专利名称：治疗皮肤病的方法
相关申请本申请要求2004年2月6日提出的美国临时申请No.60/542,311的利益，其全部内容因此通过参考结合在本文中。
背景银屑病侵袭大约四百五十万美国成年人。AMEVIVE_(alefacept)是一种经核准用于治疗银屑病的生物药剂。
发明概述本发明提供治疗各种疾病的方法，其包括T细胞介导的疾病，例如记忆T细胞介导的疾病，例如皮肤病，诸如银屑病、遗传过敏性皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤、过敏性和刺激性接触性皮炎、扁平癣(lichen planus)、簇状秃头症、坏疽性脓皮病、白斑、眼睛疤痕类天疱疮、UV损伤以及荨麻疹。本文描述的方法涉及LFA-3/CD2相互作用的抑制剂的多周期施用，例如可溶的LFA-3多肽，例如可溶的LFA-3-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，诸如AMEVIVE_(alefacept)(下文为AMEVIVE)。已经发现使用所述药剂的多周期治疗比单周期治疗或双周期治疗提供更显著的结果(如明显更长久的减缓期)，而且令人惊奇地，不具有明显的副作用附加风险。在一个优选实施方案中，本文描述的方法涉及银屑病的治疗。
因此，在一方面，本发明着重描述治疗疾病的方法，例如皮肤病，如本文所描述的银屑病或其它皮肤疾病。在一个实施方案中，所述疾病由记忆效应器T细胞介导。所述方法包括对受试者施行可溶的CD2结合LFA-3多肽的多治疗疗程(优选至少3个治疗周期)。
优选地，所述可溶的CD2结合LFA-3多肽是一种LFA-3融合蛋白，例如，LFA-3/免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。示例性的LFA-3/Ig融合蛋白包括可溶的CD2结合LFA-3多肽，其融合到IgG的Fc区的全部或部分上，例如，融合到IgG重链铰链区的全部或部分以及重链恒定区的全部或部分上。在一个优选实施方案中，Ig融合蛋白由成熟LFA-3的N端92个氨基酸、人IgG1铰链区的C端10个氨基酸、人IgG1重链的CH2区、以及人IgG1重链的CH3区的全部或至少部分组成。一种这样的融合蛋白是AMEVIVE。AMEVIVE由包含在质粒pSAB152中的插入片段所编码，其保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏号为ATCC 68720。在下文中对AMEVIVE进行更加详细地描述。
多疗程的治疗包括至少3个治疗周期，每个周期包括(a)一个给药期，在该过程中治疗药剂施用至少2次，接着(b)一个休息期，在该过程中不施用治疗药剂，其中所述休息期基本上更长于周期中施用之间的时间间隔(IA，interval betweenadministrations)，并且优选地至少和给药期一样长。在一些实施方案中，多疗程包括至少4个周期，5个周期，6个周期，7个周期，8个周期，9个周期，10个周期，12个治疗周期或更多。多疗程的每个周期的给药期可以由例如具体患者的保健护理者进行预先选择或确定。典型地，所述给药期足够地长，足以激发治疗应答，例如，激发如通过临床测量所测得的选择水平的减缓，所述临床测量为例如PASI记分。在一些实施方案中，给药期至少8周，至少10周，至少12周，至少14周，20周或更久，但是典型地在4-24周之间。在一个优选的实施方案中，每个周期由12周的每周一次的多肽施用接着12周的休息组成，在所述休息期期间，患者被评估至少一次，以确定药剂的作用，例如治疗作用或副作用。在一个优选的实施方案中，多疗程的每个连续周期的休息期长于多疗程中在先周期的休息期。在一些实施方案中，多疗程的最后周期的休息期可以是至少2年，至少18个月，至少3年、4年、5年或更久。
所述可溶的、CD2结合LFA-3多肽可以以每kg体重约0.001-约50mg结合药剂范围内的剂量进行施用。在一个实施方案中，所述多肽被全身性地施用，优选地通过肌肉内(IM)或静脉内(IV)途径进行。给药期典型地包括多肽的定期施用，例如，一周一次，一周两次，半周一次，或每月一次。典型地，当通过IV途径施用时，所述多肽以2-15mg范围的单位剂量(例如，7.5mgIV大丸剂)以及当通过IM途径施用时，以2-30mg范围的单位剂量(例如，10或15mgIM注射)进行施用。
