专利名称：一种牛朊病毒抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种牛朊病毒抗体及其制备方法。
背景技术：
朊病毒(Proteinaceous infectious particles，Prion)病是一类由于机体正常细胞膜蛋白PrPC(Cellular Prion Protein，PrPC)因未知原因发生构象改变成为具有蛋白酶抗性的PrPsc(Proteinase-resistant Protein，PrPsc)，在脑组织聚集沉积，引起人类和动物中枢神经系统退行性病变的遗传性、传染性疾病，预后死亡。在动物中包括牛海绵状脑病(BSE)、羊痒病(Scrapie)、貂传染性脑病(TME)、猫科动物海绵状脑病(FSE)及鹿的慢性消耗性疾病(CWD)。在人类中包括库鲁病(Kuru病)、新型变异型克雅氏病(nvCJD)、吉斯-综合症(GSS)和致死性家族失眠症(FFI)等。986年最早发生于英国的牛海绵状脑病，经研究证实与人类新型变异型克雅氏病(nvCJD)属同一致病因子传播，引起人们的极度恐慌，给公共卫生、食品医药工业、国际贸易乃至国家安全带来了全球性影响。新近发现于美国、加拿大等国家和地区的牛海绵状脑病病例加剧了其负面影响。
由于BSE病原是机体自身的蛋白成分，机体不产生特异性免疫反应，因而不能通过检测血清的方法进行诊断。本病的确诊主要依靠组织病理学方法，目前尚无BSE病原鉴定法。
国外同行较早开展了BSE的诊断研究，用去污剂浸出未固定的BSE感染脑组织，电镜下观察到特征性纤维具有诊断意义。通过免疫印迹在未固定的脑组织抽提物中检查出特征异构型的PrP蛋白(PrPSC)，免疫组化法检查福尔马林固定的脑组织中的PrPSC堆积，也是辅助诊断方法。1999年，EC批准了瑞士Prionics公司的Western blot方法、Enfer Scientics公司的ELISA诊断方法、CEA公司的夹心ELISA技术。国内的诊断仍依靠病理组织学方法。目前，国内尚未建立起除病理组织学诊断以外的相关检测技术。
牛朊蛋白(Bovine prion protein，bPrP)是染色体基因编码的264个氨基酸(序列1)的糖蛋白，翻译后修饰而成的209个氨基酸的蛋白质，含有一对二硫键。Prusiner等人证明疾病的发生是由于正常细胞蛋白PrP(PrPC)的错误折叠，引起三维构象的变化，进而导致致病性蛋白PrP(PrPSc)在脑中蓄积而引起的。PRNP(朊蛋白基因)基因结构如何引起蛋白三维构象的变化及其导致构象病的机理尚不清楚，但朊病毒病潜伏期、敏感性、种间屏障等都与Prion基因结构的多态性相关。提纯牛脑组织Prion蛋白是一项相当繁琐的工作，而且存在被疑似脑组织污染的风险。提纯制备方法存在着成本高、产量低、耗时、操作繁杂、纯度不高等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛朊病毒抗体及其制备方法。
本发明所提供的牛朊病毒抗体是以选自下述多肽家族之一的牛朊蛋白多肽为抗原免疫动物得到的抗体；所述多肽家族由以下多肽组成1)具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的多肽；2)从序列1的自氨基端第1位氨基酸残基开始向羧基端连续去除1至24个氨基酸残基，和/或从序列1的自氨基端第264位氨基酸残基开始向氨基端连续去除1至23个氨基酸残基得到的多肽。
所述抗原优选为具有序列表中序列1的自氨基端第25位至241位氨基酸残基序列的牛朊蛋白多肽。
所述被免疫的动物可为兔。
所述抗体可为多克隆抗体。
所述牛朊病毒抗体可为兔源多克隆抗体。
所述牛朊蛋白多肽可按如下方法制备将所述多肽家族中的任一多肽的编码基因插入原核细胞表达载体，得到含有所述牛朊蛋白多肽编码基因的重组表达载体，将所述重组表达载体导入原核宿主细胞中，表达得到牛朊蛋白多肽。
所述牛朊蛋白多肽编码基因优选为具有序列表中序列2的自5′端第73位碱基至第723位碱基的DNA序列。
所述原核细胞表达载体可为pET30a(+)。
所述原核宿主可为大肠杆菌和枯草杆菌，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述含有牛朊蛋白多肽编码基因的重组表达载体可为pET30a(+)-bPrPc；所述pET30a(+)-bPrPc是将所述牛朊蛋白多肽编码基因插入pET30a(+)的EcoRI和NdeI的识别位点间得到的。
本发明利用原核表达系统有效地表达牛朊蛋白多肽，表达量可达20mg/L培养基。本发明表达牛朊蛋白多肽的方法与已有的真核表达方法相比，表达外源基因成本低、产量高、安全、易纯化、纯度高而且简便易行。本发明表达的牛朊蛋白多肽可被蛋白酶K消化，Western-blotting蛋白转印试验证实，所表达的牛朊蛋白多肽具有良好的免疫反应性。经化学发光检测证实，利用本发明表达的牛朊蛋白多肽免疫家兔制备的Prion兔多克隆抗体可用于PrPc的检测。利用本发明表达的牛朊蛋白多肽作为抗原制备抗体，解决了从组织中提纯制备牛朊病毒蛋白的难题。本发明的牛朊病毒抗体可用于牛海绵状脑病(BSE)的检测。
