌症相联系。随后从化学诱导的大鼠成神经细胞瘤中识别出一种称为neu的基因，它能够使培养基中的成纤维细胞变形，并且被证明与HER-1基因有关但与之不同(Shih，C等人，Nature，290261-264(1981)，Schechter等人，Nature，312513-516(1984))。几乎在同时，另外2个小组各自独立地分离出人erbB相关原癌基因并将其命名为HER-2(Coussens等人，Science，2301132-1139(1985))和c-erbB2(Semba等人，PNAS，826497-6501(1985))。这些基因随后被证明与neu相同。King及其同事也识别出一种在人乳癌细胞系中过扩增的EGFR相关基因；该基因也被发现与HER-2/neu/erbB2基因相同(King，CR等人，Science，229974-976(1985))。
HER-1和HER-2有许多不同HER-2基因位于染色体17而HER-1基因位于染色体7，HER-2mRNA及蛋白与HER-1基因产物的大小不同。erbB受体酪氨酸激酶家族还有另外两个成员，HER-3和HER-4(erbB4)，这4种受体共享一个完整的跨膜结构，该结构由细胞外组分和跨膜组分以及包含侧面具有酪氨酸自磷酸化作用位点的激酶结构域的胞内区共同组成。
在不同家族成员的结构域有许多功能性区别。例如，HER-2似乎没有直接配体而HER-3没有内源性激酶活性，因此在不同家族成员之间的包括二聚作用在内的许多复杂的相互作用是发信号所需要的。HER-2受体能够通过与结合于配体的其它HER家族成员形成异二聚体来发信号，或者两个HER-2分子可结合形成具有内源性激酶活性的同二聚体。HER-2的过表达引起同二聚体和异二聚体激活成分的产生。ErbB受体激酶激活作用将大量衔接蛋白补充至胞浆区，从而触发大量下游信号级联。HER-2激活作用的最后结果是对细胞生长、分裂、分化、迁移和吸附产生影响/综述参见Yarden，Y&Sliwkowski，MX，Nature Reviews in Molecular and Cellular Biology，2127-137(2001)。
Slamon及同事首先报道，HER-2受体在20-30％的人类乳癌中过表达(Slamon，DJ等人，Science 235177-182(1987))。在大多数情况下过表达由HER-2基因扩增引起(Pauletti，G等人，Oncogene，1363-72(1996))。人HER2基因的扩增和/或过表达与乳癌和卵巢癌的预后不良相关(Slamon，DJ等人，Science，235177-182(1987)；和Slamon，DJ等人，Science，244707-712(1989))。HER2的过表达还与其它癌、包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和膀胱癌相关。HER-2基因扩增导致由北方吸印技术(Northern blot)检测的mRNA水平增加和由免疫组织化学(IHC)或蛋白印迹分析(Western blot)检测的HER-2受体水平增加。当在感染细胞的细胞核中可见到HER-2基因的多重复制时，采用荧光原位杂交(FISH)可最明显地看到基因的过度扩增。这项技术已经成为在临床样本中检测HER-2基因扩增的有效方法。
还已经描述了称为erbB3或HER3的另一相关基因。参见美国专利US 5,183,884和5,480,968；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，874905-4909(1990)；Kraus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869193-9197(1989)；欧洲专利申请EP 444,961 A1；和Kraus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902900-2904(1993)。Kraus等人(1989)发现erbB3 mRNA在某些人乳腺肿瘤细胞系中的水平显著提高，表明erbB3，类似于erbB1和erbB2，可能在一些人类恶性肿瘤中起作用。这些研究表明，一些人乳腺肿瘤细胞系显示了稳定态ErbB3酪氨酸磷酸化的显著上升，进一步说明此受体可能在人类恶性肿瘤中起作用。因此，使用与ErbB3结合的抗体的诊断生物检定由Kraus等人描述于美国专利US 5,183,884和5,480,968中。
erbB3在癌症中的作用也已有其他人探索过。已经发现它在乳癌(Lemoine等人，Br.J.Cancer，661116-1121(1992))、胃肠癌(Poller等人，J.Pathol.，168275-280(1992)，Rajkumer等人，J.Pathol.，170271-278(1993)，和Sanidas等人，Int.J.Cancer.54935-940(1993))和胰腺癌(Lemoine等人，J.Pathol.，168269-273(1992)和Friess等人，ClinicalCancer Research，11413-1420(1995))中过表达。
ErbB3在ErbB受体家族中是唯一的，因为它具有很少或无内源性酪氨酸激酶活性(Guy等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 918132-8136(1994)和Kim等人，J.Biol.Chem.26924747-55(1994))。当Erb3与ErbB2共表达时，形成活性信号复合物，对抗ErbB2的抗体能够破坏此复合物(Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994))。另外，当与ErbB2共表达时，ErbB3与调蛋白(HRG)的亲和力增强至较高的亲和状态。关于ErbB2-ErbB3蛋白复合物还参见Levi等人，Journal ofNeuroscience 151329-1340(1995)Morrissey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 921431-1435(1995)；Lewis等人，Cancer Res.，561457-1465(1996)。
Rajkumar等人(British Journal Cancer.70(3)459-465(1994))研发了一种抗ErbB3的单克隆抗体，其对表达此受体的细胞系的无贴壁依赖性生长有拮抗作用。
生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的1级亚科被进一步扩展为包括HER4/p180erbB4受体(参见欧洲专利申请EP 599,274；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)和Plowman等人，Nature，366473-475(1993))。Plowman等人发现增加的HER4表达与上皮起源的某些癌、包括乳腺癌密切相关。因此，通过评价HER4表达来检测人类瘤形成病症(特别是乳癌)的诊断方法描述于欧洲专利申请EP 599,274中。
对HER2致癌基因的激活子的研究导致了调蛋白多肽家族的发现。这些蛋白质似乎来源于位于人染色体8短臂上的单基因的可选剪接，参见Lee等人，Genomics，16790-791(1993)；和Orr-Urtreger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，第1867-1871页(1993)；PCT/US 79/03546和PCT/US97/11825。
HER-2在极少数人类乳癌中过表达及其预后显著不好的发现提示研究者开发以HER-2作为治疗靶点的药物。包括Genentech Inc.的工作者在内的一些研究组培养了HER-2胞外结构域的鼠单克隆抗体，并且证明这些抗体中的部分能够抑制过表达受体的细胞系的生长(Hudziak，RM等人，Molecular Cell Biology，91165-1172(1989)；Fendly，BM等人，CancerResearch 501550-1558(1990))。这一作用也见于HER-2-过表达的人类乳癌异种移植物中，其中抗体作用被发现可与抗肿瘤药如顺铂协同(Pietras，RJ等人，Cancer Research，91829-1838(1994)；Harris，M&Smith，I，Endocrine-Related Cancer，975-85(2002))。
Genentech研究员们开发了一组能够抑制HER-2+细胞系的鼠单克隆抗体；其中最有效的是muMAb 4D5。发现此抗体可抑制过表达HER-2的细胞系增殖，但是对HER-2水平没有升高的细胞有很小或没有影响(Sarup，JC等人，Growth Regulation，172-82(1991))。有人发现4D5是人乳癌异种移植物生长的有效抑制剂(Beselga&Mendelsohn，Pharmacology Therapy，64127-154(1994)并且因此被选择进行进一步临床开发。