在一个实施方案中，所述方法包括对受试者评估在多疗程中每个周期的1个或2个给药期以及休息期过程中对于可溶的CD2-结合LFA-3多肽的作用。
在一个实施方案中，所述方法包括在多疗程治疗过程中给受试者施用附加的治疗或预防药剂，例如，UV辐射(如UVB辐射)、环孢素A、泼你松、FK506、甲氨喋呤、类固醇类、类视色素类、干扰素，以及氮芥。附加药剂可以在1个或多个周期过程中的给药期过程中、休息期过程中、或两者进行施用。
所述受试者优选为人。优选的受试者包括那些具有诸如银屑病的T细胞介导的皮肤病症状的患者，所述症状例如，真皮细胞增殖、凸起的红蚀斑形成(raised red plaque formation)、鳞屑病(scalyness)、瘙痒、裂化、刺痛、烧灼感、或出血斑，以及那些已被确诊为银屑病的患者。
在另一方面，本发明着重描述治疗患有银屑病的患者的方法。所述方法包括(a)选择已经具有使用可溶的CD2结合LFA-3多肽治疗的至少2个周期的受试者，例如，基于已经具有至少2个周期选择受试者，以及(b)对受试者再施用另外周期，例如，第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个、第10个或更多周期的可溶的CD2-结合LFA-3多肽的治疗。
在另一方面，本发明着重描述使用本文所描述的可溶的CD2-结合LFA-3多肽治疗受试者，或者建议或推荐受试者进行治疗的方法。所述方法包括对受试者或其他个体教导或提供对受试者施用本文所描述的多疗程治疗的指导，所述其它个体例如保健护理者，例如医生、护士、医院的雇员、HMO或其它提供卫生保健的组织。
本文所描述的方法可以用于治疗由记忆效应器T细胞介导的任何病况。本文所描述的方法可以用于治疗诸如银屑病和硬皮病的皮肤病，以及诸如炎症性肠病、眼色素层炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化病、和硬皮病的非皮肤病。
附图简介
图1A和1B描述LFA-3/IgG融合蛋白的氨基酸和核苷酸序列。信号肽对应图1A的氨基酸1-28；成熟LFA-3区对应图1A的氨基酸29-120；以及IgG1区对应图1A的氨基酸121-347。
图2是在使用AMEVIVE多疗程治疗的A-D周期治疗后的2或12周获得PASI 50的银屑病患者的百分比的柱状图。
图3是使用AMEVIVE对于银屑病的多疗程治疗中的受益和重复应答的图表。
图4是在接受使用AMEVIVE多疗程治疗的4名银屑病患者中的最大应答时间长度的柱状图。
图5是对于具有使用AMEVIVE多疗程治疗的患者平均CD4+T细胞计数的图表。
图6A是在使用AMEVIVE多疗程静脉内(IV)治疗期间的任何时间获得PASI 75的患者的百分比的图表。图6B是在使用AMEVIVE多疗程IV治疗期间的任何时间获得PASI 50的患者的百分比的图表。
图7A是在使用AMEVIVE多疗程IV治疗期间的任何时间获得“清楚”或“几乎清楚”应答的PGA的患者的百分比的图表。图7B是在使用AMEVIVE多疗程IM治疗期间的任何时间获得“清楚”或“几乎清楚”应答的PGA的患者的百分比的图表。
详述本文所描述的方法一般涉及使用可溶的CD2结合LFA-3多肽用于T细胞介导的疾病(例如，银屑病)的治疗的多疗程疗法。已发现多疗程疗法比单周期疗法或双周期疗法提供显著更长的减缓期，而且令人惊奇地，没有明显的副作用附加风险。
多疗程治疗如本文所用，一个治疗的“周期”包括(a)一个给药期，在该过程中治疗药剂施用至少2次(施用之间的时间间隔称为IA)，接着(b)一个休息期，在该过程中不施用治疗药剂。所述休息期基本上比最长的IA更长，例如，至少长4-5倍，并且优选地至少与给药期一样长。在周期的给药期过程中，药剂可以每隔一段时间(优选有规律的)施用至少2，4，6，8，10，12，14，16，18或20次。典型地，所述给药期对于患者足够地长，足于展现预选的疾病改善水平，例如，预选的PASI记分，例如PASI 50或PASI 75。所述休息期可以包括监测患者对治疗药剂的反应(例如，疗效或副作用)。在一个优选的周期中，所述药剂在12周的给药期过程中每周施用一次，接着为12周的休息期，在所述休息期过程中患者由保健护理者评估至少一次。
