新的IgE表位的鉴别的制作方法

专利名称：新的IgE表位的鉴别的制作方法
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背景技术：
变态反应(allergy)是由对外源因素如变应原(allergen)过大的免疫应答所诱导的过敏状态。特征在于与变应原接触后立即发生变态反应的速发型超敏反应(I型)是由B细胞介导的，并且基于抗原-抗体反应。迟发型超敏反应是由T细胞介导的，并且基于细胞免疫性机制。近年来，术语“变态反应”越来越成为I型超敏反应的同义词。
速发型超敏反应是基于B细胞产生E型免疫球蛋白(IgE抗体)的一种应答，所述B细胞暴露于变应原而分化为分泌抗体的浆细胞。IgE诱导的反应是在变应原进入机体的部位，即在粘膜表面和/或在局部淋巴结，发生的局部事件。局部产生的IgE首先使得局部肥大细胞敏感，即IgE抗体将其恒定区与肥大细胞表面上的Fcε受体结合，然后“溢出(spill-over)”IgE进入循环并与整个机体的循环中的嗜碱细胞和组织固定的肥大细胞上的受体结合。当结合的IgE随后与变应原接触时，Fcε受体通过变应原的结合而交联，导致细胞脱粒并释出许多变态反应介质，如组胺、前列腺素、白细胞三烯等等。这些物质的释放造成速发型超敏反应的典型临床症状，所述临床症状即呼吸道或肠道平滑肌收缩、小血管扩张及其对水和血浆蛋白的通透性增加、粘液分泌(导致例如变态反应性鼻炎、特应性湿疹和哮喘)、以及对皮肤神经末梢的刺激导致瘙痒和疼痛。另外，基于与变应原二次接触的反应是加强的，因为在首次与变应原接触后，通过在细胞表面上表达IgE，一些B细胞形成表面IgE阳性B细胞(sIgE+B细胞)的“记忆库(memorypool)”。
IgE有两种主要受体高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体FcεRII。FcεRI主要在肥大细胞和嗜碱细胞表面表达，但在人朗格汉斯细胞、树突细胞和单核细胞上也发现低水平的FcεRI，在此其发挥IgE-介导的变应原呈递作用。另外，有报道在人嗜酸性粒细胞和血小板上发现FcεRI(Hasegawa，S.et al.，Hematopoiesis，1999，932543-2551)。在B细胞、T细胞或嗜中性粒细胞上未发现FcεRI。FcεRI在朗格汉斯细胞和皮肤树突细胞上的表达对于变应性个体中IgE结合的抗原呈递在功能上和生物学上都是重要的(Klubal R.et al.，J.Invest.Dermatol.1997，108(3)336-42)。
低亲和力受体FcεRII(CD23)是一种凝集素样分子，包含三个相同的亚基，其具有从细胞质膜伸出的长α-螺旋卷曲茎结构(stalk)延伸的头结构(head structure)(Dierks，A.E.etal.，J.Immunol.1993，1502372-2382)。在与IgE结合的基础上，FceRII与B细胞上的CD21结合，参与IgE合成的调节(Sanon，A.et al.，J.Allergy Clin.Immunol.1990，86333-344，Bonnefoy，J.et al.，Eur.Resp.J.1996，963s-66s)。FcεRII长期以来被认为用于变应原呈递(Sutton and Gould，1993，Nature，366421-428)。与上皮细胞上的FcεRII结合的IgE导致特异性快速变应原呈递(Yang，P.P.，J.Clin.Invest.，2000，106879-886)。FcεRII存在于一些细胞类型上，包括B细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、天然杀伤细胞、T细胞、滤泡树突细胞和朗格汉斯细胞。
已经鉴别了与FcεRI和FcεRII相互作用的IgE分子上的结构实体。诱变研究表明CH3结构域介导IgE与FcεRI(Presta et al.，J.Biol.Chem.1994，26926368-26373；Henry A.J.et al.，Biochemistry，1997，3615568-15578)和FcεRII(Sutton and Gould，Nature，1993，366421-428；Shi，J.et al.，Biochemistry，1997，362112-2122)的相互作用。高亲和力和低亲和力受体的结合位点均沿着经由两个CH3结构域的中心旋转轴而对称定位。FcεRI结合位点位于接近CH2结构域连接处的外侧的CH3结构域中，而FcεRII结合位点位于CH3的羧基末端。
治疗变态反应的一个有希望的概念包括应用单克隆抗体，所述抗体是IgE同种型特异性的，并因此能结合IgE。这个方案基于通过减量调节IgE免疫应答而对变态反应进行抑制，所述免疫应答是诱导变态反应最早出现的事件并使得变态反应状态得以维持。由于其他抗体类别的应答不受影响，因此得以实现对变态反应症状的即时和长期作用。对人嗜碱细胞密度的早期研究示出患者血浆中IgE水平与每个嗜碱细胞的FcεRI受体数目之间的关系(Malveaux et al.，J.Clin.Invest.，1978，62176)。他们注意到变态反应和非变态反应人中的FcεRI密度为每个嗜碱细胞104-106个受体。后来示出用抗IgE治疗变态反应疾病使得循环中IgE的数量降低至治疗前水平的1％(MacGlashan et al.，J.Immunol.，1997，1581438-1445)。MacGlashan分析了得自用完整抗IgE抗体(其结合在患者血清中循环的游离IgE)治疗的患者的血清。他们报道了降低患者的循环IgE水平导致嗜碱细胞表面上存在的受体数目降低。因此，他们设想嗜碱细胞和肥大细胞表面上的FcεRI的密度受到循环IgE抗体水平的直接或间接调节。
最近，WO 99/62550公开了IgE分子及片段的应用，这些IgE分子及片段结合FcεRI和FcεRII的IgE结合位点以阻断IgE与受体的结合。然而，对这些变态反应疾病的不具有有害副作用的有效治疗方法还很有限。治疗变态反应疾病的一种治疗方法包括使用人源化抗IgE抗体治疗变应性鼻炎和哮喘(Corne，J.et al.，J.Clin.Invest.1997，99879-887；Racine-Poon，A.et al.，Clin.Pharmcol.Ther.1997，62675-690；Fahy，J.V.et al.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.1997，1551824-1834；Boulet，L.P.et al.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.，1997，1551835-1840；Milgrom，E.et al.，N.Engl.J.Med.，1999，3411966-1973)。这些临床数据表明抑制IgE与其受体的结合是治疗变态反应疾病的一种有效方法。
适合作为抗变态反应剂的抗体应与分化为产生IgE的浆细胞的表面IgE阳性B细胞反应，由此可用于功能性地消除那些B细胞。然而，原则上IgE的抗体也可以通过交联Fcε受体而诱导从IgE敏化的肥大细胞中释放介质，由此拮抗对血清IgE和sIgE+B细胞水平发挥的有益作用。开发抗IgE治疗的一种潜在危险问题是治疗性抗体与已经与高亲和力受体结合的IgE的结合引起IgE交联并激发组胺释放导致潜在的过敏反应的可能性。
因此，可用于治疗变态反应的抗体必须不能与敏化的肥大细胞和嗜碱细胞上结合的IgE反应，但应该保留识别sIgE+B细胞的能力。这种IgE同种型特异性抗体已经由Chang等(Biotechnology 8，122-126(1990))在欧洲专利No.EP0407392及一些美国专利例如美国专利No.5,449,760中描述。
用于产生抗IgE抗体的肽也具有诱导致敏抗体的危险。如果在免疫期间产生的抗体结合与高亲和力IgE受体结合的IgE，或是通过其他机制，在主动免疫期间抗IgE抗体的产生也许能以与被动给予抗IgE抗体同样的方式激发组胺释放。
因此，需要特异性结合IgE但不结合已经与其高亲和力受体结合的IgE的较高亲和力的非致敏抗体，以及不诱导致敏抗体的用于主动免疫的肽。本发明人鉴别了IgE的特异性表位，其以高亲和力结合抗体但不结合肥大细胞或嗜碱细胞上的IgE。这些特异性表位接下来可用于产生特异性肽，以用于主动免疫以产生仅与IgE的结合受体的区域结合的IgE抗体，从而保证所述抗体与已经与受体结合的IgE不交联，并因此是非致敏性的。
发明概述本发明涉及衍生自IgE的CH3结构域的新的肽表位。这些肽表位被特异性结合IgE的高亲和力抗体识别。可以通过给予哺乳动物这些新的肽以在体内产生高亲和力抗体而将这些新的肽用于哺乳动物的主动免疫亲和力。所述肽表位也可用于在非人宿主体内产生特异性结合这些IgE区域的高亲和力抗IgE抗体，并使用所得抗体被动免疫哺乳动物。
本发明的一种免疫原(表位A，

图11)包含如下氨基酸序列Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa(SEQ ID NO.72)表位A的一个实例是Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro(SEQ ID NO.73)另一种免疫原(表位B，图11)包含如下氨基酸序列Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa(SEQ ID NO.74)。
表位B的例子包括Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO.75)His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO 76)Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr(SEQ ID NO 77)。
在SEQ ID NO72或SEQ ID NO74中，Xaa可以是任何氨基酸。
这些肽可包含在组合物中，所述组合物包含至少一种所述肽及一种生理学可接受的载体、稀释剂、稳定剂或赋形剂，以及一种免疫原性载体。所述免疫原性载体可以是例如BSA、KLH、破伤风类毒素和白喉类毒素。本发明还涉及编码SEQ ID NO.72-77的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、及含有所述载体的细胞。
本发明还涉及特异性结合表位A和/或表位B的抗体。本发明还涉及一种产生特异性结合表位A和/或表位B的抗体的方法。
本发明涉及给予患有IgE介导的疾病或病变的对象包含SEQ IDNO72和/或SEQ ID NO74的肽。
本发明涉及给予患有IgE介导的疾病或病变的哺乳动物用包含SEQ ID NO72和/或SEQ ID NO.74的肽产生的高亲和力抗体。所述高亲和力抗体可以是人抗体、人源化抗体或者嵌合抗体。所述抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。这种IgE介导的疾病或病变包括例如哮喘、特应性皮炎、风疹、变应性鼻炎和湿疹。
附图简述图1是抗体克隆和筛选中所用的噬菌体载体的示意图。
图2是用于产生抗体变体的寡核苷酸的示意图。
图3A示出鼠抗IgE抗体TES-C21的轻链与组合的人模板L16和JK4的对比。
图3B示出TES-C21的重链与组合的人模板DP88和JH4b的对比。
图4示出与亲代TES-C21相比具有高亲和力的构架残基变体的列表。
图5A和B示出与亲代TES-C21的Fab和阴性对照组(5D12)相比，克隆4、49、72、78和136的ELISA滴定曲线。
图6示出与亲代TES-C21和阴性对照抗体相比，克隆2C、5A和5I的抑制测定。
图7A示出具有导致对IgE具有更高亲和力的有益突变组合的克隆的序列。
图8A和8B示出克隆136、1、2、4、8、13、15、21、30、31、35、43、44、53、81、90和113的完整轻链可变区的构架序列。
图9A和9B示出35个克隆的完整重链可变区的构架序列。
图10A-F示出克隆136、2C、5I、5A、2B和1136-2C的完整重链和轻链序列。
图11示出人IgE的CH3区域氨基酸序列并标出表位“A”和表位“B”。
图12示出用于鉴别表位B的重叠肽。
图13示出表位A的结合区中重要残基的鉴别。
图14示出表位B的结合区中重要残基的鉴别。
图15示出结合突变肽的MAb的western印迹分析。
图16示出在表达人IgE的转基因动物中抗IgE抗体的产生。
发明详述定义本申请中使用的术语具有本领域技术人员通常和典型理解的含义。然而申请人希望如下术语具有下文特定的解释。
关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同”可以解释为抗体链与参考多肽序列呈现至少70％或者80％或者90％或者95％的序列相同性。关于核酸序列该术语可以解释为核苷酸的序列与参考核酸序列呈现至少大约85％或者90％或者95％或者97％序列相同性。
术语“相同性”或者“同源性”应解释为在对序列进行排列对比并导入缺口(如果需要达到完整序列的最大百分比相同性)、并且不认为任何保守取代是序列相同性的一部分之后，候选序列中与与其相对比的相应序列的残基相同的氨基酸残基的百分比。N或C末端延伸或者插入均不认为降低相同性或同源性。本领域熟知进行序列排列对比的方法和计算机程序。序列相同性可以使用序列分析软件测定。
术语“抗体”以最广泛的含义应用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多重特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体呈现对特异性靶的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体及缺乏靶特异性的其它抗体样分子。天然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个重链在一端具有一个可变区(VH)，随后是一些恒定区。每个轻链在一端具有一个可变区(VL)，在另一端具有一个恒定区。“高亲和力”抗体是指具有至少10-10、优选10-12结合亲和力的那些抗体。
如本文所用，“抗人IgE抗体”是指以抑制或者大大降低IgE与高亲和力受体FcεRI结合的方式结合人IgE的抗体。
关于抗体的可变区中的术语“可变”是指可变区的某些部分在抗体的序列中广泛不同，并且是每个特定抗体与其特定靶的结合和特异性所依据的。然而，可变性在抗体的可变区中不是均匀分布的。其集中在称作互补决定区(CDR)的三个节段中，CDR也称作超变区，它们在轻链和重链可变区中均存在。可变区的较高度保守的部分称作构架(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR区，主要是采取β-折叠构型，由三个CDR相连，形成环与β-折叠结构相连，在一些情况中这些环构成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR均通过FR区紧密连接在一起，并且与其它链的CDR一起形成抗体的靶结合位点(见Kabat等所述)。如本文所用，除非特别指出，免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行(Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute ofHealth，Bethesda，Md.1987)。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是靶定结合区或者可变区。抗体片段例如包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。短语抗体的“功能片段或者类似物”是具有与全长抗体同样性质的生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能片段或类似物是以阻止或大大降低IgE免疫球蛋白分子结合高亲和力受体FcεRI的能力的方式结合IgE免疫球蛋白。如本文所用，关于抗体的“功能片段”是指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧邻的非共价结合的一个重链和一个轻链可变区组成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在这种构型中，每个可变区的三个CDR互相作用而限定了VH-VL二聚体表面上的靶结合位点。总之，六个CDR使抗体具有靶结合特异性。然而，即使一个单一可变区(或者仅包含特异于靶的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合靶的能力，但是亲和力比完整的结合位点低。“单链Fv”或者“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条单多肽链中。通常地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一个多肽接头，其使得sFv形成用于靶结合的希望的结构。