图1为重组表达质粒pET30a(+)-bPrPc的构建示意2为重组表达质粒pET30a(+)-bPrPc的PCR鉴定结果图3为重组表达质粒pET30a(+)-bPrPc的双酶切鉴定结果图4为工程菌表达产物的SDS-PAGE电泳检测结果图5为工程菌表达产物的Western-Blotting分析6为工程菌表达产物及其纯化、以及工程菌表达的牛朊蛋白多肽经白酶K消化后的SDS-PAGE电泳图谱图7为用牛朊病毒抗体免疫检测未经蛋白酶K消化处理的牛PrPc样品的图谱具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、自序列1的氨基端第25位至241位氨基酸残基序列的牛朊蛋白多肽的表达(一)重组工程菌的制备1、牛朊蛋白多肽的表达载体pET30a(+)-bPrPc的构建pET30a(+)-bPrPc的构建过程如图1所示，具体步骤如下(1)PCR扩增牛朊蛋白多肽基因(bPrPc基因)利用下列引物，以PMT18-TbPrPc载体为模板，反应体系50μl。上游引物P15′CGGGATCCCATATGAAGAAGCGACCAAAACCTG3′(带下划线的碱基为BamHI和NdeI的识别位点)；下游引物P25′GGGAATTCTATTAACTTGCCCCTCGTTGGTA3′(带下划线的碱基为EcoRI的识别位点)；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。用TE缓冲液配成50pmol/μl。
采用rTaq PCR试剂盒(TaKaRa公司)进行PCR扩增，反应体系总体积为50μl。
反应体系
10×Buffer 5μldNTP4μlPMT18-TbPrPc1μl(约10ng)P1 1μlP2 1μlddH2O 36.5μlEx Taq DNA聚合酶1.5μl(2U)总体积 50μl反应条件98℃预变性5min，60℃1min冷却，加入1.5μl Ex Taq DNA聚合酶，低速离心进入以下循环94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，以72℃延伸10min结束。
其中，PMT18-TbPrPc按如下方法构建以按常规方法提取的牛血液基因组DNA为模板，利用引物F5‘-atggtgaaagccacataggc-3’和R5‘-gaagataatgaaacaggaag-3’按常规方法进行PCR扩增，利用试剂盒(TaKaRa公司产品)回收PCR产物，与载体pMD18-T连接，常规方法转化DH5α感受态细胞，送交公司序列测定验证，将具有序列表中序列2的核苷酸序列的载体命名为PMT18-TbPrPc。
(2)重组表达质粒pET30a(+)-bPrPc的构建PCR产物用glass milk试剂盒(TaKaRa产品，购自原平皓公司)回收，回收片段用EcoRI和NdeI双酶切；用EcoRI和NdeI双酶切经质粒纯化试剂盒QIAPreP Spin Miniprep kit((QIAGEN，购自基因公司)纯化的pET30a(+)(TaKaRa产品，购自原平皓公司)，并以低熔点琼脂糖法纯化回收酶切产物的大片段。将经EcoRI和NdeI双酶切的PCR产物，与表达载体pET30a(+)经EcoRI和NdeI双酶切回收的大片段用T4DNA连接酶连接，得到pET30a(+)-bPrPc，将pET30a(+)-bPrPc转化制备好的大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂菌于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃生长12-16h，然后小量快速抽提质粒进行EcoRI和NdeI双酶切鉴定和利用P1和P2为引物进行PCR鉴定，并进行测序。PCR鉴定结果如图2所示，表明PCR扩增得到的片段大小为651bp；图中MDNA Marker DL2000(上海东风丽珠生化试剂厂生产，购自鼎国生物工程公司)(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1、2、3、4PCR产物。酶切鉴定结果如图3所示，表明重组表达质粒pET30a(+)-bPrPc经EcoRI和NdeI双酶切后，得到651bp的bPrPc基因片段；图中MWide Range DNA Ladder Marker(上海东风丽珠生化试剂厂生产，购自鼎国生物工程公司)(15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp)；1利用P1和P2为引物得到的PCR产物2经EcoRI和NdeI酶切片段。说明重组表达载体pET30a(+)-bPrPc含有具有序列表中序列2的自5′端第73位-723位碱基DNA序列的牛朊蛋白多肽的编码基因(bPrPc基因)片段。