在优选的实施方案中，在给药期过程中将存在少于50，40，30，20或15次的施用。在优选的实施方案中，在所述周期的给药期内任意两次临近的施用之间的最大时间间隔(IA)少于30天，少于20天，少于15天或少于10天。在优选实施方案中，在施用之间的时间间隔约1周。所述周期的给药期可以考虑剂量策略而改变。例如，如果给药期以周或月度量，给药期可以包括药剂的每月一次的、每周一次的、双周一次的、半周一次的或每日一次的施用，持续指定数目的周，如保健医生为具体的病人确定的那样。一个周期的优选给药期包括约6-24次施用，其具有3-15日的IA。更优选地，一个周期的给药期包括约10-14次施用，其具有5-9日的IA。
在一些情形中，休息期等于或长于这样的期间，在该期间过程中所述药剂对患者具有基本上减缓的作用，如由标准临床量度所测量的那样。例如，对于在治疗周期过程中的银屑病患者的休息期可以是这样的期间，在该期间过程中特定的银屑病区域和严重度指标(PASI，Psoriasis Area andSeverity Index)记分(例如，PASI 50或PASI 75)或具体的医生综合评估(PGA)记分(例如，PGA“清楚”或“几乎清楚”)得以维持，或更长于该期间。然而，至少等于减缓期的休息期典型地在1年-10年之间，例如，在2年-10年之间，例如，在2年-5年之间。在一些实施方案中，休息期是至少1年，优选地至少18个月，2年，30个月，36个月，42个月，48个月或更长。
“多疗程的治疗”意指至少3个治疗周期。处于多疗程治疗中的所述周期可以相同但它们不必相同，例如，它们可以在给药期过程中的剂量策略上不同；或者在IA，给药期、休息期的长度，或者两者的持续时间上不同。例如，多疗程的治疗可以包括(a)第一个周期，其由12周的每周一次的AMEVIVE施用接着12周的休息组成，接着(b)第二个周期，其由12周的每周一次的AMEVIVE施用接着1年的休息期组成，在该休息期期间，所述药剂对患者具有基本上减缓的作用，接着(c)第三个周期，其由10周的治疗药剂每半周一次的施用接着2年的休息组成，任选地接着(d)后续周期，例如，附加的第4个，第5个，第6个，第7个，第8个周期或更多周期。
在优选实施方案中，所述休息期和减缓效果随着多疗程治疗过程中周期数目的增加而增加。在休息期或减缓作用持续时间中随着每一个增加的治疗周期的增加优选地是至少10％，更优选地至少15％或20％，更优选地至少25％、30％、40％、50％或更多。在一些实施方案中，对于多疗程治疗中第三个周期(和/或后续周期)的休息期和减缓效果为至少18个月，优选地至少2年，更优选地至少30个月、36个月、42个月、48个月或更多。
CD2LFA-3相互作用的抑制剂CD2LFA-3相互作用的任何抑制剂都在本发明的方法中有用。这种抑制剂包括可溶的LFA-3多肽、抗-LFA-3抗体同系物、抗-CD2抗体同系物、可溶的CD2多肽、小分子(例如，具有小于2500Da优选地小于1500Da的分子量的化学试剂，化学制剂，例如小的有机分子，例如组合文库(combinatorial library)的产品)、LFA-3和CD2的模拟药剂以及其衍生物。
用在本文所描述的方法中的优选抑制剂是可溶的、CD2结合LFA-3多肽。
可溶的CD2和LFA-3多肽抑制LFA-3和CD2相互作用的可溶的LFA-3多肽或可溶的CD2多肽在本发明的方法中有用。优选可溶的LFA-3多肽，特别是可溶的LFA-3/Ig融合体。
如此处所用，“可溶的CD2-结合LFA-3多肽”是一种包括至少LFA-3(SEQ ID NO2)的CD2-结合结构域并且不能将自己锚定在膜中的多肽。这种可溶的多肽包括，例如，缺少它们的跨膜结构域的充分部分而不能锚定多肽或被修饰以致跨膜结构域没有功能的LFA-3多肽。可溶的CD2-结合LFA-3多肽包括可溶的融合蛋白，其包括至少融合到异源多肽上的LFA-3的CD2-结合结构域。在一个实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白的Fc区(例如，IgG1铰链区和CH2-CH3结构域)或其基本部分。