为了降低产生人抗鼠免疫应答的可能性，随后将4D5鼠单克隆抗体人源化。Carter及同事将抗体的高变区亚克隆至编码人κ轻链和IgG1恒定区的质粒，以产生编码嵌合抗体的载体，其随后通过定向诱变被进一步人源化(Carter，P等人，PNAS89，4285-4289(1992))。将载体转导至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞随后分泌抗体至培养基且从中纯化。称为曲妥单抗的嵌合抗体是95％人和5％鼠并且保留对亲代抗体的HER-2抗原决定簇的高亲和力。
曲妥单抗对HER-2的亲和力3倍于其亲代鼠抗体4D5。已经证明它与4D5类似，对HER-2过表达细胞系具有显著的抗增殖作用而对不表达HER-2的细胞的作用很小(Carter，P等人，PNAS89，4285-4289(1992))。这种抗增殖作用还已经由Baselga及同事在体内乳癌异种移植物实验中进行了证明，此实验中建立的BT-474肿瘤异种移植物的生长被曲妥单抗抑制。剂量少于1mg/kg时，生长呈剂量依赖性地抑制，而在较高剂量下则完全没有生长(Baselga，J等人，Cancer Research，582825-2831(1998))。在同一研究中，研究人员试着将曲妥单抗加至紫杉醇或多柔比星中。单独化学疗法被证明只有适度的抗肿瘤活性，而与曲妥单抗的组合疗法导致化学疗法的作用显著增强，采用紫杉醇和曲妥单抗可观察到最大生长抑制。
Pegram及同事在HER-2转染MCF7异种移植物模型中考察了曲妥单抗对许多其它化疗药物的作用。协同交互作用见于顺铂、多西他赛、塞替派、环磷酰胺、长春瑞滨和依托泊苷。叠加作用见于多柔比星、紫杉醇、长春碱和甲氨喋呤，并且发现曲妥单抗和5-氟尿嘧啶(5-FU)的组合是拮抗的(Pegram，M等人，Oncogene，182241-2251(1999)；Konecny，G等人，Breast Cancer Research and Treatment，6953-63(2001)，综述参见Pegram，MD等人，Seminars in Oncology，2721-25(2000))。这些体内模型中观察到的协同作用引起了曲妥单抗与化学疗法的组合的临床试验探索。
已经证明曲妥单抗(Herceptin)对HER-2阳性转移乳腺疾病患者以单一疗法给药时(Cobleigh MA等人，J.Clin.Oncol.172639-2648(1999)；Vogel CL.Et等人，J.Clin.Oncol. 20719-726(2002))或与化学疗法组合给药时(Slamon DJ等人，N.Engl.J.Med.344783-792(2001))有显著的临床优点。曲妥单抗治疗有令人印象深刻的存活优点(Vogel CL等人，J.Clin.Oncol.20719-726(2002)；Slamon DJ等人，N.Engl.J.Med.344783-792(2001))，这样的优点包括与仅化学疗法相比，当在通过免疫组织化学(IHC)证明其肿瘤有IHC 3+蛋白过表达的患者的化学疗法中加入曲妥单抗，使半数存活增加45％(29 vs20个月，分别)(Smith IE，Anticancer Drugs 12(增刊.4)S3-S10(2001)。正如此增刊其它部分所说明的，交叉实验对照的证据表明，在转移环境下由曲妥单抗达到的临床优点比稍早给予的治疗更好(Bell R.Oncology，63(增刊139-46(2002))。
WO 03/03511(AB研究基金会)公开了用于靶向药物传送的多药物多配体缀合物，其中识别肽、单克隆抗体或其部分的表皮生长因子受体可被用作靶分子。
WO 01/00244(Genentech，Inc.)公开了使用抗ErbB抗体-maytansinoid缀合物的治疗方法，其中maytansinoid直接与抗ErbB抗体结合。
WO 00/02050(Mitra Medical Technology AB和华盛顿大学放射肿瘤学系)公开了一种与生物分子缀合的三功能试剂。
在2003年，预计约有211,300名美国妇女新出现浸润性乳癌。女性最常诊断出非皮肤癌症。乳癌发病率自1980年以来持续增长，尽管增长率在20世纪90年代相比于20世纪80年代有所降低。此外，在最近一段时间，乳癌发病率仅在50岁及以上人群中增加。在2003年，预计将出现1,300件男性乳癌新病例。
除浸润性乳癌外，2003年在女性中预计将发生55,700件原位乳癌新病例。其中，大约85％将是导管原位癌(DCIS)。DCIS病例检出的增加是乳房X线摄影筛选使用增加的直接结果，在可触及之前(即在可被感觉到之前)检出浸润性乳癌。
预计有大约40,200名患者死于乳癌(39,800名女性，400名男性)，在女性癌症死亡中处于第2位。根据最新数据，随着白人及非裔美籍人中的年轻女性大量减少，死亡率在1989-1995年间每年下降1.4％，随后每年下降3.2％。这种减少很可能是早期检出和改善治疗两者的结果。
尽管已通过手术除去肿瘤，但是始终存在复发的危险，因为可能有显微镜可见的癌细胞已扩散到身体中远处的位置。为了降低患者复发的危险，许多乳癌患者接受化学疗法。化学疗法使用遍及全身的抗癌药物。
有许多不同的化疗药物，它们通常在患者手术后组合给药3至6个月。根据所接受的化疗方案的种类，药物治疗可每3至4周给予，并且许多药物需要全身给药。最常见的2种方案是AC(多柔比星和环磷酰胺)给药3个月或CMF(环磷酰胺、甲氨喋呤和氟尿嘧啶)给药6个月。
有时患者的癌症会复发，或者发展为IV期乳房外疾病。这些患者都需要化学疗法，并且可能尝试许多种不同药物直到产生响应。有时化学疗法在手术前给予，例如新辅助化疗。它通常用于需要在能够手术前被缩小的非常晚期的癌症。
乳癌通常接受高能量放射治疗，此治疗要求患者一周有5天去放射治疗中心，总计达6周。放射对于减少局部复发的危险是非常重要的，并且经常用于较晚期病例以杀死可能位于淋巴结的肿瘤细胞。
尽管已证明曲妥单抗(Herceptin)可增加过表达HER-2乳癌患者的“平均存活时间”，但是其最显著的作用发生于与化学疗法组合时。然而这些组合治疗有严重的副作用，特别是在某些情况下致命的心室功能障碍和充血性心力衰竭。心功能障碍的发病率及严重度在接受Herceptin与蒽环类抗生素和环磷酰胺组合治疗的患者中尤其高。
对大量癌症适应症而言，放射免疫疗法被证明比裸抗体更有效(Goldenberg D.M.&Nabi，H.A.，Cancer 89104-113，2000)。
然而“裸抗体”的有效性依赖于经抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体激活来诱导宿主肿瘤应答的能力，或者当为曲妥单抗(Herceptin)时通过中断生长信号来阻断和可能预防进一步生长的能力。另一方面，经放射性标记的抗体通过发射放射性粒子来杀死肿瘤细胞，因此甚至当宿主免疫效应子功能受损时也可能有效。此外，基于放射性核素的特性，放射免疫疗法能够破坏远离免疫靶细胞的细胞(信道间的干扰)。因此，甚至也能治疗异种肿瘤(表达多种抗原程度的肿瘤)，因为不是所有细胞均被靶向。因此携带放射性核素的抗体发挥其杀细胞作用只需肿瘤特异性结合位点。然而，放射免疫靶向也可与裸抗体结合和/或与化学疗法或外照射一起使用。
一些研究探索了放射免疫靶向在乳癌中的使用。抗原靶主要包括CEA、MUC1和U6。这些和其它用于乳癌的抗体最近已被综述(GoldenbergD.M.&Nabi，H.A.，Cancer 89104-113，2000)。
然而，正常器官毒性限制了可安全施用于患者的活性量，从而限制了肿瘤吸收剂量。首要剂量限制器官是骨髓。血液癌症如局部B细胞淋巴瘤可被剂量为30至44Gy的外线束放射疗法治愈。通过常规放射免疫治疗(不使用干细胞支持)所达到的剂量较低。Wiseman等人报道了B细胞淋巴瘤III期试验的中位剂量15Gy(Wiseman G等人，Critical reviews inOncology/Hematology 39(2001)181-194)。响应率为80％客观响应和34％完全响应。使用干细胞支持的Seattle小组报道了最高缓解率为80％完全缓解(Liu Steven Y等人，J.Clin.Oncol.16(10)3270-3278，1998)。他们估计肿瘤位置达到27至92Gy。
非血液学剂量限制毒性是可逆性肺动脉瓣关闭不全，这发生于对肺剂量大于等于27Gy时。尽管研究不是十分具有可比性，但是他们指出了RIT中的量效关系。如果存在剂量关系，则若能给肿瘤传送更高剂量的话就可能使功效增强。这可能是临床最相关的，因为RIT后的完全缓解有更长的缓解持续时间(Wahl等人，J.Nucl.Med.3921S-26S，1998)。
对此的一个障碍是骨髓的放射敏感性。骨髓的吸收剂量较高可能导致重度骨髓抑制。因此，达到更有效治疗的必需剂量被血液循环中的放射性聚集所妨碍，导致对正常器官如骨髓的毒性。已经报道了多种在静脉给药后清除血液使之不含细胞毒靶向生物分子的方法(如治疗性或诊断性单克隆抗体)(综述参见Schriber G.J.和Kerr D.E.，Current Medical Chemistry2616-629，(1995)；Goldenberg D.M.，J.Nucl.Med 43693-713(2002)和Carlsson等人，Radiotherapy and Oncology 66107-117(2003))。