2、牛朊蛋白多肽的表达将鉴定后的阳性重组质粒pET30a(+)-bPrPc转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布于含50mg/ml卡那霉素的LB平板，培养10小时，挑选生长良好的菌落，提质粒，利用P1和P2进行PCR鉴定，将经PCR可扩增得到约650bp的菌落作为工程菌。同时设置pET30a(+)载体空白对照。挑选生长良好的工程菌菌落，接种至3ml的含50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至细菌生长对数期OD600＝0.5-1.0。加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，37℃快速震荡培养，分别在诱导前30min，诱导后1，2，3，4，5，6h收集菌液，取1ml表达菌体离心，将沉淀经0.5mmol/L Tris·HCl和加样缓冲液90(SDS 0.5g，巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，1M PH6.8Tris-HCl缓冲液2ml，加蒸馏水定容至10ml)裂解变性5min，8000rpm离心后，取10μl上清液上样，同时设蛋白标准分子量孔，进行15％SDS-PAGE检测。结果如图4所示，表明经IPTG诱导3h后，有大小为24KDa的牛朊蛋白多肽表达。图中，MMarker；1、2、3、4、5、6、7诱导前0.5h、诱导后1h、诱导后2h、诱导后3h、诱导后4h、诱导后5h、诱导后6h；箭头示目的条带。
根据QIAexpressDetection手册，SDS-PAGE结束后，以按照实施例2步骤(一)的方法制备的兔抗牛朊病毒抗体为一抗，以羊抗兔IgG-HRP为二抗进行Western blotting免疫印迹检测，结果如图5所示，表明在诱导3h、4h菌液沉淀中得到约24KDa的杂交条带。图中MMarker；1、2诱导3h、4h菌液上清；3、4诱导3h、4h菌液沉淀；箭头示目的条带。说明表达的牛朊蛋白多肽具有良好的免疫反应性。
3、牛朊蛋白多肽的纯化检测取诱导表达的菌液，1000rpm离心，将沉淀重悬在超声缓冲液(50mmol/LTris·HCl，pH8.02mmol/L EDTA)中，加入溶菌酶(终浓度100μl/ml)，DNA酶(终浓度10μg/ml)，和Triton X-100(终浓度0.01％V/V)，置30℃水浴15min，在冰浴条件超声破碎，超声条件为超声4秒间隔4秒，超声次数60次，功率200w，1000rpm离心，取沉淀得到包涵体，包涵体用含有0.5％Triton X-100，2mol/L NaCl和2mol/L尿素的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH8.0)清洗。洗涤后的包涵体溶解在起始缓冲液PUBS(含有8mol/L尿素和0.1mol/L DDT的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0))中。洗涤过程的效果用SDS-PAGE检测。利用BD Biosciences灌注层析系统，纯化牛朊蛋白多肽，洗脱缓冲液是含有1mol/L NaCl的PUBS，层析条件为流速为3ml/min，洗脱体积35ml。将纯化得到的蛋白溶液用15％SDS-PAGE进行检测。纯化结果如图6所示，空载体(pET30a(+))与重组载体(pET30a(+)-bPrPc)表达结果对比表明，牛朊蛋白多肽在BL21(DE3)中具有特异性表达，利用灌注层析系统，获得了较好的纯化效果(泳道6、7)。图中，MMarker；泳道2、3为含pET30a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)的表达蛋白结果，4、5为含重组载体pET30a(+)-bPrPc的大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白结果，6、7为含重组载体pET30a(+)-bPrPc的大肠杆菌BL21(DE3)表达的牛朊蛋白多肽的纯化结果；箭头示目的条带。将15％SDS-PAGE电泳图谱进行扫描后利用Image Master软件分析计算得到牛朊蛋白多肽的表达水平，牛朊蛋白多肽的最高表达水平为20mg/L培养基。
对纯化后的牛朊蛋白多肽用蛋白酶K消化检测，1g牛朊蛋白多肽加入1mg蛋白酶K，37℃反应30min，进行15％SDS-PAGE电泳，结果如图6的泳道1所示，表明蛋白酶K对牛朊蛋白多肽消化以后，牛朊蛋白多肽被完全降解，说明表达的牛朊蛋白多肽无抗蛋白酶的特性。
实施例2、兔抗牛朊病毒抗体的制备及用该抗体检测牛PrPc(一)兔抗牛朊病毒抗体的获得采用趾间、腘淋巴结、皮下注射结合的方法，用实施例1制备纯化的牛朊蛋白多肽疫家兔。
1、取4只雄性大白兔，体重2.5-3.0kg。共进行4次免疫，每次间隔2周。首免取纯化的牛朊蛋白多肽，加等量弗氏完全佐剂充分乳化后足趾间注射，牛朊蛋白多肽剂量为200ug/只。
2、二免用弗氏不完全佐剂与牛朊蛋白多肽乳化后腘淋巴结免疫动物，牛朊蛋白多肽剂量为100ug/只；3、三免用弗氏不完全佐剂与牛朊蛋白多肽乳化后背部皮下多点注射，牛朊蛋白多肽剂量为100ug/只；4、第4次静脉注射50ug牛朊蛋白多肽/只，三天后耳静脉采血，分离血清常规间接ELISA法测血清效价。包被抗原同时分别设合成肽(LIHFGSDYEDRYYRE，上海生物工程公司合成购买)、牛朊蛋白多肽和脑组织PrPc(取0.1g牛脑组织，加十倍体积的匀浆缓冲液(5％Triton X-100，0.5％SDS，50mml/LTris-Cl，pH8.0)，匀浆，离心取上清，该上清即为脑组织PrPc)平行对照，结果表明得到的牛朊病毒抗体对合成肽的效价为1/108。使用饱和硫酸盐沉淀法纯化该牛朊病毒抗体。