Fab片段含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端加上几个残基、包括来自抗体绞链区的一或多个半胱氨酸。F(ab′)片段是通过裂解F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的绞链半胱氨酸的二硫键而产生的。本领域技术人员已知抗体片段的其它化学偶联方式。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含除了可能以很小量存在的天然发生的突变之外是相同的各个抗体。单克隆抗体是针对单一靶位点的高度特异性的抗体。另外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体均针对靶上的一个单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势是可以通过杂交瘤培养而合成，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体得自基本上同质的抗体群的这一特征，而不是指需要通过任何特殊方法产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过使用熟知的技术分离自噬菌体抗体文库。根据本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein，Nature 256，495(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组方法产生。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2片段或者其它结合靶的亚序列)。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的至少一个、典型两个可变区，其中所有或者基本上所有CDR区域均相应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或者基本上所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体也可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型是所选择的人免疫球蛋白模板的至少一部分免疫球蛋白恒定区。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括后代。也应理解由于有意或无意的突变导致所有后代的DNA内容不必完全相同。本发明包括具有与在最初转化细胞中筛选的相同的功能或者生物学性质的变体后代。本发明使用的“宿主细胞”通常是原核宿主或者真核宿主。
“用DNA转化细胞生物体”是指将DNA导入生物体中，由此该DNA可以作为染色体外元件或者通过染色体整合而复制。“用DNA转染细胞生物体”是指细胞或者生物体摄取DNA例如表达载体，而无论任何编码序列事实上是否被表达。术语“转染的宿主细胞”和“转化的宿主细胞”是指其中导入了DNA的细胞。所述细胞称为“宿主细胞”，其可以是原核细胞或者真核细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物如中国仓鼠卵巢细胞或者人源细胞。导入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或者来自与宿主细胞不同的物种，或者可以是杂交体DNA序列，含有一些外源和一些同源DNA。
术语“载体”是指一种DNA构建体，其含有与能使得所述DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列可操纵地连接的DNA序列。这些控制序列包括进行转录的启动子、任选控制这种转录的操纵子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或者仅仅是潜在的基因组插入体。一旦转化进合适的宿主，所述载体可以复制并且与宿主基因组无关地发挥功能，或者在一些情况中整合进基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明包括发挥同样功能的其它形式载体，这些形式为本领域所已知或者变得为本领域所已知。
“控制序列”是指在特定的宿主生物体中表达可操纵地连接的编码序列所必需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列、及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。如果其作为参与所述多肽分泌的前蛋白而被表达，则前序列(presequence)或者分泌前导序列的DNA可以可操纵地与多肽的DNA连接；如果其影响该序列的转录，则启动子或者增强子是与编码序列可操纵地连接；或者如果其影响该序列的转录，则核糖体结合位点是与编码序列可操纵地连接；或者如果其被定位在可以促进翻译的位置，则核糖体结合位点是与编码序列可操纵地连接。通常地，“可操纵地连接”是指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况中是连续的并且是解读状态(in readingphase)。然而，增强子不必是连续的。
进行治疗的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物、非人灵长类动物、及动物园动物、运动动物，或者宠物如狗、马、猫、牛等等。
在本文就多肽而言所用术语“表位标记的”是指与“表位标记”融合的一种多肽。所述表位标记多肽具有足够的残基以提供可以针对其产生抗体的表位，然而是足够短的由此不干扰多肽的活性。所述表位标记优选也是相当独特的，由此抗体基本不与其它表位交叉反应。合适的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常具有大约8-50个氨基酸残基(优选大约9-30个残基)。实例包括flu HA标记多肽及其抗体12CA5(Field etal，Mol Cell.Biol.82159-2165(1988))；c-myc标记及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan et al.，Mol Cell.Biol.5(12)3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky etal.，Protein Engineering 3(6)547-553(1990))。在某些实施方案中，所述表位标记可以是IgG分子的Fc区域的表位(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，其引起增加IgG分子的体内血清半衰期。
本文所用术语“标记”是指一种可检测的化合物或者组合物，其可以与分子或蛋白质例如抗体直接或者间接缀合。所述标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或者荧光标记)，或者在酶标记的情况中可以催化可被检测的底物化合物或者组合物的化学改变。
如本文所用，“固相”是指本发明抗体可以附着的非水相基质。本发明涵盖的固相例如包括部分或者全部由玻璃(例如可控孔度玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的那些固相。在某些实施方案中，根据文章的前后关系，所述固相可以包含测定平板的孔；在其它实施方案中，所述固相可以是纯化柱(例如亲和层析柱)。
如本文所用，术语“IgE介导的病症”是指特征在于免疫球蛋白IgE的过量产生和/或超敏感性的病变或疾病。特别地，该术语可以解释为包括与致敏的超敏感性和特异反应性过敏相关的病变，例如包括哮喘、变应性鼻炎和结膜炎(枯草热)、湿疹、风疹、特应性皮炎和食物过敏。由例如蜜蜂叮刺、蛇咬伤、食物或者药物所致的过敏性休克的严重生理学病变也涵盖在这个术语的范围内。
抗体的产生起始或者“亲代”抗体可以使用本领域已有的用于产生这些抗体的技术制备。这些技术是熟知的。产生起始抗体的示例性方法在如下章节中更详细描述。这些描述是产生或选择亲代抗体的另外的可供选择的方法，而不是为了限制可以产生这种分子的方法。
抗体的结合亲和力在产生本发明的高亲和力抗体之前确定。另外，对抗体可以进行其它生物学活性分析，例如评价作为治疗剂的效力。这些分析为本领域所已知并依赖于所述抗体的靶位和被指定的用途。
为了筛选结合特定表位的抗体(例如阻断IgE与其高亲和力受体结合的那些抗体)，可以进行常规的交叉阻断分析，如进行在AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow and David Lane(1988))中所述的分析。或者，可以进行表位定位以确定抗体结合相应表位的部位。任选地，抗体对于用于产生该抗体的靶的类似物(所述类似物来自不同物种)的结合亲和力可以使用本领域已知的技术确定。在一个实施方案中，在临床前研究中其它物种是给予所述抗体的非人哺乳动物。因此，所述物种可以是非人灵长类动物，如恒河猴、猕猴、狒狒、黑猩猩、和短尾猿。在其它实施方案中，所述物种例如可以是啮齿动物、猫或者狗。
所述亲代抗体根据本发明加以改变，以产生与亲代抗体相比对于靶具有较高或者较强结合亲和力的抗体。抗体特异性得自在抗体与其靶之间形成的独特界面，所述表面彼此互补产生独特的吻合(Jones，S.&Thornton，J.M.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313-20)。通过进一步改良沿着这个界面的接触面，整体的亲和力可以由于促进结合配体的缔合所需的能量较低而增加。
抗体的结合表面通常由6个互补决定区(CDR)组成，它们是从核心伸出的环形。CDR由具有结合特异性靶的独特序列的氨基酸组成。为了增加抗体与其抗原的亲和力，这些氨基酸周围的环境必须通过导入或改良各种非共价力而变得更加有利，其最终降低相互作用的能量而产生较高的亲和力。
范德华力是在两个电中性分子之间发生的非共价相互作用(Voet，D.& Voet，J.G.(1990)Biochemistry JohnWiley and Sons，NY，NY)。通过从永久或诱导的偶极子产生的静电相互作用，两个表面之间可以发生缔合。这些偶极子可以沿着α螺旋的末端或者接近极性氨基酸存在。通过增加沿着结合界面的范德华力的数量，可以产生更有利的缔合。
导入氢键也将增加抗体与其抗原之间相互作用的特异性。参与氢键的通常的供体和受体是氮、氧和硫原子，氨基酸主要是由它们组成的(见Voet，et al.，如前所述)。氢键往往是仅交叉很短的距离(通常为2.7-3.1)，因此结合配体必须紧密接近以发生这些相互作用。因此，可以改良亲和力的一种方式是将潜在供体和受体分子紧密接触以建立氢键。
最后，改良疏水相互作用也可以增加两个结合配体之间的有利能量学。接近于结合表面的非极性残基应该由其它非极性残基围绕，并因此在有利的环境中存在。通过非极性侧链的充分埋藏，相互作用的能量学对于强结合界面是有利的。
稳定蛋白质-蛋白质界面的相互作用降低维持这些接触的能量消耗，并因此增加了整体亲和力。通过改良接近结合界面的各个氨基酸周围的环境，可以产生导致更高结合亲和力的更有利的环境。因此，通过导入有利的接触及通过进一步互补而改良界面，则抗体和抗原之间的整体结合相互作用会大大改善。
所得高亲和力抗体与亲代抗体对于靶的结合亲和力相比，优选地高出至少大约10倍，或者高出至少大约20倍，或者高出至少大约500倍，或者可以是高出1000-5000倍。需要的或希望的结合亲和力的增强程度依赖于亲代抗体的最初结合亲和力。
一般地，从亲代抗体中产生高亲和力抗体的方法包括如下步骤1.获得或者选择结合感兴趣的靶的包含重链和轻链可变区的亲代抗体。这可以通过传统的杂交瘤技术、噬菌体展示技术或者产生靶特异性抗体的任何其它方法实现。
2.选择与亲代构架序列接近的构架序列，优选人模板序列。这个模板可以基于例如其相当的全长、CDR的大小、位于构架和CDR之间接合处的氨基酸残基、整体同源性等加以选择。选择的模板可以是一个以上序列的混合物，或者可以是共有模板。
3.通过在每个及每个可能的CDR位置产生随机氨基酸取代产生克隆文库。也可以用所有可能的氨基酸随机取代人构架模板中的氨基酸，例如邻近CDR或者影响结合或者折叠的氨基酸，产生构架取代的文库。这些构架取代可以针对其对靶结合和抗体折叠的潜在作用进行评价。构架中氨基酸的取代可以与CDR中氨基酸取代同时或相继进行。一种产生变体文库的方法是通过寡核苷酸合成。
4.构建包含步骤(3)中产生的重链和/或轻链变体的表达载体，这些变体可包含如下化学式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4(I)和FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4(II)，其中FRL1、FRL2、FRL3、FRL4、FRH1、FRH2、FRH3和FRH4代表在步骤3中选择的构架模板轻链和重链序列的变体，CDR代表亲代抗体CDR的变体CDR。含有这些轻链和重链序列的载体的一个实例如图1所示。
5.筛选针对特异性靶的克隆文库，并筛选结合靶的那些克隆以改良结合亲和力。可以选择与亲代分子相比以更高的亲和力结合的那些克隆。最佳的高亲和力候选物与亲代抗体相比具有最大的结合亲和力，优选高出20、100、1000或者5000倍。如果选择的变体含有某些不希望的氨基酸，如已经导入的糖基化位点或者潜在的免疫原性位点，则那些氨基酸可以用更有益的氨基酸残基置换，并重新评价结合亲和力。
技术人员也可以使用这个方法从完全的人亲代抗体中通过仅随机取代CDR区域而留下人构架整体来产生高亲和力抗体。
由于改良的高产量筛选技术和例如图1所示的载体，技术人员可以迅速并有效地筛选在给定的CDR和/或构架区中所有位点的全面的取代文库。通过在所有位置同时随机取代所有氨基酸，技术人员能筛选显著增加亲和力的可能组合，这类组合由于例如协同作用而不能通过单个取代被预见或鉴别。
亲代抗体制备靶制备可溶的靶或其片段可以用作产生抗体的免疫原。所述抗体是针对感兴趣的靶所产生的。优选地，所述靶是生物学重要的多肽，并且将所述抗体给予患有疾病或功能失调的哺乳动物可以在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，可以针对非多肽靶产生抗体。在所述靶是多肽时，其可以是一种跨膜分子(例如受体)或者配体例如生长因子。本发明的一种靶是IgE。完整细胞可用作产生抗体的免疫原。所述靶可以是重组产生的或者使用合成方法产生。所述靶也可以分离自天然来源。
用于产生本发明抗体的抗原可包括本发明的多肽及其片段，包括表位A和/或B。用于免疫动物的多肽可以通过标准重组方法、化学合成方法或者纯化方法获得。如本领域所熟知，为了增加免疫原性，抗原可以与一种载体蛋白缀合。通常使用的载体包括但非限于匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后将偶联的肽用于免疫动物(例如小鼠、大鼠或者兔)。除了这些载体之外，熟知的佐剂可以与抗原一起给予以促进强免疫应答的诱导。
多克隆抗体多克隆抗体通常是在非人哺乳动物中通过多次皮下(sc)或者腹膜内(ip)注射与佐剂组合的相关靶而产生的。本领域熟知多种能激发免疫学应答的药剂。
通过将蛋白质或缀合物(分别对于兔或者小鼠)与弗氏完全佐剂组合，并皮内注射该溶液，而对动物针对靶、免疫原性缀合物或者衍生物进行免疫。一个月后，将动物在多个部位皮下注射于弗氏不完全佐剂中的1/5-1/10原始量的肽或者缀合物而加强免疫。7-14天后，从该动物引流血液，分析血清抗体效价。对动物持续加强免疫直至效价处于稳定状态。
选择的哺乳动物抗体通常与靶具有足够强的结合亲和力。例如，所述抗体可以结合人抗IgE靶，结合亲和力(Kd)数值为大约1×10-8M。抗体亲和力可以通过饱和结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)和竞争测定(例如放射性免疫测定)而确定。
为了筛选与感兴趣的靶结合的抗体，可以进行常规的交联测定，如可以进行Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)所述的测定。或者，可以进行表位定位确定结合，例如Champe et al.J.Biol.Chem.2701388-1394(1995)所述。
单克隆抗体单克隆抗体是识别单一抗原性位点的抗体。其一致的特异性使得单克隆抗体比多克隆抗体更有用，多克隆抗体通常含有识别多种不同抗原性位点的抗体。单克隆抗体可以使用首先由Kohler et al.，Nature，256495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法产生。
在杂交瘤方法中，将小鼠或者其它合适的宿主动物如啮齿类动物如上述进行免疫，以激发产生或者能产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后将淋巴细胞与骨髓瘤细胞使用合适的融合剂如聚乙二醇融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipals and Practice，pp.590-103(Academic Press，1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并在其中生长，所述培养基中优选含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型包括阻止HGPRT缺陷的细胞生长的次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)。优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持选择的产生抗体的细胞稳定高水平地产生抗体、并且对培养基如HAT培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已经针对人单克隆抗体的产生而被描述(Kozbar，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