已提出多种方法以在肿瘤聚集到足以诊断或治疗的量的免疫缀合物后从血液循环中快速清除经放射性标记的抗体。其中所用的一些方法包括通过形成免疫复合物来增强机体自身清除机制。放射性标记抗体的血液清除率增加可通过使用与治疗抗体结合的分子来获得，例如其它指向治疗抗体的单克隆抗体(Klibanov等人，J.Nucl.Med 291951-1956(1988)；Marshall等人，Br.J.Cancer 69502-507(1994)；Sharkey等人，Bioconjugate Chem.8595-604，(1997))、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白(Sinitsyn等人，J.Nucl.Med.3066-69(1989)，Marshall等人，Br.J.Cancer 7118-24(1995))或可由肝细胞受体除去的含糖基的化合物(Ashwell和Morell，Adv.Enzymol.4199-128(1974))。
在所谓的抗生物素蛋白追踪模式中，当肿瘤内已经聚集足够量的抗体时，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白在施用其上已经结合有生物素的治疗或诊断抗体后全身给药。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白将与抗体相连，如此形成的免疫复合物将经由网状内皮系统(RES)从血液循环中清除并经由肝从患者体内清除。这些过程将提高生物素化的细胞毒抗体的清除率。达到同样目的的可选方法是使用抗独特型抗体。然而，所有这些方法依赖于肝或肾的血液清除，因此使这些重要器官的任一者或两者以及膀胱接触高剂量的细胞毒性。
这些方法的另一主要缺点是这些药物、特别是链霉抗生物素蛋白的免疫原性，这种免疫原性在一旦发生免疫应答时阻止重复治疗。
血液清除的体外技术广泛用于肾透析，在那里由于肾功能不足导致毒素物质在血液中积累。可用体外装置的其它医疗应用包括放射性物质的去除；中毒水平的金属的去除；细菌或病毒产生的毒素的去除；中毒水平的药物的去除；和整体细胞的除去(如癌细胞，特定造血细胞，如B-、T-或NK-细胞)；或者细菌和病毒的去除。
用于从血液循环中清除药物的体外技术格外有吸引力，因为毒性物质被快速从身体中除去。
免疫靶向的上下文中这些方法的应用已有描述(Henry，ChemicalAbstract 18565(1991)；Hofheinze D等人，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.28391(1987)；Lear J.K.等人，Antibody Immunoconj. Radiopharm.4509(1991)；Dienhart D.G.等人，Antibody Immunoconj.Radiopharm.7225(1991)；DeNardo S.J.等人，J.Nucl.Med 33862-863(1992)；DeNardo G.L.等人，J.Nucl.Med 341020-1027(1993)；DeNardo G.L.，J.Nucl.Med 33863-864(1992)；和美国专利US 5,474,772(用药物进行的治疗方法))。
为了使血液清除更有效和能够处理全血而不仅是如上述方法提及的血浆，已经使药物(如携带肿瘤特异性单克隆抗体的杀细胞药物或用于肿瘤定位的放射性核素)被生物素化并通过柱基质上的抗生物素蛋白化吸附剂清除。许多出版物提供了数据，说明此技术对生物素化的和放射性核素标记的肿瘤特异性抗体的清除既有效又实用(Norrgren K等人，AntibodyImmunoconj.Radiopharm.454(1991)；Norrgren K等人，J.Nucl.Med 34448-454(1993)；Garkavij M等人，Acta Oncologica 53309-312(1996)；Garkavij M等人，J.Nucl.Med.38895-901(1997))。
此技术还在EP 0 567 514和US 6,251,394中有描述。Mitra MedicalTechnology AB(Lund，瑞典)开发并制造的装置MitraDep即基于此技术。通过使用连接生物素标记的治疗性抗体的包被抗生物素蛋白的滤器，血液清除技术同样很好地应用于嵌合抗体或完全人源化抗体。实验数据显示在3小时吸收过程中，多于90％的循环生物素化抗体可被MitraDep系统除去(Clinical Investigator′s Brochure-MitraDep)。这些已经在最新的临床研究中被证实。
为了被吸收至体外滤器，在施用于患者前，携带细胞毒剂(如放射性核素)的克隆单抗体需要被生物素化(生物素与滤器中的抗生物素蛋白不可逆结合)。每个IgG分子的生物素基部分的数量范围为3-6，通常是4。
然而，在大多数情况下采用抗体的同类型官能团(ε-氨基)来偶联螯合基团和生物素基团，导致对最易接近的位点的竞争。
抗体的螯合作用和/或生物素化作用产生异源制备物，例如如果螯合抗体平均每个抗体有3个螯合剂，则制备物实际上包含1个螯合剂/抗体至7个螯合剂/抗体的抗体混合物。因为螯合剂和生物素连接在抗体的同一部分，所以一些具有较多数量螯合剂的抗体将含有低数量的生物素分子，而一些有高数量螯合剂的抗体将根本没有生物素。
这在统计学上意味着，携带放射性核素而无生物素的抗体将在血液中循环，并且这些抗体将不会被MitraDep滤器除去。
为了促进治疗性或诊断性裸抗体的标记和确保生物素与放射性标记的比例是1比1，Mitra Medical Technology AB(Lund，瑞典)已经开发了一系列新的包含两类官能团的水溶性结构(Tag-试剂；MitraTagTM)，由此使螯合基团(用于放射性标记)和生物素基团能够同时且区域特异性地缀合。
这种新方法与放射性核素的连续标记和生物素基化相比具有许多优点，在给医院提供裸(非螯合)抗体的情况下，以及除放射性标记步骤外螯合基团和生物素基团不得不与抗体连接的情况下，该方法尤其有吸引力。
这些药物的进一步开发和应用在下列文献中有描述US 6 251 394；PCT/SE 98/01345；PCT/SE 99/01241；PCT/SE 99/01241；US 09/519 998；US 09/750,280；PCT/SE 02/01191和Wilbur，S.D等人，BioconjugateChemistry，131079-1092(2002)。
螯合基团DOTA标记的Tag-试剂被称为MitraTagTM-1033，还在下文定义部分中陈述。
发明概述本发明的目的是解决上述讨论的与治疗表达原癌基因Erb的某些癌症疾病有关的问题。该目的通过如权利要求书和下述说明中定义的本发明来完成。
本发明囊括包含抗Erb抗体的缀合物、包含所述的包含抗Erb抗体的缀合物的医药组合物、包含该医药组合物的药盒，以及治疗和/或诊断表达癌基因蛋白HER的癌症、即具体是乳癌和卵巢癌的多种方法。
更确切而言，本发明一方面涉及缀合物，该缀合物包含a)三功能交联部分，其偶联有b)亲和配体，经由连接1连接；c)细胞毒剂，任选经由连接2连接；和d)抗Erb抗体或其变体，其能够与哺乳动物肿瘤表面上表达的Erb抗原结合，亲和结合常数至少为5×106M-1，其中亲和配体是生物素，或者是具有与生物素基本相同的结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的功能的生物素衍生物，其中优选生物素酰氨键的酶裂解的稳定性已经在连接1中引入。
另一方面，本发明涉及包含所述缀合物和可药用赋形剂的医药组合物。
另一方面，本发明涉及药盒，该药盒用于体外除去或至少是降低哺乳动物宿主的血浆或全血中的未结合组织的包含缀合物的医药组合物的浓度，其中所述的医药组合物已预先引入所述哺乳动物宿主体内并在其中保持一段时间，以通过附着其上来浓缩至特定组织或细胞，所述药盒包含a)所述医药组合物，和b)包含固定受体的体外装置，试剂的亲和配体与所述固定受体结合。
另一方面，本发明涉及权利要求33-45的用于治疗和/或诊断在哺乳动物宿主肿瘤细胞的表面上表达Erb基因产物的癌症的方法，其中医药组合物被施用于需要其的哺乳动物。
本发明的其它优点和目的将更详尽地描述，尤其是参考附图来描述。
附图简述
图1显示“冷”(未标记，无1033-缀合物)曲妥单抗对111In标记的1033-曲妥单抗与SKBR-3细胞结合的竞争性抑制。
图2显示注射111In-1033-曲妥单抗(实心三角)或111In-1033-利妥昔单抗(实心方块)抗体缀合物的大鼠的放射性总体清除率的比较，以百分比±标准偏差表示。数据经放射性衰变和背景校正。
图3显示注射111In-1033-曲妥单抗(实心三角)或111In-1033-利妥昔单抗(实心方块)抗体缀合物的大鼠的放射性总血液清除率的比较，以占初始活性的％±标准偏差表示。数据经放射性衰变校正。
图4显示大鼠中111In-1033-曲妥单抗的生物分布，以占每克组织注射剂量的％±标准偏差表示。结果经放射性衰变校正。
图5显示大鼠中111In-1033-利妥昔单抗的生物分布，以占每克组织注射剂量的％±标准偏差差表示。结果经放射性衰变校正。