(二)抗体免疫检测牛PrPc1、牛脑组织PrPc提取物电泳样品的制备(1)匀浆用天平称取0.50g的正常牛脑干处脑闩部位的延髓，放入50ml的试管中。加入5ml 5×匀浆缓冲液(购自Roche公司的化学发光方法检测试剂盒Prion-CheckWESTERN 3032840自带)，在室温下将该组织手动匀浆，得到牛PrPc的匀浆样品。
(2)消化取10μl 1×消化缓冲液(购自Roche公司的化学发光方法检测试剂盒Prion-Check WESTERN 3032840自带)加入ependorf管中，再加入100μl牛PrPc的匀浆样品和10μl蛋白酶K(20U/ml)(购自Roche公司的化学发光方法检测试剂盒Prion-Check WESTERN 3032840自带)，并用吸液管反复吹打混匀。48℃下消化40min。加入10μl的1×消化终止液(购自Roche公司的化学发光方法检测试剂盒Prion-Check WESTERN 3032840自带)，终止消化，得到消化后的牛PrPc样品。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blotting分析分别向10μl牛PrPc的匀浆样品，10μl消化后的牛PrPc样品中加入100μl加样缓冲液，混匀，96℃加热5min；将试剂盒Prion-Check WESTERN 3032840的PrPc蛋白作为对照，65℃加热2min。进行15％SDS-PAGE电泳后，分别以步骤(一)制备的牛朊病毒抗体和抗Prion蛋白抗体(Prion-Check WESTERN 3032840)为一抗，以碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG为二抗(1∶5000)(M德国生产，购自Roche公司)，进行Western blotting分析，利用化学发光方法检测试剂盒Prion-CheckWESTERN 3032840(德国生产，购自Roche公司)，进行检测，结果表明用蛋白酶K消化的牛PrPc样品，PrPc被完全降解；未经蛋白酶K消化处理的牛PrPc的匀浆样品由于PrPc的糖基化程度不同，相应的产生3条大小不同的条带(图7，其中泳道1为实施例1步骤(一)制备的牛朊病毒抗体反应，泳道2为试剂盒Prion-Check WESTERN 3032840牛朊病毒抗体反应)。说明该牛朊病毒抗体可用于牛PrPc的检测。
序列表<160>2<210>1<211>264<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<400>1Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1 5 10 15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly20 25 30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly35 40 45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His50 55 60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His85 90 95Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys100 105 110Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Ile Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala115 120 125Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala130 135 140Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr145 150 155 160Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro165 170 175Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn180 185 190
Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn195 200 205Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met210 215 220Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly225 230 235 240Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser245 250 255Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly260<210>2<211>795<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>2atggtgaaaa gccacatagg cagttggatc ctggttctct ttgtggccat gtggagtgac60gtgggcctct