在鉴别了产生希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过限制稀释程序将克隆进行亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipals and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986))。对于此目的，合适的培养基包括。由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基中适当分离，所述方法例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或者亲和层析。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如使用能特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。所述杂交瘤细胞作为这种DNA的来源。分离后，可以将DNA置于表达载体中，然后转移至宿主细胞例如大肠杆菌细胞、NS0细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者骨髓瘤细胞中，以在重组的宿主细胞中合成单克隆抗体。所述DNA也可以例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 816851(1984))或者通过与免疫球蛋白多肽共价结合而被修饰。
人源化抗体人源化是一种产生嵌合抗体的技术，其中充分小于完整的人可变区的部分被非人物种的相应序列取代。人源化抗体具有导入其中的来自非人物种的一或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称作“引入”残基，其典型取自“引入的”可变区。人源化基本上可以通过Winter及其同事(Jones et al，Nature 321522-525(1986)；Riechmanet al.，Nature332323-327(1988)；Verhoeyens et al.，Science 2391534-1536(1988))的方法，通过用非人CDR或者CDR序列取代人抗体中相应序列进行(见例如美国专利No.4,816,567)。如本发明所实践，人源化抗体可以具有由鼠抗体中相似位点的残基取代的一些CDR残基和一些FR残基。
用于产生人源化抗体的人可变区(轻链和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳吻合”方法，将非人抗体的可变区序列与已知的人可变区序列的文库进行对比。然后最接近非人亲代抗体的人序列被公认为是人源化抗体的人构架(Sims etal.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia etal.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一种方法使用衍生自一特殊亚组轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定构架。相同的构架可用于一些不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
抗体片段已经开发了产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过蛋白酶解完整的抗体产生的(见例如Morimoto et al.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennanetal.，Science 22981(1985))。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞而直接产生。例如，抗体片段可以分离自抗体噬菌体文库。或者，F(ab′)2-SH片段可以直接回收自大肠杆菌并被化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter etal.，Bio/Technology 10163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。本领域技术人员已知产生抗体片段的其它方法。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(PCT专利申请WO 93/16185)。
高亲和力抗体的制备一旦已经鉴别并分离了亲代抗体，亲代抗体的一或多个可变区中的一或多个氨基酸残基可以被改变。或者另外，在亲代抗体中可以取代一或多个构架残基，这样该抗体例如对于人IgE的结合亲和力得以改良。待修饰的构架区残基例如包括与靶非共价直接结合的残基(Amit et al.Science 233747-753(1986))；与CDR的构象相互作用/影响CDR的构象的那些(Chothia et al.J.Mol.Biol.196901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的残基(EP 239 400 B1)。在某些实施方案中，一或多个这种构架区残基的修饰导致抗体与感兴趣的靶的结合亲和力增强。
抗体的生物学性质的修饰可以通过选择其对维持如下方面的作用显著不同的取代而实现，例如维持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如折叠或者螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或者(c)侧链的体积。非保守取代需要将这些类别之一的一个成员用另一类别的成员置换。
编码氨基酸序列变体的核酸分子是通过本领域已知的多种方法制备的。这些方法包括但非限于寡核苷酸介导的(或者定向)诱变、PCR诱变、及先前制备的变体或者非变体形式的物种依赖性抗体的盒式诱变。产生变体的优选方法是寡核苷酸介导的合成。在某些实施方案中，例如在大约2-15种高变区取代中，抗体变体仅具有一个单一的高变区残基被取代。
产生变体文库的一种方法是寡核苷酸介导的合成方法，如图2所示。大约100个核苷酸的三种寡核苷酸的每一种均可以合成为跨越全部轻链或者重链可变区。每种寡核苷酸可包含(1)由三联体(NNK)20产生的一段60个氨基酸的序列，其中N是任何核苷酸，K是G或者T；(2)在每个末端与接下来的寡核苷酸或者与载体序列重叠的大约15-30个核苷酸。基于PCR反应中这三种寡核苷酸的退火，聚合酶将充填相反的链，产生完整的双链重链或者轻链可变区序列。三联体的数目可以调节为任何长度的重复，并且可以选择其在寡核苷酸内的位置以便仅取代在给定的CDR或者构架区中的氨基酸。通过使用(NNK)，所有二十个氨基酸在编码的变体中的每个位置均是可能的。5-10个氨基酸(15-30个核苷酸)的重叠序列不被取代，但是这可以选择位于构架的堆积区内，或者可以通过分离的或随后的合成循环进行取代。合成寡核苷酸的方法为本领域所熟知，也可以商购。从这些寡核苷酸中产生抗体变体的方法也为本领域所熟知，例如PCR。
在其序列中随机位置不同的重链和轻链变体的文库可以在任何表达载体中构建，所述载体如噬菌体，特别是图1所示的载体，其均含有编码特殊重链和轻链变体的DNA。
在产生抗体变体之后，确定变体相对于亲代抗体的生物学活性。如上所述，这包括确定变体对于靶的结合亲和力。有许多高产量的方法以快速筛选抗体变体结合感兴趣的靶的能力。
然后对选自这种初始筛选的一或多种抗体筛选其相对于亲代抗体增强的结合亲和力。一种常用的确定结合亲和力的方法是使用BIAcoreTM表面等离子共振系统(BIAcore，Inc.)评价结合和解离速度常数。根据厂商(BIAcore)指导，激活生物传感器芯片以与靶共价偶联。然后将靶稀释并注射到芯片上以获得一个信号，所述信号以固定物质的应答单位(RU)表示。由于RU中的信号与固定物质质量成比例，因此这代表了基质上固定的靶的密度范围。解离数据符合单一位点模型，获得koff+s.d.(测定的标准偏差)。对于每个结合曲线计算假一级速度常数(ks)，并作为蛋白质浓度的函数绘图，获得kon±s.e.(吻合的标准误差)。从SPR测定中计算结合的平衡解离常数KD，表示为koff/kon。由于平衡解离常数KD与koff成反比，因此通过假定结合速率(kon)对于所有变体都是恒定的，可以估算亲和力的改善。
所得具有高亲和力的候选物可任选进行一或多种进一步的生物学活性测定，以证实具有增强的结合活性的抗体变体仍保留希望的治疗性质。例如，在抗IgE抗体的情况中，可以筛选阻断IgE与其受体结合并且抑制组胺释放的那些抗体。最佳的抗体变体保留以显著高于亲代抗体的结合亲和力结合靶的能力。
如此选择的抗体变体通常根据抗体的指定用途而可以进行进一步修饰。这些修饰可包括进一步改变氨基酸序列，与异源多肽融合和/或如下文描述的那些共价修饰。例如，不参与维持抗体变体的适当构象的任何半胱氨酸残基均可以被取代(通常由丝氨酸取代)，以改良分子的氧化稳定性并阻止异常的交联。相反，半胱氨酸键可以加入抗体中，以改良其稳定性(特别是在抗体是一种抗体片段如Fv片段的情况中)。
载体本发明还提供了编码本发明揭示的抗体变体的分离的核酸，包含所述核酸的载体和宿主细胞，及产生所述抗体变体的重组技术。为了重组产生抗体变体，分离编码其的核酸并插入到可复制的载体中以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。编码抗体变体的DNA易于使用常规方法分离及测序(例如通过使用能特异性结合编码抗体变体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
许多载体是可获得的。载体成分通常包括但非限于如下一或多种成分信号序列、复制起点、一或多个标记基因、增强子元件、启动子、及转录终止序列。
图1所示噬菌体表达载体由常用的M13载体和M13的自身基因III病毒分泌信号组成，以快速分泌并筛选具有适当结合特异性和最小亲和力标准的变体Fab。这种载体不使用完整基因III序列，因此在细菌细胞表面上不展示，但Fab仍分泌进周质间隙中。或者，Fab可以在细胞质中表达并被分离。重链和轻链均具有其自己的病毒分泌信号，但是从一个单一的强的可诱导的启动子中依赖性表达。
图1所示载体还提供了一个His标记和一个myc标记以易于纯化以及检测。本领域技术人员意识到Fab可以独立地从单独的启动子中表达或者分泌信号不需要是选择的病毒序列，而可以是适于抗体片段从选择的宿主细胞中分泌的原核或真核信号序列。也应意识到重链和轻链可以位于不同的载体。
A信号序列成分本发明的抗体变体可以重组产生。所述变体还可以表达为与异源多肽融合的融合多肽，所述异源多肽优选是信号序列或者在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的其它多肽。优选所选择的异源信号序列是由宿主细胞识别并加工的(即由信号肽酶裂解)。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可以由选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或者热稳定的肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。或者在图1的载体的情况中，选择的信号序列是来自基因III的病毒信号序列。对于酵母分泌，天然信号序列可以由例如酵母转化酶前导序列、α-因子前导序列(包括酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、或者酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或者例如WO 90/13646所述信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可利用可获得的哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列例如单纯疱疹gD信号。这种前体区域的DNA符合读框地与编码抗体变体的DNA连接。
B复制起点的成分载体通常含有使得其在一或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常地，这个序列是使得所述载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，并且包括复制起点或者自主复制序列。各种细菌、酵母和病毒的这些序列是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适于酵母，各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)用于哺乳动物细胞中的载体。通常地，复制起点的成分对于哺乳动物表达载体无要求(可典型地使用SV40起点，只是因为其含有早期启动子)。
C选择基因成分载体可含有一个选择基因，也称作选择标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)授予抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或者四环素抗性，(b)互补营养缺陷，或者(c)提供从复合培养基中不可得到的关键营养素，例如编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
一种选择方案的实例是利用药物阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生授予药物抗性的蛋白质，并因此在选择方案中存活。这种显性选择的实例是使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一种适于哺乳动物细胞的选择标记的实例是使得可以鉴别细胞摄取抗体核酸的能力的那些标记，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(优选灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在含有氨甲喋呤(Mtx，DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体而鉴别。当应用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，用编码抗体、野生型DHFR蛋白及其它选择标记如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)，可以通过在含有对于选择标记的选择剂如氨基糖苷类抗生素例如卡那霉素、新霉素或者G418的培养基中的细胞生长而选择(美国专利No.4,965,199)。
用于酵母中的合适选择基因是酵母质粒Yrp7上存在的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 28239(1979))。trp1基因提供了用于缺乏在色氨酸中生长能力的酵母变体株的选择标记，这样的酵母变体株例如ATCC No.44076或者PEP4-1.Jones，Genetics 8512(1977)所述。酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了通过在没有色氨酸的情况中生长而检测转化的有效环境。相似地，Leu2-缺陷的酵母株(ATCC20,622或者38,626)是通过携带Leu2基因的已知质粒互补的。
D启动子成分表达和克隆载体通常含有由宿主生物体识别的并且与抗体核酸可操纵地连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂交体启动子如tac启动子。然而，其它已知细菌启动子也是适合的。用于细菌系统的启动子也可以含有与编码抗体的DNA可操纵地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上所有真核基因均具有一个富含AT的区域，位于转录起始位点上游大约25-30个碱基处。在许多基因的转录起始处上游70-80个碱基发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，其可能是在编码序列的3’末端加上聚A尾部的信号。所有这些序列均适合插入真核表达载体中。
与酵母宿主一起使用的合适启动子序列的实例包括如下酶的启动子3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶和葡糖激酶。