优选实施方案的描述定义“裸抗体”当用于本文时意为抗体、抗体片段、“单链Fv”抗体片段或“双抗体”，它们不携带任何与免疫球蛋白结构连接的试剂或结构以增强抗体作用，所以裸抗体对肿瘤细胞的作用需要依赖于抗体本身的内在作用。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，包含除可能以最小量存在的天然产生的突变外均相同的抗体群的单个抗体。单克隆抗体高度特异且对抗单个抗原位点。而且，与通常包括对抗不同决定簇(抗原决定部分)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，各单克隆抗体的优点是它们由杂交瘤培养物合成而未受其它免疫球蛋白的污染。修饰词“单克隆”表明从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，而不应理解为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明欲使用的单克隆抗体可通过由Kohler等人在Nature，256495(1975)中首次描述的杂交瘤方法来制备，或者通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。单克隆抗体还可例如使用描述于Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与来自特定种属或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或与之同源，而链的其余部分与来自其它种属或属于其它抗体类或亚类的抗体及这些抗体的片段(只要它们显示出所需生物活性)中的相应序列等同或与之同源(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白。含有最小序列的免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)衍生自非人免疫球蛋白。对大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中受体的互补性决定区(CDR)的残基被具有预期特异性、亲和力和容量的非人种属(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。而且，人源化抗体可包含既不在受体抗体也不在引入的CDR或构架序列中的残基。可做出这些修饰以进一步精制和最优化抗体性能。
通常，人源化抗体包含基本上所有的或至少一个、一般是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。更多详情参见Jones等人，Nature，321522-525(1986)Reichmann等人，Nature.332323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。人源化抗体通过用感兴趣的抗原使猕猴免疫来制备。
“抗原片段”包含完整抗体的一部分，一般是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单链Fv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，Fv多肽还包含处于VH和VL结构域之间的多肽连接，它使sFv形成抗原结合所需的结构。sFv的综述参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenbourg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链中连接的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(VH-VL)。通过使用过短以至允许在同一链的两个结构域之间配对的连接，使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有更完整的描述。
本文所用的术语“抗Erb抗体”意欲指这样的抗体，其能与肿瘤细胞上表达的各种类型的哺乳动物erb基因产物特异性结合，且亲和结合常数至少为5×106M-1。该术语包括但不限于抗erb1、erb2、erb3和erb4抗体。
术语erb或erb抗原在本申请中涉及各种类型的哺乳动物erb基因产物，特别是这些基因产物作为抗肿瘤抗体的靶点的用途。
如本文所用的术语抗Erb抗体的“变体”意为任何当与Erb抗原分子结合时具有相同或基本相似的亲和结合常数、即亲和结合常数为至少5×10-6M-1的其变形、片段或衍生物。
为了优化在体液中的半衰期和抗体或抗体片段或衍生物在肿瘤组织中的滞留，任何这些变体可已经通过与不同数目的聚乙二醇链偶联来进行修饰。在最优选的应用中，抗体或抗体衍生物应当允许附着足够数目的生物素残基以用于通过与固定抗生素蛋白的相互作用来体外消除，而没有显著降低靶试剂的结合性质。
“治疗”涉及治疗性处理和预防或防止性手段。需要治疗的患者包括已经患病的患者和其中疾病欲被预防的患者。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、驯养及农用动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等等。优选哺乳动物是人。
“紊乱”是任何可从用抗Erb抗体治疗获益的病症。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所述紊乱的病理状况。本文所欲治疗的紊乱的非限制性实例包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、间质和囊胚腔的病症；以及炎性、血管生成的和免疫(immologic)的病症。
术语“癌”和“癌症”涉及或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌和各种头与颈癌。
如本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。此术语意欲包括放射性同位素(例如I、Y、Lu)、化疗药物和毒素(例如但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的活性毒素或其片段)。一些放射性核素如铟-111用作诊断剂并且本身以低活性施用，但是如果给予较高剂量也可用于治疗目的，因此也是本文的细胞毒剂。
“化疗药物”是可用于治疗癌症的化合物。化疗药物的实例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、Cytoxin、紫杉醇、甲氨喋呤、顺铂、苯丙氨酸氮芥、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、Duanomysin、洋红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins(参见美国专利4,675,187)、Maytansinoid、苯丙氨酸氮芥和其它相关氮芥。
如本文所用的术语“MitraTagTM-1033”，还简称为“1033”，指化合物3-(13′-硫脲苄基-DOTA)三氧杂二胺-1-(13″-生物素-Asp-OH)三氧杂二胺-5-异氰硫基-氨基异酞酸酯。
本发明的下述实施方案还用于解释本发明的细节。
所有种类的在肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症均适合于采用本发明的医药组合物、药盒或方法来治疗。在优选的实施方案中，医药组合物、药盒或方法适用于乳癌或卵巢癌。最优选的应用是所谓的HER-2型乳癌，即过表达HER-2的乳癌。这种类型还称为Erb-B2或c-erb-2。
本发明给出新的医药组合物来治疗特别是特定类型的乳癌和卵巢癌。
而且，采用本发明，通过在施用细胞毒剂后降低细胞毒剂在血液循环中的浓度以及由此可能采用较高剂量及因此得到更有效的治疗方案而不用使重要器官与较高毒性接触，可能在治疗表达原癌基因Erb的弥散性癌、特别是乳癌和卵巢癌中提高细胞毒靶向剂的肿瘤与非肿瘤比例。
在一个实施方案中，经放射性标记的抗Erb抗体通过骨髓移植或通过本领域的其它已知方法以单次剂量给予，该剂量受限于患者的耐受剂量且没有造血功能的重构。90Y-抗Erb抗体(“低剂量”)的剂量范围是10-20MBq/kg体重，优选11-15MBq/kg，目的在于定位的111In-抗Erb抗体的范围是50-200MBq/m2体表，优选100-150MBq/m2体表。在这个实施方案中，未结合的经放射性标记的治疗或诊断抗体的体外清除是任选的。
在另一个实施方案中，经放射性标记的抗Erb抗体以单次剂量给予，该单次剂量用于将大量放射性传送给患者。这种“高剂量方法”必须与重构骨髓或降低对骨髓的辐射效应的方法组合，优选通过使用MitraDep系统。对90Y-抗Erb抗体而言，“高剂量”指单次剂量超过20MBq/kg体重。
在一个优选的实施方案中，111In-抗Erb抗体以100-150MBq/m2体表的剂量与“高剂量”(＞20MBq/kg体重)90Y-抗Erb抗体组合，以6-8天的时间间隔依次给予或同时给予。