gcaagaagcg accaaaacct ggaggaggat ggaacactgg ggggagccga120tacccaggac agggcagtcc tggaggcaac cgttatccac ctcagggagg gggtggctgg180ggtcagcccc atggaggtgg ctggggccag cctcatggag gtggctgggg ccaacctcat240ggaggtggct ggggtcagcc ccatggtggt ggctggggac agccacatgg tggtggaggc300tggggtcaag gtggtaccca cggtcaatgg aacaaaccca gtaagccaaa aaccaacata360aagcatgtgg caggagctgc tgcagctgga gcagtggtag ggggccttgg tggctacatg420ctgggaagtg ccatgagcag gcctcttata cattttggca gtgactatga ggaccgttac480tatcgtgaaa acatgcaccg ttaccccaac caagtgtact acaggccagt ggatcagtat540agtaaccaga acaactttgt gcatgactgt gtcaacatca cagtcaagga acacacagtc600accaccacca ccaaggggga gaacttcacc gaaactgaca tcaagatgat ggagcgagtg660gtggagcaaa tgtgcattac ccagtaccag agagaatccc aggcttatta ccaacgaggg720gcaagtgtga tcctcttctc ttcccctcct gtgatcctcc tcatctcttt cctcatttttctcatagtag gatag 79权利要求
1.一种制备牛朊病毒抗体的方法，是以选自下述多肽家族之一的牛朊蛋白多肽为抗原免疫动物得到的抗体；所述多肽家族由以下多肽组成1)具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的多肽；2)从序列1的自氨基端第1位氨基酸残基开始向羧基端连续去除1至24个氨基酸残基，和/或从序列1的自氨基端第264位氨基酸残基开始向氨基端连续去除1至23个氨基酸残基得到的多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗原为具有序列表中序列1的自氨基端第25位至241位氨基酸残基序列的牛朊蛋白多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述被免疫的动物为兔。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述牛朊病毒抗体为兔源多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述牛朊蛋白多肽可按如下方法制备将所述多肽家族中的任一多肽的编码基因插入原核细胞表达载体，得到含有所述牛朊蛋白多肽编码基因的重组表达载体，将所述重组表达载体导入原核宿主细胞中，表达得到牛朊蛋白多肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述牛朊蛋白多肽编码基因具有序列表中序列2的自5′端第73位碱基至第723位碱基的DNA序列。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述原核细胞表达载体为pET30a(+)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述原核宿主为大肠杆菌和枯草杆菌；优选为大肠杆菌；尤其优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述含有牛朊蛋白多肽编码基因的重组表达载体为pET30a(+)-bPrPc；所述pET30a(+)-bPrPc是将所述牛朊蛋白多肽编码基因插入pET30a(+)的EcoR I和Nde I的识别位点间得到的。
10.由权利要求1-9中任一权利要求所述的方法得到的牛朊病毒抗体。
全文摘要
本发明公开了一种牛朊病毒抗体及其制备方法。本发明所提供的制备牛朊病毒抗体的方法，是以选自下述多肽家族之一的多肽为抗原免疫动物得到的抗体；所述多肽家族由以下多肽组成1)具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的多肽；2)从序列1的自氨基端第1位氨基酸残基开始向羧基端连续去除1至24个氨基酸残基，和/或从序列1的自氨基端第264位氨基酸残基开始向氨基端连续去除1至23个氨基酸残基得到的多肽。利用本发明表达的牛朊蛋白多肽作为抗原制备抗体，解决了从组织中提纯制备牛朊病毒蛋白的难题。本发明的牛朊病毒抗体可用于牛海绵状脑病(BSE)的检测。
文档编号C07K16/08GK1699422SQ20051007980
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月29日 优先权日2005年6月29日
发明者赵德明, 杨建民, 刘美丽, 尹晓敏, 马李颖, 周向梅 申请人:中国农业大学