其它酵母启动子(具有通过生长条件控制转录的额外优势的可诱导启动子)是醇脱氢酶2、细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及用于麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的合适载体和启动子在EP 73,657中进一步描述。酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
在哺乳动物宿主细胞中从载体中的抗体转录由例如得自病毒的基因组的启动子控制(所述病毒例如是多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒、最优选猿猴病毒40(SV40))、由得自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子控制、由热休克启动子控制，提供的这些启动子与宿主细胞系统是相容的。
SV40病毒的早期和晚期启动子便利地作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段而获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子便利的作为HindIII E限制片段而获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头瘤病毒作为载体表达DNA的一个系统在美国专利No.4,419,446中描述。对这个系统的修改在美国专利No.4,601,978中描述。或者，人β-干扰素cDNA已经在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达。或者，劳斯肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。
E增强子元件成分编码本发明的抗体的DNA由高等真核细胞的转录通常通过在载体中插入增强子序列而增加。目前从哺乳动物基因中已知许多增强子序列(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。所述增强子例如包括在复制起点晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子及腺病毒增强子。见Yaniv，Nature 29717-18(1982)对于增强激活真核细胞启动子的元件的描述。所述增强子可以在载体5’或3’位置接合抗体编码序列，但优选位于启动子的5’位置。
F转录终止成分用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或者其它多核生物体的有核细胞)中的表达载体也可以含有转录终止必需的和稳定mRNA必需的序列。这些序列通常可以从真核细胞或病毒DNA或者cDNA的5’(偶尔从3’)未翻译区中获得。这些区域含有在编码所述抗体的mRNA的未翻译部分中作为聚腺苷酸化片段转录的核苷酸节段。一种有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见例如WO94/11026所述。
宿主细胞的选择和转化在本发明的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母、或高等真核细胞。对于此目的，合适的原核细胞包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物，例如肠细菌科如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和志贺氏菌(Shigella)，以及芽孢杆菌(Bacilli)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些只是举例说明而无限制之意。
除了原核细胞之外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常用的低等真核宿主微生物。然而，许多其它菌属、菌种和菌株也是可以获得并在本文中利用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)；假丝酵母(Candida)；木霉(Trichoderma)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)；和丝状真菌例如链孢霉(Neurospora)，青霉(Penicillium)，弯颈霉(Tolypocladium)，及曲霉(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
表达糖基化的抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物体。原则上，任何高等真核细胞培养物均可以使用，无论其得自脊椎动物还是无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞，Luckow et al.，Bio/Technology 6，47-55(1988)；Miller et al.，GeneticEngineering，Setlow et al.eds.Vol.8，pp.277-279(Plenam publishing1986)；Mseda et al.，Nature 315，592-594(1985)。从宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、伊蚊Aedes(蚊)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)中已经鉴别了许多杆状病毒毒株及变体和相应的认可的昆虫宿主细胞。可以公开获得用于转染的许多病毒株，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica NPV)的L-1变体和家蚕核型多角体病毒(Bombyx moriNPV)的Bm-5毒株，这些病毒在此可用作本发明的病毒，特别用于草地贪夜蛾细胞的转染。另外，棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草等植物细胞培养物也用作宿主。
本领域已知脊椎动物细胞和脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的增殖。见Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，eds.(1973)所述。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是猴肾细胞系、人胚胎肾细胞系、幼仓鼠肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO Urlaubet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216(1980))、小鼠支持(sertoli)细胞、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞及NS0细胞。
将宿主细胞用上述载体转化以产生抗体，并在为了适于诱导启动子、选择转化体或者扩增编码所希望的序列的基因而修改的常规营养培养基中培养。
用于产生本发明的抗体变体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购的培养基如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，Ham et al.，Meth.Enzymol.5844(1979)、Barnes etal.，Anal.Biochem.102255(1980)、美国专利Nos.4,767,704、4,657,866、4,560,655、5,122,469、5,712,163、或者6,048,728所描述的任何培养基均可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基均可以根据需要补加激素和/或其他生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或者表皮生长因子)、盐(如X-氯化物，其中X是钠、钙、镁；及磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN.TM.药物)、微量元素(通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、及葡萄糖或者等同的能量源。也可以包括本领域技术人员已知适当浓度的任何其它必需的补充物。培养条件如温度、pH等是先前所用的为了对表达选择宿主细胞的那些条件，这些为本领域技术人员所熟知。
抗体纯化当使用重组技术时，抗体变体可以在细胞内、在周质间隙产生，或者直接分泌进培养基中。如果抗体变体是在细胞内产生，作为第一步，可以例如通过离心或超滤除去宿主细胞或者裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了一种分离分泌进大肠杆菌周质间隙中的抗体的方法。简而言之，将细胞糊浆在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下解冻大约30分钟。细胞碎片可以通过离心除去。在抗体变体分泌进培养基的情况下，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器浓缩这种表达系统的上清，例如使用Amicon或者Millipore Pellicon超滤装置过滤。在前述任何步骤中均可包括蛋白酶抑制剂如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞中制备的抗体组合物可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化，其中亲和层析作为优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性依赖于抗体变体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或者IgG4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol Meth.621-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人IgG3(Guss et al.，EMBO J.51567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质通常是琼脂糖，但是也可以利用其它基质。机械稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可以达到比琼脂糖所可以达到的更快的流速和更短的加工时间。当抗体变体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。基于要回收的抗体变体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的SEPHAROSETM层析、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含感兴趣的抗体变体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
药物配制品可以制备所述多肽或抗体的治疗性配制品，以作为冻干的配制品或者水溶液形式贮存，所述制备通过将具有希望纯度的多肽任选地与本领域典型应用的“药物学可接受的”载体、赋形剂或者稳定剂(所有这些均称为赋形剂)混合而进行。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂及其它各种各样的添加剂(见Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，A.Osol，Ed.(1980)所述)。这些添加剂在应用的剂量和浓度范围对受体必须是无毒性的。
缓冲剂帮助维持pH在接近生理学条件的范围内。它们优选以大约2mM-50mM的浓度范围存在。对于本发明的应用合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸一钠和柠檬酸二钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸三钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸一钠的混合物等等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸一钠混合物等等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一钠-延胡索酸二钠混合物等等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等等)和乙酸盐缓冲液(例如、乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等等)。另外，还可以提到的有磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲基胺盐如Tris。可以加入防腐剂以阻止微生物生长，防腐剂可以以0.2％-1％(w/v)范围的量加入。用于本发明的合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲苯酚、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯二甲烃铵(benzalconium)卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基酯如羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入有时也称作“稳定剂”的等渗剂(isotonicifier)以保证本发明的液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更多羟基糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
稳定剂是指一广类赋形剂，在功能上它们的范围从填充剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附于容器壁的添加剂，典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(如上所述)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、myoinisitol、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、巯基甘油、α-单巯基甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖以及三糖如棉子糖；多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1-10000重量份的量存在。
可以加入非离子表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以助于溶解治疗剂和保护治疗蛋白质抗搅拌引起的聚集，其也使得配制品能暴露于加压的剪切面而不引起蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184、188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚(TWEEN-20、TWEEN-80等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml、优选地约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
另外的辅助性赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。如果被治疗的特定适应症需要，本发明的配制品还可以含有一种以上的活性化合物，优选地是具有互补活性的彼此不负面影响的活性化合物。例如，进一步提供一种免疫抑制剂可能是所希望的。这些分子合适地以有效用于所计划目的的量组合存在。活性成分也可以被捕获在微囊中，所述微囊通过在胶态药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米包囊)或粗乳状液(macroemulsion)中例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊以及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊()。这些技术在Remington’sPharmaceutical Sciences，16thedition，A.Osal，Ed.(1980)中公开。要用于体内给药的配制品必须是无菌的。这可以容易地例如通过无菌滤膜过滤而实现。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体变体的固体疏水聚合物的半通透基质，所述基质呈成型物体形式，例如膜或微囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质时间较短。当包囊化抗体在体内保留长时间时，它们可能会由于在37℃暴露于湿环境而变性或聚集，从而导致生物学活性丧失和免疫原性可能发生变化。根据所涉及的机制可以设计合理的策略以进行稳定化。例如，如果发现聚集机制通过硫代-二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂及开发特异性聚合物基质组合物而实现稳定。