在一个实施方案中，经放射性标记的抗Erb抗体通过骨髓移植或通过本领域的其它已知方法以单次剂量给予，该剂量受限于患者的耐受剂量且没有造血功能的重构。177Lu-抗Erb抗体(“低剂量”)的剂量范围是555-2220MBq/m2体表，优选1000-2000MBq/m2。在这个实施方案中，未结合的经放射性标记的治疗或诊断抗体的体外清除是任选的。
在另一个实施方案中，经放射性标记的抗Erb抗体以单次剂量给予，该单次剂量用于将大量放射性传送给患者。这种“高剂量方法”必须与重构骨髓或降低对骨髓的辐射效应的本领域已知的方法组合，优选通过使用MitraDep系统。对177Lu-抗Erb抗体而言，“高剂量”指单次剂量超过2220MBq/m2体表。
177Lu与90Y相比其优点如下90Y是纯β放射源，不能通过外部γ照相机成像(免疫闪烁成像)，因此需要使用111In来成像。相反，177Lu除β离子发射外还发射γ射线。因此，177Lu可直接成像而不需要与111In组合。因此，当使用177Lu时仅需要一种放射性药物用于定位和治疗，这简化了治疗方案和降低了成本，而且还减少了患者的放射负荷。
与177Lu相比，90Y的物理半衰期较短(2.67天)且射程较长(12.0mm)。177Lu的半衰期较长(6.7天)且射程较短(2.2mm)的好处是允许抗体-放射性核素集中于肿瘤较长时间，并且较长的半衰期很好地使得细胞内半衰期较长。此外，177Lu的较短射程可引起对邻近肿瘤组织的组织较少的旁观者辐射(交叉照射)，可能的代价是对较大损伤的效力较低。90Y的较长射程的优点是能够较好地照射较大损伤。
基于预后将乳癌分为5个不同的期。当乳房开始生长失控并随后侵入邻近组织或扩散遍及全身时，出现乳癌。可扩散至全身或侵入邻近组织的肿瘤被认为是癌，称为恶性肿瘤。理论上，乳房中任何类型的组织都可形成癌，但通常从乳导管或乳腺形成。
为了指导治疗和提供预后的一些见识，乳癌被分为5个不同的期。
0期(称为原位癌)小叶原位癌(LCIS)指沿乳腺排列的异常细胞。这是未来发展为癌的危险因子，但是这不代表癌本身。
导管原位癌(DCIS)指沿导管排列的异常细胞。患有DCIS的女性患浸润性乳癌的危险增加。治疗方案与I期乳癌患者相似。
I期——早期乳癌，其中肿瘤直径小于2cm且未扩散出乳房。
II期——早期乳癌，其中肿瘤直径小于2cm且已扩散至腋下淋巴结，或者肿瘤直径2-5cm(扩散或未扩散至腋下淋巴结)，或者肿瘤直径大于5cm且未扩散出乳房。
III期——局部晚期乳癌，其中肿瘤直径大于5cm且已扩散至腋下淋巴结，或者癌广泛分布于腋下淋巴结，或者癌已扩散至邻近胸骨的淋巴结或邻近乳房的其它组织。
IV期——转移性乳癌，其中癌已散布出乳房转移至身体的其它器官。
尽管所有5组的患者均适合本发明的治疗，但是在最优选的实施方案中恶性肿瘤表示III期和IV期。
在本发明中，免疫靶向剂(免疫缀合物)是携带有不同于普通细胞毒药物的细胞毒部分的试剂，其以较高亲和力与表达原癌基因Erb的肿瘤细胞特异性结合，可施用于人。在优选的应用中，免疫靶向剂是抗体，其可具有不同的同种型并可来源于任何种属。优选的抗体是人源化单克隆抗体。而且，特别感兴趣的是除了具有上述性质外还以至少约50nM、更优选至少约10nM的亲和力与erb受体结合的那些。
特别感兴趣的是单克隆抗体衍生物。后者包括片段如Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab″)和Fv片段等等。它们还包括基于一种或多种靶特异性单克隆抗体(例如嵌合抗体或人源化抗体、单链抗体等等)的抗原结合区的特异性的遗传工程杂种或化学合成肽。生物分子结合部分(IgG反应活性部分)与抗Erb抗体共价或非共价结合或缀合，亲和结合常数至少为5×108M-1。
为了增强作用或引入诊断性质，使用肿瘤特异性单克隆抗体作为多种细胞毒剂的载体(免疫缀合物)，所述的细胞毒剂例如但不限于放射性核素、化疗药物、合成或天然产生的毒素、免疫抑制或免疫刺激剂、放射增敏剂、X射线或MRI或超声的增强剂，在载有非放射性元素的抗Erb抗体已经聚集至特定细胞或组织后可通过外照射转换为放射性元素的该非放射性元素，或者光敏化合物或用于照片成像或光动力疗法的化合物，或者直接或间接对癌细胞或癌组织具有相同或相似作用的任何其它分子，以及前药方案中所用的酶。细胞毒剂优选是放射性核素，例如γ放射源如碘-131或金属离子缀合物，其中金属选自β-粒子放射源，如钇、镥或铼。Gansow等人的美国专利4,472,509公开了二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)螯合剂用于将放射性金属与单克隆抗体结合的用途。该专利尤其针对用于从放射性药物中除去非结合和偶然结合(非螯合)的金属的纯化技术，但是用于解释本领域公知的制备经放射性核素标记的抗体的方案。
根据这样的通用步骤，使对联合有抗原的靶组织有特异反应活性的抗体与一定量具有蛋白质结合官能团和金属结合官能团的所选择双功能螯合剂反应，以制备螯合剂/抗体缀合物。在抗体与螯合剂的缀合中，过量螯合剂与抗体反应，其具体比例依赖于反应物的性质和每抗体所需的螯合剂数目。要求是放射性核素以这样一种方式通过螯合(对金属而言)或共价键被结合在使用生物分子缀合物(例如用于患者)的条件下，它们不会从生物素化/放射性标记的化合物中分离出。
当细胞毒剂是放射性核素、特别是金属放射性核素时，它通过细胞毒剂结合部分与三功能交联部分结合。
因此，优选最稳定的螯合剂或共价结合方案。此结合/键合部分(即细胞毒剂结合部分)的实例对卤素放射性核素而言形成芳基卤化物和乙烯基卤化物；并且对Tc和Re放射性核素而言包含N2S2和N3S螯合剂；对In、Y、Pb、Bi、Cu、Sm和Lu放射性核素而言，氨基-羧基衍生物如EDTA、三亚乙基四胺六乙酸和DTPA或其衍生物，所述的DTPA衍生物为Me-DTPA、CITC-DTPA和环己基-DTPA，以及环胺，如NOTA、DOTA和TETA，及其衍生物(Yuangfang和Chuanchu，Pure&Appl.Chem.63，427-463，1991)。
可用作细胞毒剂的β射线放射源包括放射性核素如钪-46、钪-47、钪-48、铜-67、镓-72、镓-73、钇-90、钌-97、钯-100、铑-101、钯-109、钐-153、镥-177、铼-186、铼-188、铼-189、金-198和镭-212。最有用的γ放射源是碘-131和铟-m114。可用于本发明的其它金属离子包括α射线放射源如铋-212、铋-213和砹-211，以及正电子发射源如镓-68和锆-89。
在本发明的另一实施方案中，经放射性核素标记的靶向剂不仅可用于治疗表达erb抗原的癌症，而且还可用于这类癌症的成像。成像可通过利用采用轫致辐射的β-发射放射性核素或通过用于成像的γ-射线放射性核素来完成。在另一个优选的实施方案中，同时是β和γ放射源的177Lu被用作治疗和诊断癌症的细胞毒剂。
在优选的实施方案中，缀合物、优选MitraTagTM的a)-c)部分平均2-4个分子与每个抗Erb抗体分子结合，在最优选的实施方案中，每抗Erb抗体的平均分子数是2.5-3.5个。
在给药后的适宜时间，“细胞毒靶向剂”将通过体外方法从血液系统中除去。为了使体外消除变得容易，将用于全血或血浆体外循环的装置通过导管线和血液出入口装置与患者相连。此装置应提供将血液运输至吸附装置的导管和将处理后血液或血浆回输给患者的导管。在这种血浆通过吸附装置处理的情况下，还需要血浆分离装置和将浓缩血液和处理后血浆混和的手段。后者通常通过将两种组分导入混合用的防气器来进行。
在全血被处理的情况下，常规的透析机可构成此装置的基础。透析机通常装配有所有必需的安全设备和监测设备以满足患者的安全需要并使系统操作简单。因此，在优选的方案中，处理全血，且标准透析机仅通过对硬件做较小改变后使用。然后，该装置需要适于新的预期目的的新程序。
除了装置外，还需要适于预计流量和从患者至机器距离的特定输血导管。这些导管线可由与血液或血浆相容的任何材料制造，包括透析中所用的常规导管所用的材料。
血液出入口可通过外周静脉导管完成，或者若需要较高血流量时通过中心静脉导管来完成，例如但不限于锁骨下或股动脉导管。
对于亲和吸附剂而言，基质可具有多种形状和化学组成。例如，其可构成以天然来源或人工制造的微粒聚合物填充的柱状空间。颗粒可是大孔的或其表面是接枝的(grafted)，后者是为了扩大表面积。颗粒可是球状或颗粒状的，以多糖、陶瓷材料、玻璃、二氧化硅、塑料或任何这些的组合或相似材料为基础。这些材料的组合可例如是包被有天然来源或人工制造的适宜聚合物的固体颗粒。还可使用人工膜。这些膜可以是由纤维素、聚酰胺、聚砜、聚丙烯或其它类型的材料制造的平面膜，所述的其它类型的材料足够惰性、生物相容和无毒且受体可直接或在对膜表面进行化学修饰后固定在其上。也可以使用毛细管膜(如由纤维素制造的空心纤维)、聚丙烯或适合于此类膜的其它材料。优选的实施方案是基于琼脂糖且适于体外应用的微粒材料。
在一个实施方案中，使用分子印迹聚合物(MIP)。在此情况下，缀合物不包含任何亲和配体。它们通常是在模板分子的存在下制备的交联聚合物。模板可以是与靶分子缀合的分子结构(螯合基如DOTA或DTPA衍生物)，或者是对靶分子具有或多或少特异性的特定结构(例如抗体结构)。