在治疗特定病症或病变中有效的治疗性多肽、抗体或其片段的量根据所述病症或病变的性质而决定，并且可以通过标准临床技术确定。如果可能，希望首先在体外确定本发明的药物组合物剂量应答曲线，然后在人体实验之前用于有用的动物模型系统。
在一个优选的实施方案中，治疗性多肽、抗体或其片段的水溶液通过皮下注射给予。剂量均为大约0.5μg-50μg/kg体重，更优选大约3μg-30μg/kg体重。
皮下注射给药的时间表根据许多临床因素而可以是一个月一次至一天一次，所述临床因素包括疾病类型，疾病的严重程度，以及对象对于治疗剂的敏感性。
抗体变体的应用本发明的抗体变体可以用作亲和纯化剂。在这个过程中，使用本领域熟知的方法将抗体固定在固相如SEPHADEXTM树脂或者滤纸上。将固定的抗体变体与含有要纯化的靶的样品接触，之后用合适的溶剂洗涤该支持物，这样基本上除去了样品中除了要纯化的靶之外所有材料，所述靶结合在固定的抗体变体上。最后，将支持物用另外的合适溶剂如甘氨酸缓冲液洗涤，这将从抗体变体中释出所述靶。
所述变体抗体也可以用于透析测定，例如检测感兴趣的靶在特定细胞、组织或血清中的表达。对于诊断性应用，所述抗体变体典型地用可检测的组分标记。许多标记可以利用。量化荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应而变为电激发态，然后可以发射可测定的光线(例如使用化学发光计测定)或者为荧光受体提供能量。酶标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等等。将酶与抗体缀合的技术在O′Sullivan etal.，Methodsfor the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in EnzymeImmunoassay，in Methods in Enzym.(Ed.J.Langone & H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73147-166(1981)中描述。
有时，所述标记与抗体变体间接缀合。技术人员明白有各种技术可以达到这个目的。例如，抗体变体可以与生物素缀合，并且上述三种标记的广泛的种类均可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，由此标记以这种间接方式与抗体变体缀合。或者，为了达到标记与抗体变体的间接缀合，将所述抗体变体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，及将上述一种不同类型标记与抗半抗原抗体变体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此可以达到标记与抗体变体的间接缀合。
在本发明的另一个实施方案中，抗体变体不需要标记，其存在可以使用结合抗体变体的被标记的抗体检测。
本发明的抗体可以在任何已知测定方法中应用，如竞争性结合测定，直接和间接夹心测定，和免疫沉淀测定。Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与测试样品竞争结合有限量的抗体变体。测试样品中靶的量与结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定与抗体结合的标准物的量，所述抗体在竞争之前或之后通常是不溶解的。结果，结合该抗体的标准物和测试样品可以方便地从未结合的标准物和测试样品中分离。
夹心测定包括使用两种抗体，每种抗体均能结合不同的免疫原性部分或者表位或者待检测的蛋白质。在夹心测定中，待分析的测试样品由固定在固体支持物上的第一种抗体结合，之后第二种抗体与测试样品结合，由此形成不可溶的三部分复合物。见例如美国专利No.4,376,110所述。第二种抗体本身可用一种可检测的组分标记(直接夹心测定)，或者可以使用经可检测的组分标记的抗免疫球蛋白抗体测定(间接夹心分析)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，其中可检测的组分是一种酶。
对于免疫组织化学方法，肿瘤样品可以是新鲜的或者是冷冻的或者可以包埋在石蜡中并且用防腐剂例如福尔马林固定。
所述抗体也可以用于体内诊断测定。通常地，将所述抗体变体用一种放射性核素(如111In，99Tc，14C，131I，3H，32P或者35S)标记，以便可以使用免疫成像法(immunoscintiography)定位肿瘤。例如，本发明的高亲和力抗IgE抗体可以用于检测例如哮喘患者肺中存在的IgE的量。
本发明的抗体可以在试剂盒中提供，所述试剂盒即附有进行诊断测定的说明书的包装好的预定量的试剂组合。在抗体变体用酶标记的情况中，所述试剂盒可包括所述酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其它的添加剂如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化以使试剂在溶液中的浓度能充分优化检测的灵敏度。
特别地，试剂可以以包括赋形剂的干粉形式提供，通常是冻干的，其在溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液。
抗体的体内应用应理解的是本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，抗体被给予非人哺乳动物以用于例如获得临床前数据。被治疗的举例性非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿类和其它进行临床前研究的哺乳动物。这些哺乳动物可以是要用抗体治疗的疾病的已建立的动物模型，或者可以被用于研究感兴趣抗体的毒性。在这些实施方案的每一种中，可以在哺乳动物上进行剂量逐步增加研究。抗体或多肽通过任何合适方式被给药，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部免疫抑制治疗，可以损害内给药。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。另外，抗体变体合适地以脉冲输注方式给药，特别是其中抗体变体剂量逐渐下降。优选地，通过注射给药，最优选通过静脉内或皮下注射给药，这一点部分取决于给药是短期还是长期。
为了预防或治疗疾病，抗体或多肽的合适剂量取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、抗体变体的给予是用于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床历史以及对抗体变体的应答、以及主治医生的判断。本发明的非常高亲和力的抗人IgE抗体可以被适当地一次给予患者或者在一系列治疗中给予患者。
根据疾病的类型和严重性，约0.1mg/kg至150mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是给予患者的最初候选剂量，例如可以一或多次分别给药或者通过连续输注给药。典型的日剂量可以从约1mg/kg至100mg/kg或更高，这取决于上述因素。对于在几天或更长时间内的重复给药，根据症状，可以持续治疗直至产生所希望的对疾病症状的抑制。但是，其它剂量方案也是可用的。这一治疗的进程可以容易地通过常规技术和检测进行监控。抗LFA-1或抗ICAM-1抗体的一种举例性剂量方案在WO 94/04188中公开。
抗体变体组合物可以以与良好医学实践相一致的方式配制、确定剂量和给药。在此需要考虑的因素包括被治疗的特定病症、被治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床情况、导致病症的因素、给予药剂的部位、给药方法、给药时间表、及医疗从业人员已知的其它因素。给予的抗体变体的“治疗有效量”通过这些考虑的事项而决定，并且是预防、减轻或者治疗疾病或病症所需的最小量。所述抗体变体不需要是，但任选地与目前用于防止或者治疗所考虑的病症的一或多种药剂一起配制。这些其它药剂的有效量依赖于配制品中存在的抗体量、治疗的病症的类型、及其它前面所讨论的因素。这些药剂通常以同样剂量应用，并且与所用给予途径一致，或使用之前应用剂量的1-99％。
识别IgE作为其靶的本发明的抗体可用于治疗“IgE介导的病症”。这些病症包括如哮喘、变应性鼻炎及结膜炎(枯草热)、湿疹、风疹、特应性皮炎和食物过敏。由例如蜜蜂叮咬、蛇咬伤、食物或药物所致的过敏性休克这些严重生理病变也涵盖在本发明的范围内。
抗体表位定位(MAPPING)术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞应答的位点。B细胞表位可以从连续的氨基酸中形成，或者从由于蛋白质三级折叠导致邻近的不连续氨基酸中形成。从连续氨基酸中形成的表位在暴露于变性溶剂时仍典型地保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理后典型地不再存在。一个表位在一个独特空间构象中典型包括至少3个、更常见地包括至少5个或者8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简便的免疫测定中鉴别，所述免疫测定示出一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。
本发明的高亲和力抗体IgE的结合位点的表位定位包括对于结合的Western印迹分析、IgE的CH3结构域的肽扫描、示出结合的区域的丙氨酸扫描、IgG1的相应区域的氨基酸置换及定向诱变。
IgE的完整CH3结构域的肽扫描需要73个重叠肽。每个肽均进行本发明的标记的抗IgE抗体的结合，以确定阻断IgE与其高亲和力受体结合的IgE的特异表位。所述肽扫描在IgE上鉴别了是潜在的抗IgE MAb接触位点的两个肽，称作表位A和表位B(见图11所示)。尽管表位A和表位B序列在线性序列中间隔大约80个氨基酸，但是它们在IgE的三维结构中的位置彼此紧密相邻。这两个表位均是表面暴露的，它们与IgE的FcεRI结合位点重叠，并且在这两个肽中，均有带正电荷的Arg残基和疏水性残基Pro。图12例证了使用肽扫描通过ELISA确定的表位B的结合区域。
通过丙氨酸扫描诱变确定这些表位中对于结合高亲和力抗体关键的氨基酸残基(Cunningham et al.，″High-Resolution Epitope Mappingof hGH-Receptor Interactions by Alanine-Scanning Mutagenesis″Science2441081-1085)。用丙氨酸取代表位A和表位B的每个残基，并确定高亲和力单克隆抗体的结合(见下文实施例12和图13和14)。
主动和被动免疫本发明还涉及药物组合物，例如疫苗，其包含本发明的肽免疫原分子(包括SEQ ID NO72和/或SEQ ID NO74)和稀释剂、赋形剂、佐剂或者载体。本发明进一步涉及本发明的免疫原的制备方法，包括将本发明的至少一种肽与能激发对抗所述肽的免疫应答的一种成分共价偶联。
本发明还涉及上述免疫原性肽用作药物在例如治疗IgE介导的疾病或病变如变态反应和特应性皮炎中的应用。
本发明还涉及一种针对IgE介导的疾病或病变如变态反应和特应性皮炎对哺乳动物进行免疫的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的上述免疫原性肽。
虽然本发明的免疫原性肽基本上不能介导非细胞溶解性组胺释放，但其能激发与表位A和/或表位B的靶氨基酸序列具有强血清学交叉反应性的抗体。
肽的初期剂量(例如大约0.2mg-5mg)可以例如通过肌内注射给予，随后在14-28天后重复给予同样剂量(加强)。给予的剂量当然要根据患者的年龄、体重和一般状况而定。免疫可以是主动免疫或者被动免疫。在主动免疫中，对象接受本发明的免疫原性肽，抗IgE应答由对象的免疫系统主动诱导。
主动免疫优选用于人体，但也可以相似处理其它哺乳动物物种，例如狗。本文中术语“免疫原性载体”包括具有在宿主动物中独立激发免疫应答性质的那些材料，其可以与多肽通过在多肽中的游离羧基、氨基或羟基与免疫原性载体材料上相应基团之间形成肽或酯键而直接共价偶联，或者由通过常规的双功能连接基团的键合而共价偶联，或者与多肽形成融合蛋白。
这些免疫原性载体的实例包括白蛋白，如BSA；球蛋白；甲状腺球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白(特别是匙孔嘁血蓝蛋白[KLH])；从蛔虫中提取的蛋白质，例如J.Immunol.111260-268、J.Immunol.122302-308、J.Immun.98893-900、Am.J.Physio.199575-578所描述的那些蛔虫提取物或其纯化产物；聚赖氨酸；聚谷氨酸；赖氨酸-谷氨酸共聚物；含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物；等等。疫苗已经使用白喉类毒素或者破伤风类毒素作为免疫原性载体材料而产生(Lepow M.L.etal.，J.of Infectious Diseases150402-406；Coen Beuvery，E.etal.，Infection and Immunity 4039-45)，这些毒素材料也可以用于本发明中。结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)特别优选用于主动免疫方案中，因为(1)其自身不诱导T细胞应答(即其是有效的T细胞半抗原)，但作为完整加工的抗原起作用并因此由T细胞识别；(2)已知其在连锁识别模式中是最强力的半抗原载体之一；(3)其可用于人体而不用进一步测试。
本发明还涉及编码本发明的肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、及携带所述载体的细胞。另外，主动免疫可以通过给予编码本发明的肽的多核苷酸而实现。本领域已知适于这种治疗的载体，包括例如腺病毒载体。
被动免疫是通过给予患有IgE介导的疾病或病变的患者本发明的抗IgE抗体而实现。
这些抗体可以通过给予非人哺乳动物本发明的免疫原性肽并收集所得抗血清而制备。通过重复注射一段时间可以获得改良的效价。对于可用于激发抗体的哺乳动物物种无特殊限制；通常优选使用兔或豚鼠，但是也可以使用马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、牛、绵羊等等。在最后一次给予之后经过1-2周后收集被免疫的动物的血液，离心该血液并从血液中分离血清，由此获得抗体。单克隆抗体可例如是人或鼠抗体。
当对对象进行免疫时，本发明的抗体可以通过例如肌内注射导入哺乳动物中。然而，可以使用任何形式的抗体给予方式。可以使用可为对象接受的并且不具有不利副作用的任何常规液体或固体运载体。处于生理pH值(例如大约pH 6.8-7.2，优选大约pH 7.0)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)可以单独或者与合适的佐剂一起用作运载体，所述佐剂如基于氢氧化铝的佐剂。
提供如下实施例说明本发明而无限制之意。
实施例实施例1抗IgE鼠MAb TES-C21的人源化将鼠mAb TES-C21的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列与得自公开数据库的人抗体生殖系序列相对比。当决定如上述步骤1所述的模板时，采用一些标准，包括全长、构架内相似CDR位置、整体同源性、CDR的大小等等。整体考虑所有这些标准可以选择最佳的人模板，如TES-C21MAb重链和轻链序列与代表性人模板序列之间的序列排列对比所示，如图3A和3B所示。
在这种情况中，使用一种以上的人构架模板设计这种抗体。对于VH链选择的人模板是DP88(1-95位氨基酸残基)与JH4b(103-113位氨基酸残基)的组合(见图3B)。对于VL链选择的人模板是L16(VK亚组III，1-87位氨基酸残基)与JK4(98-107位氨基酸残基)的组合(见图3A)。鼠序列与人模板之间的构架同源性对于VH为大约70％，对于VL为大约74％。
一旦选择了模板，则通过如上所述和图2所示的DNA合成和重叠PCR方法构建Fab文库。所述文库由用分别选择的人模板DP88/JH4b和L16/JK4合成的TES-C21CDR组成。文库的复杂性为4096(＝212)。编码部分VH和VL序列的重叠核苷酸是在大约63-76个核苷酸范围合成的，具有18-21个核苷酸重叠。
对VL和VH基因进行PCR扩增，使用含有特异于构架区FR1的序列和退火结合到前导序列(GeneIII)末端的突出序列的生物素酰化的正向引物和来自保守的恒定区(Cκ或者CH1)的反向引物在标准PCR条件下进行。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，或者通过商购的PCR纯化试剂盒纯化，以除去未掺入的生物素酰化的引物和非特异性PCR。
在用ddH2O调节为20μL的总体积中使用2μg PCR产物、1μL T4多核苷酸激酶(10单位/μL)、2μL 10×PNK缓冲液、1μL 10mM ATP对PCR产物进行5’磷酸化。在37℃温育45分钟及在65℃热变性10分钟后，加入ddH2O将反应体积调节为200μL以进行下一步骤。
将100μL链霉抗生物素包被的磁珠用200μL 2x B&W缓冲液洗涤两次，重悬于200μL 2×B&W缓冲液中。将磷酸化的PCR产物与珠混合，在室温(RT)轻轻摇动温育16分钟。
将珠沉积并用200μL 2×B&W缓冲液洗涤两次。未生物素酰化的ssDNA(负链)用300μL新鲜制备的0.15M NaOH在室温轻轻摇动洗脱10分钟。再一次NaOH洗脱可略增加产量(任选)。将洗脱物离心以除去任何微量的珠。
通过加入1μL糖原(10mg/mL)、1/10体积的3M NaOAc(pH 5.2)和2.5体积的EtOH从上清中沉淀ssDNA。然后将沉淀的ssDNA用70％EtOH洗涤，随后冻干3分钟并溶解于20μL ddH2O中。通过在具有DNA标准物的溴化乙啶(EtBr)琼脂糖平板上点样(spotting)或者通过测定OD260对ssDNA进行量化。
实施例2VH和VL克隆进噬菌体表达载体通过杂交诱变将VH和VL克隆进噬菌体表达载体中。尿苷酸化的模板通过用基于M13的噬菌体(噬菌体表达载体TN003)感染CJ236大肠杆菌菌株(dut-ung-)而制备。
将如下成分[200ng尿苷酸化的噬菌体载体(8.49kb)；92ng磷酸化单链H链(489个碱基)；100ng磷酸化单链L链(525个碱基)；1μL10×退火缓冲液，用ddH2O将体积调节为10μL]通过将温度维持在85℃5分钟(变性)、然后在1小时之中梯度降至55℃的PCR进行退火(插入体与载体为大约8倍摩尔比率)。将样品在冰上冷激。
向退火产物中加入如下成分1.4μL 10×合成缓冲液、0.5μL T4DNA连接酶(1单位/μL)、1μL T4DNA聚合酶(1单位/μL)，随后在冰上温育5分钟，在37℃温育1.5小时。然后将产物经乙醇沉淀，溶解于10μL ddH2O或TE中。
将DNA用1μL Xbal(10单位/μL)消化2小时，在65℃加热失活20分钟。将消化的DNA通过电穿孔转染进50μL电感受态DH10B细胞中。所得噬菌体通过在37℃在XL-1 Blue细菌菌苔上生长过夜而确定效价。对克隆进行测序以确定其组成。
实施例3深孔培养以进行文库筛选A铺板噬菌体文库将噬菌体文库在LB培养基中稀释以达到每个平板希望的噬菌体数目。将高效价的噬菌体与200μL XL-1B细胞培养物混合。混合3mLLB上层琼脂，倒入LB平板上，在室温静置10分钟。将该平板在37℃温育过夜。
B噬菌体洗脱将100μL噬菌体洗脱缓冲液(10mM Tris-CI，pH7.5，10mM EDTA，100mM NaCl)加入无菌U形底96孔平板的每个孔中。将来自过夜文库平板的单一噬菌体噬斑用过滤移液管尖移至孔中。将该噬菌体洗脱平板在37℃温育1小时。温育后将平板在4℃贮存。
C深孔平板培养将来自50mL培养物的XL1B细胞以1∶100稀释度加入2×YT培养基中。将细胞在37℃在摇床中生长直至A600达到0.9-1.2。
C在深孔平板中用噬菌体感染当细胞达到合适OD时，向XL1B培养物中加入1M IPTG(1∶2000)。IPTG的终浓度为0.5mM。将750μL细胞培养物移至96孔深孔平板(Fisher Scientific)的每个孔中。每个孔接种25μL洗脱的噬菌体。将该深孔平板置于摇床中(250rpm)，在37℃温育过夜。
D制备上清以进行ELISA筛选在温育后，将深孔平板使用Beckman JA-5.3平板转子在3,250rpm离心20分钟。从每个孔中提取50μL上清进行ELISA。
E15mL XL-1细胞液态培养物的接种将XL-1在37℃在摇床(250rpm)中于含有10μg/mL四环素的2×YT中生长直至A600＝0.9至1.2。加入终浓度为0.5mM的IPTG，将15mL培养物移至50mL锥形管中以鉴定每个克隆。对细胞接种10μL来自高效价(效价＝约1011pfu/mL)原种的噬菌体并在37℃温育1小时。将细胞在室温摇动生长过夜。
F可溶的Fab从周质中的分离将细胞在IEC离心机中以4,500rpm离心20分钟而沉淀。除去培养基并将沉淀重悬于650μL重悬缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，含有1mM EDTA和500mM蔗糖)中，进行涡旋(vortex)，置于冰上轻轻摇动1小时。细胞碎片通过在4℃以9,000rpm离心10分钟而除去。收集含有可溶的Fab的上清并在4℃贮存。
实施例4构架修饰在构架中上述潜在的关键位置有12个鼠/人变偶残基(wobbleresidue)。VH中第73位在人源化文库中保持是鼠苏氨酸残基，因为确定这个位置影响结合。然而，注意在VH73的苏氨酸是人生殖系VH亚组1和2中共有的人残基。
在TES-C21序列和人模板之间不同的构架残基被如上述进行随机取代，然后评价其对靶结合及抗体折叠的潜在影响。鉴别可以影响结合的潜在构架残基。在这种情况中，所述残基是VH中的第12、27、43、48、67、69位残基，VL中的第1、3、4、49、60、85位残基(Kabat编号系统)(见图4)。随后表明只有VH区域中第27和第69位残基显著影响结合(克隆号1136-2C)。
使用的初级筛选是使用培养基的单点ELISA(SPE)(如下述)。所述初级筛选选择了结合抗体的靶分子的克隆。选择提供了与亲代分子相比相等或更好信号的克隆进行下一轮的筛选。
在第二轮筛选中，将各个噬菌体在15ml细菌培养物中生长，并将周质制备物用于SPE和ELISA滴定测定。对在这个测定中保持较高结合的克隆进行进一步鉴定。一旦所有所选择的初级克隆均经过了这一过程，对最高的10-15％克隆进行测序并根据序列对克隆进行排列。将每个序列组的代表序列彼此相互对比并选择最佳克隆。对这些选择的克隆的序列进行组合，并评价各种组合的作用。
将构建的文库进行ELISA筛选以改良与重组人IgE，SE44的结合。分离结合亲和力高于鼠TES-C21 Fab的克隆并测序，对克隆ID#4、49、72、76和136进一步鉴定。克隆4、49、72、78和136的ELISA滴定曲线示于图5A和5B，表明其亲和力与亲代TES-C21相似。这些克隆与鼠TES-C21竞争结合人IgE，表明在人源化处理期间结合表位没有改变。人源化的Fab不结合结合在FcsRI上的IgE，提示当其构建进二价IgG中时，人源化抗体与受体交联导致组胺释放是不太可能的人源化克隆136保留5个鼠重链构架残基(＝94.3％人VH构架同源性)，以及对于亲和力成熟选择的100％人轻链构架。本文表明了人源化Fab对IgE结合FcεRI的抑制作用(图6)。
实施例5用于筛选抗IgE的单点ELISA方案将平板用于碳酸盐包被缓冲液中的2μg/mL绵羊抗人Fd在4℃包被过夜。除去包被溶液，将平板用在37℃用200μL/孔3％BSA/PBS封闭1小时。用PBS/0.1％TWEEN(PBST)洗涤平板4次后，加入50μL/孔Fab样品(即含有高效价噬菌体和分泌的Fab的上清或者DMB封闭的周质prep，或者15mL prep)。将平板在室温温育1小时，随后用PBST洗涤4次。加入50μL/孔生物素酰化的SE44(在0.5％BSA/PBS中稀释的0.015μg/mL)，然后加入0.05％TWEEN。将平板在室温温育2小时，用PBST洗涤4次。加入50μL/孔链霉抗生物素HRP(在0.5％BSA/PBS中1∶2000稀释)及加入0.05％TWEEN，将平板在室温温育1小时。将平板用PBST洗涤6次。加入50μL/孔TMB底物(sigma)显色，然后加入50μL/孔0.2M H2SO4终止。
实施例6ELISA滴定抗IgE将平板用于碳酸盐包被缓冲液中的0.25μg/mL(对于纯化的Fab为0.1μg/mL)SE44在4℃包被过夜。除去包被溶液，将平板用200μL/孔3％BSA/PBS在37℃封闭1小时。
将平板用PBS/0.1％TWEEN(PBST)洗涤4次。加入50μL/孔Fab(来自15mL周质prep)，所加入的Fab从1∶2稀释开始，在0.5％BSA/PBS和0.05％TWEEN20中系列稀释3次。将平板在室温温育2小时。
将平板用PBST洗涤4次，加入50μL/孔于0.5％BSA/PBS和0.050％TWEEN20中1∶1000(0.8μg/ml)稀释的生物素-绵羊抗人Fd。将平板在室温再次温育2小时。
在用PBST洗涤4次后，加入于0.5％BSA/PBS和0.05％TWEEN20中1∶2000稀释的50μL/孔Neutra-抗生物素蛋白-AP(0.9μg/mL)，将平板在室温温育1小时。
将平板用PBST洗涤4次，加入50μL/孔pNPP底物显色，加入50μL/孔3M NaOH终止显色。在405nm或410nm读数每孔的吸光度。
实施例7亲和纯化M13噬菌体表达的可溶Fab的方案A第一天将两个含有10mg/mL四环素的500mL培养物(2×YT)接种5mL过夜原种XL1B并在37℃生长直至A600＝0.9-1.2。加入IPTG至浓度为0.5mM。然后将每个细胞培养物用200μL噬菌体感染，在37℃摇动温育1小时。感染后，将细胞在25℃摇动生长过夜。
B第二天将细胞在250mL离心管中在4℃以3500×g离心30分钟。吸出培养基并将沉淀重悬于共12-15mL的裂解缓冲液(缓冲液A+蛋白酶抑制剂混合物)中。
缓冲液A(1升)50mM NaH2PO46.9g NaH2PO4H2O(或者6g NaH2PO4)300mM NaCl17.54g NaCl10mM咪唑0.68g咪唑(MW 68.08)使用NaOH将pH调节为8.0。
裂解缓冲液将25mL缓冲液A与一片完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Basel，Switzerland)混合。
将重悬的细胞移至50mL锥形管中，使用100μl 100mg/mL溶菌酶通过将该管翻转几次直至混合物作为团滴一起运动(由于裂解所致)而将细胞裂解。将细胞在冰上进行超声处理，随后加入10μL DNase I(大约1000单位)，在4℃轻轻摇动30分钟。细胞碎片通过在4℃使用50mL离心管以12000×g离心30分钟而沉淀。将上清移至新的锥形管中，在4℃贮存。
使用Ni-NT琼脂糖(Qiagen，Valencis，CA)根据厂商指导纯化可溶的Fab。将裂解物与Ni-NTA混合并加样于柱中。收集流出物进行SDS-PAGE分析。将柱用20mL缓冲液(50mM NaH2PO4，300mMNaCl，15mM咪唑，用NaOH将pH调节为8.0)洗涤，随后用20mL的50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑洗涤。Fab用500μL洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，450mM咪唑，用NaOH将pH调节为8.0)洗脱6次，并通过SDS PAGE分析。将柱级分在4℃贮存。通过SDS-PAGE分析柱级分，选择具有最大量Fab的级分并在PBS中在4℃透析。
实施例8可溶的受体测定将适于ELISA的96孔测定平板用0.05mL 0.5μg/mL FcεRI α-链受体包被缓冲液(50mM碳酸盐/碳酸氢盐，pH 9.6)在4-8℃包被12小时。抽吸所述孔，并加入250μL封闭缓冲液(PBS，1％BSA，pH 7.2)，在37℃温育1小时。在一个单独的测定平板中，样品和参考TES-C21MAb通过用测定缓冲液(0.5％BSA和0.05％Tween 20，PBS，pH 7.2)以1∶4稀释而从200μg/mL至0.001μg/mL进行滴定，加入等体积的100ng/mL生物素酰化的IgE，并将平板在25℃温育2-3小时。将FcεR1包被的孔用PBS和0.05％TWEEN 20洗涤3次，从样品孔移出50μL，在25℃搅动温育30分钟。将于测定缓冲液中以1∶2000稀释的50μL/孔的1mg/mL链霉抗生物素-HRP搅动温育30分钟，然后将平板如前述洗涤。加入50μL/孔的TMB底物显色。反应通过加入等体积的0.2M H2SO4而终止，在450nm测定吸光度。
实施例9抗体与荷载IgE的FcεRI的结合结合与FcεRI的α亚基缔合的人IgE的抗体通过与10μg/mL人IgE在4℃预温育30分钟而确定。将平板洗涤3次，随后与不同浓度的鼠抗人IgE MAb E-10-10或者人源化的Fab变体温育1小时。使用生物素标记的抗人Fd抗体，随后通过SA-HRP检测Fab的结合。鼠MAb E-10-10通过山羊抗鼠Ig Fc HRP-缀合的Ab进行检测。
实施例10克隆鉴定测定每个候选物的结合亲和力，并对阳性克隆进行测序。对在CDR区域中具有增加结合亲和力的有益突变的抗体变体进一步鉴定。测定包括Biacore测定，IgE与其受体结合的抑制，及受体结合的IgE的交联。
产生了一个变体文库。经论证具有改良的亲和力的各种CDR的氨基酸序列示于表1。图7示出具有取代的组合的高亲和力候选物。
表1
P＝亲代
19个重链变体示于图9，35个轻链变体示于图8。对3个候选物进一步鉴定结合亲和力，这些候选物示于表2。
表2结合亲和力
实施例11抗IgE抗体及HRP缀合的表达和纯化产生了高亲和力MAb候选物。为了产生完整的抗IgE MAb，将重链和轻链可变区从噬菌体载体模板中经PCR扩增，并在CMV启动子表达下单独亚克隆进H-和L-链表达载体中。构建6个完整抗体克隆，如图10A-F所示。通过本领域熟知的电穿孔技术将合适的重链和轻链质粒共转染进小鼠骨髓瘤细胞系NS0中。见例如Liou et al.JImmunol.143(12)3967-75(1989)所述。使用蛋白A琼脂糖凝胶(Pharmacia)从单一稳定细胞系上清中纯化抗体。抗体的浓度使用分光光度计在280nm以及FCA检测(IDEXX)确定。
用过氧化物酶缀合试剂盒(Zymed Labs，San Francisco，CA)根据厂商方案用辣根过氧化物酶(HRP)缀合纯化的抗体。每种缀合的抗IgE MAb的效价用ELISA经单克隆人IgE(SE44)包被的平板确定。
下面的培养物已经被保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTytpe Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas Va.20110-2209 USA(ATCC))
本保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其细则(布达佩斯条约)的相关规定进行的。这保证了从保藏之日起保持该活培养物30年。在布达佩斯协议的范围下，通过ATCC可以获得该生物体，这保证了在相关的美国专利授权之后，公众可以永久地、不受限制地获得该培养物的后代。
本申请的受让人已经同意如果当在合适条件下培养的被保藏培养物死亡或丢失或被损害时，在被通知后将迅速地用相同培养物的活体样品代替。保藏菌株的获得并不作为在违反任何政府主管部门根据其专利法所赋予的权利下实施本发明的许可。
上面所写的说明书据信足以使得本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不受所保藏的培养物的范围的限定，因为所保藏的实施方式只是用作举例说明本发明的一个方面，任何功能上等价的培养物都在本发明的范围之内。本文的保藏材料不构成对本文所含的所写的描述不足以能实践本发明的任何方面(包括本发明的最佳模式)的承认，它也不被用于将本权利要求书的范围限定到本文所呈现的特定的举例说明。事实上，通过上面的描述，对本发明的各种除了本文所示的和所述以外的修饰对于本领域人员将是显而易见的，并且都在附录的权利要求书的范围之内。
实施例12人IgE的高亲和力结合表位的定位A肽合成和抗IgE结合测定研究示出IgE通过CH3结构域结合其受体。由于本发明的HA抗-IgE抗体非常有效地阻断IgE与其受体结合，使用涵盖全部CH3结构域的肽对表位进行定位。首先，制备两个V5标记的肽，一个包含人IgE的全部恒定区，一个仅包含人IgE的CH2-CH3区域。这两个肽通过在体外转录-翻译而表达，并用于Western印迹测定以检测HA抗IgE Mab结合。CL-2C和CL-5I MAb均能结合完整的人IgE以及这两个肽。
为了更特异性地定位表位，合成包含人IgE的第141-368位氨基酸残基(包括全部的CH3结构域)的73个重叠肽。每个肽均由12个氨基酸残基组成，在之前的肽的3’末端重叠3个氨基酸。用芴甲氧羰基(fluorenylmethoxycarboyl，Fmoc)氨基酸在纤维素膜上合成SPOT膜。将该膜在甲醇中漂洗，然后在TBS(pH 7.5)中洗涤3次10分钟。在封闭溶液(5％牛奶或者于TBS中的3％BSA)中温育过夜后，将于封闭溶液中稀释的HRP标记的抗IgE Mab与该膜温育3小时。在TBS-TWEEN中洗涤3次15分钟后，使用SuperSignal HRP底物(Pierce)通过化学发光暴露于BioMax MS胶片(Kodak)希望的时间而测定IgE反应性。