在另一实施方案中，基质被配体涂层，该配体表现出与欲从血液循环中清除的试剂(例如放射性抗Erb抗体)的特异性相互作用。此配体可选自单克隆抗体(包括其片段或工程化相似物)、适体、肽、寡聚脱氧核苷(包括其片段)、插入剂包括dyestof、寡糖和与结合于欲除去试剂的金属相互作用的螯合基。
在另一个实施方案中，亲和配体与抗Erb抗体连接，且吸附装置包含与亲和配体特异性结合的固定受体。任何类型的亲和配体/固定受体组合如“抗体和抗原/-半抗原”和“蛋白质和辅因子”可用于本申请，条件是，它们显示出对肿瘤标记的足够高的亲和力和选择性，并且亲和配体-受体相互作用不被接触免疫靶向剂和/或装置的血液或其它体液或组织所干扰。
在最优选的应用之一中，亲和配体/固定受体组合是生物素或生物素衍生物与生物素结合分子，具体而言，其中亲和配体是生物素或其衍生物且固定受体是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白或任何其它生物素结合分子。生物素/抗生物素蛋白和生物素/链霉抗生物素蛋白的亲和配体对通常与生物分子一起使用。生物素与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的非常强的相互作用(即K＝1013-1015M-1)(Green，Methods Enzymol.184，51-67，1990；Green，Adv.Prot.Chem.29，85-133，1975)是它们在大量体外或体内用途中的应用基础。本发明的其它应用是通过相同的体外步骤同时除去多种不同的生物素化的“抗癌药物”。
本发明的缀合物的一个实施方案部分如下图所示，其中抗Erb反应活性部分是曲妥单抗。
此1033-缀合物的结构要求包括含生物素部分(亲和配体)、生物素与分子其余部分之间的连接1、三功能交联部分、细胞毒剂结合部分、细胞毒结合部分与分子其余部分之间的连接2。1033-缀合物的结构要求基于功能需求可被分为三个部分。这三个部分是含生物素部分、细胞毒剂结合部分和三功能交联部分。式I显示了本发明缀合物(其上未结合有任何细胞毒剂)的通式。
式I用于结合金属放射性核素的包含曲妥单抗作为抗Erb抗体的本发明缀合物的通式
含生物素部分的结构要求在本文中，具有上述结构的含生物素部分(即亲和配体)有三个方面是重要的。它们是(1)生物素酰胺酶裂解的阻断；(2)高生物素结合亲和力的保留；和(3)合理水溶性的获得。为了提供这些属性，生物素缀合物必须包括生物素分子和偶联于交联部分的适宜连接。
生物素缀合物必须通过与戊酸侧链(n＝3)上的甲酸酯基的缀合来制备。在生物素分子的其它位置缀合则导致完全不能与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白结合。这可使得生物素分子对本申请是无用的。缀合的优选形式是与甲酸酯基形成酰氨键(如通式中所述)。因为生物素与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的结合在深口袋(例如9)中发生，缩短(n＜3)或增长(n＞3)戊酸侧链则导致结合亲和力较低，这不是本申请所期望的。
生物素酰胺酶活性的阻断通过在生物素酰胺的氨基或与该氨基邻近(即距离少于3个碳原子)的原子上连接适宜的取代基(即分别为R1和R2)来完成。生物素酰胺酶是裂解(水解)生物素羧酸酯缀合物的酰氨键的酶。这种酶在动物和人的生物素再循环中非常重要。生物素在(一些不同)蛋白质羧化酶中的代谢释放出生物素-ε-N-赖氨酸(生物胞素)，并且生物素酰胺酶特异性裂解酰氨键以释放出游离生物素。生物素酰胺酶还能够裂解(非特异性)其它生物素酰氨键。在本申请中，生物素酰胺酶不从缀合物中裂解出生物素是非常重要的，因为否则将无法获得所需效果。因此，有用的生物素缀合物结构加入阻断生物素酰胺酶的酶活性的官能团(R1或R2)。虽然对R1而言，任何结构均可能阻断生物素酰胺酶，但是其结构通常限制为甲基(CH3)，因为该基团完全阻断生物素酰胺酶活性。N-甲基显著降低生物素与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的结合亲和力，但是仍可用于本申请。对R1而言，较大基团(如乙基、芳基等)由于丧失结合亲和力而是无用的。具有取代基R1的替代选择是在邻近生物素酰胺的氨基的原子(如亚甲基)上具有取代基R2。体积更大和变化更多的取代基可用于此位置而对生物素的结合亲和力无显著影响。当R2是CH3或CH2CH3时生物素酰胺酶不完全被阻断，尽管裂解速率被减慢较大程度(例如分别减慢至25％和10％)。当R2是-CH2OH和-CO2H官能团时生物素酰胺酶活性被完全阻断。当为-CH2OH(羟甲基)官能团时，可通过引入丝氨酰基来完成此阻断。当为CO2H(羧基)官能团时，可通过引入α或β天冬氨酰基来完成此阻断。重要的见解是，当引入这些基团作为R2时结合亲和力没有降低。还可使用较大官能团作为R2来阻断生物素酰胺酶活性，但是会降低结合亲和力。如果较大官能团作为R2引入时引起的结合亲和力降低不高于当R1是CH3时引起的结合亲和力降低，则它们可用于本申请。
式I结构中生物素部分的生物素亲和力和水溶性受所用连接部分的影响。连接部分(连接1)的长度和性质在某种程度上取决于与之缀合的分子的性质。连接部分可用于提供生物素部分与缀合物其余部分之间的间隔，以使生物素结合不受蛋白质(或其它缀合分子)位阻的影响。连接1的长度(线性链的原子数目)可由o＝4-20(对与小分子如类固醇的缀合物而言)变化至o＞20(对大分子缀合物如IgG分子而言)。也可改变连接1中(其线性链或其支链中)的原子性质以增加水溶性。例如，通过引入氧或硫原子(形成醚或硫醚)或通过连接可电离官能团(例如磺酸根、甲酸根、氨基或铵基)来改善含有多于4个亚甲基单元的连接。
细胞毒剂结合部分的结构要求多种放射性核素螯合剂和键合剂可用于式I结构。在式I中，使用“苄基-DOTA”部分作为举例。根据细胞毒剂结合部分的性质，需要有连接部分(连接2)。一些放射性核素螯合和/或键合部分为低水溶性，所以加入包含改善水溶性的官能团的连接分子是重要的。在DOTA螯合剂中，连接部分的主要功能是改善缀合分子的水溶性。改变连接2(其线性链或其支链中)的原子性质来增加水溶性。例如，通过引入氧或硫原子(形成醚或硫醚)或通过连接可电离官能团(例如磺酸根、甲酸根、氨基或铵基)来改善含有多于4个亚甲基单元的连接。连接2的长度(线性链的原子数目)也可根据其中引入的杂原子或在直链上连接的官能团的性质来改变(例如p＝1-20)。
三功能交联部分的结构要求多种三功能分子可用作交联部分。任何具有三个可与连接(连接1和2)上和蛋白质上的官能团反应的官能团的分子都是三功能交联部分的备选。除三功能交联部分不赋予例如式I结构在水溶液中的不溶解性外，对三功能交联分子的唯一的其它结构限制是，该结构应当是可以以这样的方式进行修饰的结构允许依次加入含生物素部分、细胞毒剂结合部分，并与抗Erb抗体缀合。例如，在1033结构中使用三功能化苯环(氨基间苯二甲酸)。
优选结构，1033-曲妥单抗，如下式II所示，其中n＝3、o＝3、p＝3、R1＝H且R2＝COOH(未结合任何细胞毒剂)。
式II1033-曲妥单抗的具体结构
本发明缀合物的具体实例为177Lu-1033-曲妥单抗，即177Lu-3-(13’-硫脲苄基-DOTA)三氧杂二胺-1-(13”-生物素-Asp-OH)三氧杂二胺-5-异氰硫基-氨基异酞酸酯-曲妥单抗；90Y-1033-曲妥单抗；111In-1033-曲妥单抗；1033-曲妥单抗，其中硫脲苄基-DOTA已被maytansinoid替换；和1033-曲妥单抗，其中硫脲苄基-DOTA已被多柔比星替换。
在本发明的另一实施方案中，缀合物中包括不止一个、优选两个亲和配体和/或不止一个、优选两个细胞毒剂。在此情况下，交联部分不止是三功能基的。
实施例下述实施例不应被解释为限制本发明，而应当被看作本发明的可实施性的证据。
实施例1曲妥单抗的缀合及放射性标记在本实施例和随后的实施例中，铟-111在一些实例下被用于替换钇-90，因为前者是γ-放射源且具有比钇-90小的放射危害。将单克隆抗体曲妥单抗与3-(13’-硫脲苄基-DOTA)三氧杂二胺-1-(13”-生物素-Asp-OH)三氧杂二胺-5-异氰硫基-氨基异酞酸酯(MitraTagTM-1033)(下文还简称为1033)采用Wilbur D.S等人在Bioconjuagte Chem.131079-1092，2002中所述的方法缀合。将10mg单克隆抗体用1升不含金属的HEPES于4℃透析3天，更换3次缓冲液。制备MitraTagTM-1033(800μg)的水溶液，加入抗体溶液中。于室温温育过夜后，将抗体缀合物用1升不含金属的250mM乙酸液缓冲液(pH5.3)于4℃透析4天，最少更换4次缓冲液。通过HABA法测定每单克隆抗体的MitraTagTM-1033平均数目为2.2。将去金属化的缀合抗体于4-8℃储存至用于放射性标记试验。
将在250mM乙酸铵(pH5.3)中的2mg(400μl) 1033-抗体与30μl溶于40mM盐酸中的待研究放射性核素(111InCl3；90YCl3；177LuCl3)混合。于45℃进行标记15分钟。加入43μl DTPA以终止反应。通过TLC和HPLC测定放射性缀合物的量。
实施例21033-缀合的曲妥单抗与抗生物素蛋白吸附剂的结合采用微型柱分析与MitraDep装置中采用的抗生物素蛋白吸附剂结合的111In-标记的1033-曲妥单抗放射性缀合物级分。经放射性标记的1033-缀合物样品中有约97％放射性通过抗生物素蛋白吸附剂与微型柱结合。