实验结果表明HA抗IgE Mab结合IgE的CH3部分中的两个区域，以如下两个肽序列表示；NPRGVSAYLSRP(表位A)和HPHLPRALMRST(表位B)(见图12)。与表位A的结合比与表位B的结合弱几倍。
B丙氨酸扫描诱变沿着在IgG1中发现的那些肽的取代氨基酸进行丙氨酸扫描，以确定哪些氨基酸对于HA抗IgE MAb与这些肽的结合是关键的。经确定对于HA抗IgE MAb结合是重要的氨基酸使用体外诱变方法在IgE的ε链中置换。这个研究中还使用如前所述的覆盖Cε2和Cε3区域的另一种肽(见图13和14)。
使用对于人IgE氨基酸残基的EU编号方案。使用聚合酶链反应(PCR)扩增IgE的全部Fc区域，及仅含有CH2-CH3结构域的截短形式的IgE Fc。将DNA产物直接克隆进pcDNA3表达载体(Invitrogene，Carlsbad，CA)中，使用TOPO cloning(Invitrogene，Carlsbad，CA)进行。
使用重叠PCR(Ho et al.，1989)在IgE-Fc中进行诱变。将DNA产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用合适的限制酶消化，并亚克隆进pcDNA3表达载体中。对于每个变体构建体，对PCR扩增的区域使用双脱氧核苷酸方法从DNA的两个链中完全测序。重组人IgE Fc及其突变体使用基于网状细胞裂解物的体外转录和翻译偶联系统(Promega，Madison，WI)表达。
将得自这个体外转录和翻译偶联系统的裂解物(10μl反应混合物)进行SDS-PAGE(12％)，然后移至硝化纤维素膜上。将该膜用于Tris缓冲盐水(TBS)中的5％奶粉溶液封闭，随后用初级抗体抗IgE MAb染色。特异性反应条带使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgGFc(Jackson Labs，Bar Harbor，Maine)检测，免疫反应性条带使用SuperSignal Western印迹检测试剂盒(Pierce)观测。抗V5抗体用作阳性对照，检测在这些肽的C末端导入的V5标记。抗V5抗体的Western印迹表明所有肽均在几乎相等的水平表达。令人感兴趣地，HA抗IgEMAb能结合在表位A具有突变的肽，但它们不结合在表位B具有突变的肽，这表明这第二个位点对于结合更重要(见图15)。
实施例13使用表位B的免疫原性肽对转基因小鼠的主动免疫使用组成型表达人IgE的转基因小鼠论证表位B的人免疫原性肽的抗体的主动产生。化学合成两个融合肽，每个肽均包含本发明的免疫原性肽、半胱氨酸残基和KLH。肽1的序列是(KLH-Cys)-Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr，肽2的序列是
Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr-(Cys-KLH)。
将转基因小鼠经皮下注射200μL的PBS pH 7.4中于完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)中的20μg免疫原性肽。间隔2周，为小鼠二次皮下注射于不完全弗氏佐剂中的20μg的肽免疫原。然后，在两周后及在处死前3天，为小鼠再次腹膜内注射于PBS中的20μg相同免疫原。收集血清并测试特异于表位B的抗IgE抗体的存在。如图16所示，所述肽在这些转基因小鼠中激发抗IgE抗体。
本领域技术人员使用不超过常规实验将意识到或者能确定本文所描述的本发明的特殊实施方案的许多等价物。这种等价物涵盖在如下权利要求书中。
序列表<110>泰勒公司<120>新的IgE表位的鉴别<130>TNX-1030<150>PCT/US04/02892<151>2004-02-02<150>PCT/US04/02894<151>2004-02-02<150>US60/444,229<151>2003-02-01<160>77<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>107<212>PRT<213>Murine<220>
<221>misc_feature<223>TES-C21 LIGHT CHAIN<400>1Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>107<212>PRT<213>Human<220>
<221>misc_feature<223>L16/-JK4 human light chain consensus sequence template<400>2Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>3<211>123<212>PRT<213>MURINE<220>
<221>misc_feature<223>TES-C21 Heavy Chain<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>113<212>PRT<213>Human<220>
<221>misc_feature<223>DP88/JH4b human heavy chain consensus sequence template<400>4Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Leu Val Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser100 105 110Ser<210>5<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRL1 SEQUENCE(TABLE 1)<400>5Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His1 5 10<210>6<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL1 VARIANT SEQUENCE#1(TABLE 1)<400>6Arg Ala Ser Arg Ser Ile Gly Thr Asn Ile His1 5 10<210>7<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL1 VARIANT SEQUENCE #2(TABLE 1)<400>7Arg Ala Ser Gln Arg Ile Gly Thr Asn Ile His
1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRL2 SEQUENCE(TABLE 1)<400>8Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL2 VARIANT #1(TABLE 1)<400>9Tyr Ala Tyr Glu Ser Ile Ser1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL2 VARIANT #2(TABLE 1)<400>10Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Tyr1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL2 VARIANT #3(TABLE 1)<400>11Tyr Ala Ser Glu Ser Asp Ser1 5
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<223>CDRL2 VARIANT #4(TABLE 1)<400>12Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Ser1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRL3(TABLE 1)<400>13Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRL3 VARIANT(TABLE)<400>14Ala Ala Ser Trp Ser Trp Pro Thr Thr1 5<210>15<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRH1<400>15Met Tyr Trp Leu Glu1 5
<210>16<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH1 VARIANT #1(TABLE 1)<400>16Trp Tyr Trp Leu Glu1 5<210>17<211>5<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH1 #2(TABLE 1)<400>17Tyr Tyr Trp Leu Glu1 5<210>18<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRH2(TABLE 1)<400>18Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>19<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #1(TABLE 1)<400>19
Glu Ile Glu Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>20<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #2(TABLE 1)<400>20Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>21<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #3(TABLE 1)<400>21Glu Ile Ser Pro Asp Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>22<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #4(TABLE 1)<400>22Glu Ile Ser Pro Glu Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15
Ala<210>23<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #5(TABLE 1)<400>23Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>24<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #6(TABLE 1)<400>24Glu Ile Glu Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala<210>25<211>17<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH2 VARIANT #7(TABLE 1)<400>25Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Ala
<210>26<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>TES-C21 CDRH3(TABLE 1)<400>26Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>27<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH3 VARIANT #1(TABLE 1)<400>27Phe Ser His Phe Ser Gly Met Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>28<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH3 VARIANT #2(TABLE 1)<400>28Phe Ser His Phe Ser Gly Gln Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>29<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CDRH3 VARIANT #3(TABLE 1)<400>29Phe Ser His Phe Thr Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5 10
<210>30<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 136<400>30Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>31<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 1<400>31Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>32<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 2<400>32Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>33<211>23
<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 4<400>33Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>34<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 13<400>34Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>35<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 18<400>35Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>36<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>FRL1 VARIANT 25<400>36Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>37<211>23<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL1 VARIANT 27<400>37Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys20<210>38<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL2 VARIANT 136<400>38Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>39<211>15<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL2 VARIANT 1<400>39Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys1 5 10 15
<210>40<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT 136<400>40Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>41<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT 1<400>41Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30<210>42<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT 13<400>42Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys20 25 30<210>43