实施例3与靶抗原结合的亲和力分析采用竞争性抑制分析研究了缀合过程对曲妥单抗与靶抗原的亲和力(强度)的影响。简言之，将增加量的曲妥单抗与恒定量的111In-标记的1033-曲妥单抗混合。将混合物加入96孔板中的固定SK-BR3细胞中。于室温温育2小时后，洗涤孔，在自动NaI(T1)闪烁细胞计数器中测定与细胞结合的放射性。
将结合的放射性的量对曲妥单抗浓度作图(图1)，计算50％抑制所需的浓度(IC50)。IC50是所测试抗体的相对亲和力的度量；亲和力降低被看作是IC50浓度增加。亲和力的显著变化通常表明IC50的差异应当至少是10-倍。
1μg/ml(6.7nM)111In-1033-曲妥单抗被0.03-500μg/ml“冷”的未缀合曲妥单抗抑制。所测定的IC50是0.4μg/ml(2.5nM)。由IC50计算解离常数为0.3nM。根据曲妥单抗的生产商出版的信息，解离常数为0.1nM。
亲和力的略微降低被看作是由于1033-曲妥单抗缀合物。已经在临床研究中证明，亲和力的10-倍差异不会导致肿瘤摄取的任何显著差异。因此，得出如下结论每抗体至多2.2个缀合物的曲妥单抗的缀合将不会削减抗体的体内结合性质。
实施例4曲妥单抗的MitraTagTM-1033缀合物的药动学将111In-1033-曲妥单抗的药动学和生物分布数据与用111In-1033-利妥昔单抗所获得的数据进行比较，作为该放射性缀合物可得的临床数据。将这两种抗体人源化为人单克隆IgG1抗体。
将15只Spraque Dawley品系大鼠静脉内注射约100μg/大鼠的用3-4MBq111In标记的1033-抗体缀合物。
采用配有中等能量平行光管的闪烁照相机(General Electric 400T，GE，密尔沃基，WI，USA)进行全身(WB)成像。将图像保存并用Nuclear MAC2.7软件进行分析。由该图像获得全身的总计数。经放射性衰变校正和减去背景后，将计数用于计算身体的活性滞留(％)。见图2。
当把111In-1033-曲妥单抗的全身滞留与111In-1033-利妥昔单抗的全身滞留相比时，没有观察到显著差异。
为了定义111In-1033-曲妥单抗的药动学和与111In-1033-利妥昔单抗比较，在以下时间从眼眶静脉从取约0.2ml血样注射后10分钟、2.5小时、8小时、24小时、48小时和96小时。在自动NaI(T1)井式闪烁计数器中测量放射性，以占所注射活性的百分数/克血液(％/g)表示，经111In衰变校正(图3)。当把111In-1033-曲妥单抗的血清除率与111In-1033-利妥昔单抗的血清除率相比时，没有观察到显著差异。
实施例5缀合物在器官和组织中的生物分布在注射后2.5、8、24、48和96小时进行解剖，移去感兴趣的器官和组织，称重并测定放射性含量。在自动NaI(T1)井式闪烁计数器中测量放射性，将计数经衰变校正。将各器官的分布与111In-1033-利妥昔单抗相比。所注射活性的分布如图4(111In-1033-曲妥单抗)和图5(111In-1033-利妥昔单抗)所示。
111In-1033-曲妥单抗与111In-1033-利妥昔单抗相比，观察到在肾脏和肺中有较高摄取，在肺有较低摄取。111In-1033-曲妥单抗在肺中的较高摄取主要在注射后不久观察到，在48小时后约同一水平时结束。
实施例6根据本发明的优选实施方案用90Y/111In-曲妥单抗治疗表达HER-2的乳癌的方案·在第0天，所有患者接受1-4mg/kg体重的曲妥单抗，随后立即接受治疗剂量的90Y-1033-曲妥单抗(＞10MBq/kg体重)。患者可任选施用100-150MBq/m2体表(1.1-3.9mCi/m2体表)剂量的111In-1033-曲妥单抗，其将用于成像和剂量学。
·在第1-3天的一个时期，患者用MitraDep处理，使至少3个血容量穿过MitraDep装置。
·任选以及作为一种安全措施的是，在施用90Y-1033-曲妥单抗之前，收集骨髓以便如果需要的话允许骨髓复苏。
·任选的是，一年中用90Y-1033-曲妥单抗重复治疗2-6次，在最优选的实施方案中一年重复2-4次，前提是没有出现剂量限制性毒性并且患者就放射毒性而言从以前的治疗中已经恢复。
·任选的是，患者在接受90Y-1033-曲妥单抗之前或之后接受治疗和亚治疗剂量的曲妥单抗(Herceptin)和/或曲妥单抗(Herceptin)的给予与90Y-1033-曲妥单抗的施用相伴随。
实施例7根据本发明的另一优选实施方案用177Lu-曲妥单抗治疗表达HER-2的乳癌的方案·在第-7至-1天，所有患者一次接受6-8mg/kg体重的曲妥单抗。
·在第0天，患者接受治疗剂量的177Lu-1033-曲妥单抗(＞555MBq/m2体表)。对成像和剂量学而言，患者可任选通过免疫闪烁显像进行研究。
·在第1-4天的一个时期，患者用MitraDep处理，使至少3个血容量穿过MitraDep装置。
·任选以及作为一种安全措施的是，在施用177Lu-1033-曲妥单抗之前，收集骨髓以便如果需要的话允许骨髓复苏。
·任选的是，一年中用177Lu-1033-曲妥单抗重复治疗2-6次，在最优选的实施方案中一年重复2-4次，前提是没有出现剂量限制性毒性并且患者就放射毒性而言从以前的治疗中已经恢复。
·任选的是，患者在接受177Lu-1033-曲妥单抗之前或之后接受治疗和亚治疗剂量的曲妥单抗(Herceptin)和/或曲妥单抗(Herceptin)的给予与177Lu-1033-曲妥单抗的施用直接相伴随。
权利要求
1.缀合物，包含a)三功能交联部分，其偶联有b)亲和配体，经由连接1连接；c)细胞毒剂，任选经由连接2连接；和d)抗Erb抗体或其变体，其能够与哺乳动物肿瘤表面上表达的Erb抗原结合，亲和结合常数至少为5×106M-1，其中亲和配体是生物素，或者是具有与生物素基本相同的结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的功能的生物素衍生物，其中有关生物素酰氢键的酶裂解的稳定性已经在连接1中引入。
2.根据权利要求1的缀合物，其中抗Erb抗体或其变体针对哺乳动物肿瘤表面表达的Erb1、Erb2、Erb3和/或Erb4抗原。
3.根据权利要求1或2的缀合物，其中抗Erb抗体变体是当与Erb抗原结合时具有相同或基本相似的为至少5×106M-1的亲和结合常数的任何抗Erb抗体的变形、片段或衍生物，所述的片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab″)和Fv片段；双抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
4.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中抗Erb抗体经连接3与三功能交联部分偶联，且其中在连接3与抗Erb抗体之间形成的键是共价键或非共价键，亲和结合常数为至少5×108M-1。
5.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中细胞毒剂是放射性核素、化疗药物、合成或天然产生的毒素、免疫抑制或免疫刺激剂、放射增敏剂、X射线或MRI或超声的增强剂、在载有非放射性元素的抗Erb抗体已经聚集至特定细胞或组织后可通过外照射转换为放射性元素的该非放射性元素，或者光敏化合物或用于照片成像或光动力疗法的化合物，或者直接或间接对癌细胞或癌组织具有相同或相似作用的任何其它分子。
6.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中细胞毒剂是放射性核素、化疗药物或毒素。
7.根据权利要求6的缀合物，其中细胞毒剂是放射性核素且经细胞毒剂结合部分与三功能交联部分结合。
8.根据权利要求7的缀合物，其中细胞毒剂结合部分对卤素放射性核素而言形成芳基卤化物和乙烯基卤化物，并且对Tc和Re放射性核素而言包含N2S2和N3S螯合剂，对In、Y、Pb、Bi、Cu、Sm和Lu放射性核素而言，氨基-羧基衍生物，优选EDTA、三亚乙基四胺六乙酸和DTPA或其衍生物，其中DTPA衍生物为Me-DTPA、CITC-DTPA和环己基-DTPA，以及环胺，优选NOTA、DOTA和TETA，及其衍生物，或者是能够与所述螫合剂形成复合物的任何其它放射性核素。
9.根据权利要求7和8的缀合物，其中在细胞毒剂结合部分中包含DOTA，且细胞毒剂是用于治疗应用的90Y或用于诊断应用的111In。
10.根据权利要求6和7的缀合物，其中细胞毒剂结合部分包含DOTA，且细胞毒剂是用于诊断和治疗应用两者的177Lu。
11.根据权利要求10的缀合物，其中放射性核素是β射线放射源，优选钪-46、钪-47、钪-48、铜-67、镓-72、镓-73、钇-90、钌-97、钯-100、铑-101、钯-109、钐-153、镥-177、铼-186、铼-188、铼-189、金-198和镭-212；γ放射源，优选碘-131、镥-177和铟-m 114；或者α射线放射材料，优选铋-212、铋-213和砹-211；以及正电子发射源，优选镓-68和锆-89；其中化疗药物是阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、Cytoxin、紫杉醇、甲氨喋呤、顺铂、苯丙氨酸氮芥、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、Duanomysin、洋红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins、Maytansinoid、苯丙氨酸氮芥和其它相关氮芥；且其中毒素是细菌、真菌、植物或动物来源的活性毒素或其片段。
12.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中亲和配体是与下列部分特异性结合的部分抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的任何其它衍生物、突变体或片段，其中所述的任何其它衍生物、突变体或片段具有基本相同的与该亲和配体结合的功能。
13.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中生物素衍生物选自降生物素(norbiotin)、高生物素、氧化生物素、亚氨基生物素、脱硫生物素(destibiotin)、二氢基生物素、生物素亚砜和生物素砜，或者其具有基本相同的结合功能、优选亲和结合常数为至少109M-1的结合功能的衍生物。
14.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中三功能交联部分选自三氨基苯、三羧基苯、二羧基苯胺和二氨基苯甲酸。
15.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中连接1用作三功能交联部分与亲和配体、优选生物素部分之间的连接部分和间隔，以便与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白或任意其它生物素结合部分的结合不被位阻减弱。
16.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中连接1含有键合氢的原子，优选醚或硫醚，或者可电离基团，优选甲酸根、磺酸根或铵基，以有助于生物素部分的水溶性。
17.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中有关生物素酰氨键的酶裂解、优选是对抗生物素酰胺酶裂解以释放出生物素的稳定性已经通过在生物素酰胺的氨基上引入甲基或者在与生物素酰胺的氨基邻近、优选距离少于3个碳原子的原子上引入α甲酸酯基、羟甲基或甲基而提供。
18.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中连接2提供长度为1-25个、优选6-18个原子的间隔。
19.根据权利要求18的缀合物，其中连接2含有键合氢的原子，优选醚或硫醚，或者可电离基团，以有助于水溶性。
20.根据权利要求1-17中任一项的缀合物，其中连接2被排除。
21.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中连接3提供长度为1-25个、优选6-18个原子或原子团的间隔。
22.根据权利要求21的缀合物，其中连接3含有键合氢的原子，优选醚或硫醚，或者可电离基团，优选甲酸根、磺酸根或铵基，以有助于水溶性。
23.根据权利要求1-3和5-20中任一项的缀合物，其中连接3被排除。
24.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中也结合不止一个、优选两个亲和配体和/或不止一个、优选两个细胞毒剂。
25.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中缀合物的a)-c)部分平均2-4个、优选2.5-3.5个分子与每个抗Erb抗体连接。
26.根据前述权利要求中任一项的缀合物，其中它是 其中，n是2-4，o是1-6，p是1-6，R1是H，且R2是-COOH，并且其中n优选是3，o优选是3，且p优选是3，经细胞毒剂结合部分与细胞毒剂结合。
27.根据权利要求1-25中任一项的缀合物，其中它是177Lu-1033-曲妥单抗，即177Lu-3-(13’-硫脲苄基-DOTA)三氧杂二胺-1-(13”-生物素-Asp-OH)三氧杂二胺-5-异氰硫基-氨基异酞酸酯-曲妥单抗；90Y-1033-曲妥单抗；111In-1033-曲妥单抗；1033-曲妥单抗，其中硫脲苄基-DOTA已被maytansinoid替换；和1033-曲妥单抗，其中硫脲苄基-DOTA已被多柔比星替换。
28.医药组合物，其中它包含权利要求1-27中任一项的缀合物以及可药用赋形剂。
29.根据权利要求28的医药组合物，其中赋形剂是用于经胃肠道外施用、优选经静脉内施用的溶液。
30.药盒，用于体外除去或至少是减少哺乳动物宿主的血浆或全血中的未结合组织的如权利要求28和29中任一项所定义的医药组合物，其中所述的医药组合物包含权利要求1-26中任一项的缀合物，且其中所述的医药组合物已预先引入所述哺乳动物宿主的体内并在其中保持一段时间，以通过附着其上来浓缩至特定组织或细胞，所述药盒包含a)所述医药组合物，和b)包含固定受体的体外装置，缀合物的亲和配体与所述固定受体结合。
31.根据权利要求30的药盒，其中它包含抗体和抗原/半抗原或者蛋白质和辅因子作为亲和配体/固定受体组合，优选生物素或生物素衍生物作为亲和配体且抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白作为固定受体。
32.根据权利要求30的药盒，其中医药组合物的缀合物中不存在亲和配体，且固定受体是与缀合物相互作用的分子印迹聚合物。
33.治疗在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中给需要其的哺乳动物施用权利要求28和29中任一项的医药组合物。
34.根据权利要求33的方法，其中所述癌症是乳癌或卵巢癌。
35.根据权利要求33和34的方法，其中所述癌症是乳癌，优选是Erb2型乳癌。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中以10-20MBq/kg体重、优选11-15MBq/kg体重的剂量给哺乳动物宿主施用含有90Y作为细胞毒剂的权利要求28和29的医药组合物。
37.根据权利要求33-35中任一项的方法，其中剂量高于20MBq/kg体重的含有90Y作为细胞毒剂的权利要求28和29的药物施用于哺乳动物宿主，连同采用重构骨髓或降低对骨髓的辐射效应的方法。
38.诊断在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中给哺乳动物宿主施用权利要求28和29中任一项的医药组合物。
39.根据权利要求38的方法，其中所述癌症是乳癌或卵巢癌。
40.根据权利要求38和39的方法，其中所述癌症是乳癌，优选是Erb2型乳癌。
41.根据权利要求38-40中任一项的方法，其中111In以50-200MBq/m2体表、优选100-150MBq/m2体表的剂量施用于哺乳动物宿主。
42.治疗和诊断在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中给哺乳动物宿主施用剂量为50-200MBq/m2体表、优选100-150MBq/m2体表的含有111In的权利要求28和29的医药组合物以及剂量为10-20MBq/kg体重、优选11-15MBq/kg体重的含有90Y作为细胞毒剂的权利要求28和29的医药组合物。
43.治疗和诊断在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中给哺乳动物宿主施用剂量为100-150MBq/m2体表的含有111In的权利要求28和29的医药组合物以及剂量＞20MBq/kg体重的含有90Y作为细胞毒剂的权利要求28和29的医药组合物，以所述顺序间隔6-8天依次施用或者同时施用。
44.治疗和诊断在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中给哺乳动物宿主施用单次剂量为555-2220MBq/m2体表、优选1000-2000MBq/m2体表的含有177Lu作为细胞毒剂的权利要求28和29的医药组合物。
45.治疗和诊断在哺乳动物宿主的肿瘤细胞表面表达Erb基因产物的癌症的方法，其中单次剂量高于2220MBq/m2体表的含有177Lu作为细胞毒剂的权利要求28和29的医药组合物施用于哺乳动物宿主，连同采用重构骨髓或降低对骨髓的辐射效应的方法。
全文摘要
缀合物，a)三功能交联部分，其偶联有b)亲和配体，经由连接1连接；c)细胞毒剂，任选经由连接2连接；和d)抗Erb抗体或其变体，其能够与哺乳动物肿瘤表面上表达的Erb抗原结合，亲和结合常数至少为5×10
文档编号C07K17/00GK1905900SQ200480041118
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2003年11月28日
发明者B·E·B·桑德伯格, R·尼尔松 申请人:米特拉医药股份公司