<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL3 VARIANT 18<400>43Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys20 25 30<210>44<211>10<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRL4 VARIANT<400>44Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys1 5 10<210>45<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 VARIANT 136<400>45Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser20 25 30<210>46<211>30<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH1 VARIANT 2
<400>46Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser20 25 30<210>47<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT 136<400>47Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met Gly1 5 10<210>48<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT 2<400>48Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly1 5 10<210>49<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH2 VARIANT 8<400>49Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly1 5 10<210>50<211>14<212>PRT<213>ARTIFICIAL
<220>
<223>FRH2 VARIANT 21<400>50Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly1 5 10<210>51<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 136<400>51Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>52<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 1<400>52Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>53<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 43<400>53Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>54<211>32<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH3 VARIANT 103<400>54Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>55<211>11<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>FRH4 VARIANT 136<400>55Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>56<211>19<212>PRT<213>Bacteriophage M13mp18<220>
<221>misc_feature<223>Gene III signal Sequence<400>56Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser
<210>57<211>107<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE 136<400>57Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>58<211>106<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN CONSTANT REGION OF CLONE 136<400>58Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln1 5 10 15Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser35 40 45Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr50 55 60Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys65 70 75 80His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro85 90 95Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105<210>59<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE 136<400>59Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>60<211>330<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>CONSTANT REGION OF HUMAN IgG1<400>60Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>61<211>107<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2C<400>61Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>62<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2C<400>62Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>63<211>107<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5I<400>63Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>64<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5I<400>64Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>65<211>107<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5A<400>65Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>66<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-5A<400>66Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser15 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Trp Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Glu Pro Gly Thr Glu Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>67<211>107<212>PRT
<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2B<400>67Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>68<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-2B<400>68Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>69<211>107<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>LIGHT CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-1136-2C<400>69Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Ser Trp Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210>70<211>123<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>HEAVY CHAIN VARIABLE REGION OF CLONE CL-1136-2C<400>70Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Ala Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>71<211>108<212>PRT<213>Homo sapiens<400>71Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro1 5 10 15Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val20 25 30
Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala35 40 45Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg50 55 60Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp65 70 75 80Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu85 90 95Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser100 105<210>72<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(10)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>72Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa1 5 10<210>73<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE<400>73Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro1 5 10<210>74<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>74Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa1 5<210>75<211>9<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE<400>75Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr1 5<210>76<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OF IGE<400>76
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr1 5 10<210>77<211>12<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>PEPTIDE DERIVED FROM CH3 DOMAIN OFI GE<400>77Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr1 5 10
权利要求
1.一种分离的肽，其基本上由如下氨基酸序列组成Asn Pro Arg Gly Val Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Arg Xaa(SEQ IDNO72)。
2.权利要求1的氨基酸，其中所述氨基酸序列是Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro(SEQ ID NO73)。
3.一种分离的肽，其基本上由如下氨基酸序列组成Leu Pro Arg Ala Leu Xaa Arg Ser Xaa(SEQ ID NO74)。
4.权利要求3的肽，其中所述氨基酸序列是a)Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ ID NO75)；b)Hi Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr(SEQ IDNO76)；或者c)Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr(SEQ IDNO77)。
5.一种组合物，其包含权利要求1或3的肽及一种生理学可接受的载体、稀释剂、稳定剂或者赋形剂。
6.权利要求5的组合物，其进一步包含一种免疫原性载体。
7.权利要求6的组合物，其中所述免疫原性载体选自BSA、KLH、破伤风类毒素和白喉类毒素。
8.一种分离的抗体，其特异性结合权利要求1-4任一项的肽。
9.权利要求8的抗体，其进一步包含一种标记。
10.权利要求8的抗体，其中所述抗体是a)嵌合抗体，b)单链抗体，c)Fab片段，d)F(ab′)片段，e)人抗体，或者f)人源化抗体。
11.一种组合物，其包含权利要求8的抗体及一种可接受的载体。
12.一种制备多克隆抗体的方法，所述方法包括a)用由氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO74组成的多肽在激发抗体应答的条件下免疫动物，b)从所述动物体内分离抗体，和c)用所述多肽筛选分离的抗体，从而鉴别与包含氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO74的多肽以高亲和力特异性结合的多克隆抗体。
13.一种通过权利要求12的方法产生的多克隆抗体。
14.一种组合物，其包含权利要求13的多克隆抗体及一种合适的载体。
15.一种产生单克隆抗体的方法，所述方法包括a)用由氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO74组成的多肽在激发抗体应答的条件下免疫动物，b)从所述动物体内分离产生抗体的细胞，c)将所述产生抗体的细胞与永生化的细胞融合，形成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，d)培养所述杂交瘤细胞，以及e)从培养物中分离与包含氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQID NO74序列的多肽以高亲和力特异性结合的单克隆抗体。
16.一种通过权利要求15的方法产生的单克隆抗体。
17.一种组合物，其包含权利要求16的单克隆抗体及一种合适的载体。
18.权利要求8的抗体，其中所述抗体是通过筛选Fab表达文库产生的。
19.权利要求8的抗体，其中所述抗体是通过筛选组合免疫球蛋白文库产生的。
20.一种包含权利要求8-19任一项的抗体的试剂盒。
21.一种在哺乳动物体内诱导IgE免疫学应答的方法，包括给予在所述哺乳动物体内足以诱导应答的量的权利要求1-7任一项的肽或者组合物。
全文摘要
本发明涉及衍生自IgE的CH3结构域的新的肽表位，这些肽表位被特异性结合IgE的高亲和力抗体识别。这些新的肽可用于对对象进行主动免疫，所述主动免疫通过将这些肽给予对象而在对象体内产生高亲和力抗体实现；这些新的肽还可用于对对象进行被动免疫，所述被动免疫通过在非人宿主体内产生特异性结合IgE的这些区域的高亲和力抗IgE抗体实现。
文档编号C07K16/18GK1926149SQ200480041292
公开日2007年3月7日 申请日期2004年7月29日 优先权日2004年2月2日
发明者桑贾亚·辛格, 黄丹阳, 锡·钟·迈克尔·冯 申请人:泰勒公司