可溶的LFA-3多肽可以衍生于LFA-3的跨膜形式，特别是细胞外结构域(例如，US 6,162,432的SEQ ID NO2的氨基酸1-187，其通过参考结合于此)。这种多肽在美国专利No.4,956,281和美国专利No.6,162,432中描述，其通过参考结合在本文中。优选的可溶LFA-3多肽包括包含SEQID NO2的残基1-92、SEQ ID NO2的残基1-80、SEQ ID NO2的残基50-65以及SEQ ID NO2的残基20-80的多肽，其中所述SEQ ID NO2在美国专利No.6,162,432中显示。将包含编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO1)的载体保藏在马里兰Rockville美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland)，保藏号为No.75107，其中所述SEQ ID NO1和2在US6,162,432中显示。
可溶的LFA-3多肽还可以衍生于LFA-3的PI-连接形式，诸如在PCT专利申请顺序号No.WO 90/02181中描述的那些。将包含编码PI-连接的LFA-3的DNA序列(SEQ ID NO3)的载体保藏在马里兰Rockville美国典型培养物保藏中心，保藏号为No.68788。应该明白LFA-3的PI-连接形式和LFA-3的跨膜形式具有贯穿完整的细胞外结构域的相同的氨基酸序列。因此，优选的PI-连接的LFA-3多肽与LFA-3的跨模形式相同。
对于用于本发明的最优选的可溶的CD2结合LFA-3多肽为LFA-3/Ig融合蛋白。这种融合蛋白的一个实例是AMEVIVE_(alefacept)。
AMEVIVE_(alefacept)AMEVIVE是一种融合蛋白，其包括融合到人IgG1的Fc部分的人LFA-3(CD58)的第一个细胞外结构域。特别地，AMEVIVE包括成熟LFA-3的N端92个氨基酸、人IgG1铰链区的C端10个氨基酸(所述人IgG1铰链区含有被认为参与链间二硫键的2个半胱氨酸残基)、以及人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区的基本部分，(例如，SEQ ID NO3)。所述蛋白是糖基化的、二硫键连接的二聚体，在PAGE非还原条件下具有约112kD的分子量。AMEVIVE的恒定区具有C端可变性，其对应全长融合多肽的剪接变体形式。
将编码AMEVIVE的质粒pSAB152保藏在马里兰Rockville美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 68720。
pMDR(92)Ig-3是可以用于生产AMEVIVE的的表达载体的一个实例。pMDR(92)Ig-3包括下述元件(a)pBR322片段，其含有ColE1起点和β内酰胺酶表达盒(GenBank登记号No.J01749)；(b)DHFR表达盒，其由下述元件组成删除了增强子的SV40早期启动子(GenBank登记号No.J02400的一部分)，鼠DHFR cDNA(GenBank登记号No.L26316)，SV40多聚腺苷酸(SV40 poly A)位点和小t内含子(GenBank登记号No.J02400的部分)，以及人促胃液素转录终止子序列，3′UTR(Sato等.(1986)Mol CellBiol 61032-1043)；(c)AMEVIVE表达盒，其包括，优选地以下述顺序SV40早期启动子/增强子(GenBank登记号No.J02400)，包括剪接供体和内含子序列的腺病毒主要末期启动子(Adenovirus Maior Late Promoter)和三联前导序列(GenBank登记号No.J01917的一部分)，鼠Ig重链可变区内含子序列和剪接受体(Kaufman和Sharp(1982)Mol Cell Biol.21304-1319)，(任选地)克隆接头，从人扁桃体cDNA文库分离的LFA-3基因的前92个氨基酸，其符合读框地融合到编码从人成纤维样的基因组DNA文库中分离的人IgG1基因的铰链CH2和CH3区的核酸上，克隆接头(任选地)，包含多聚腺苷酸位点的MIS 3′UT区(GenBank登记号No.K03474)，以及SV40多聚腺苷酸位点和小t内含子(GenBank登记号No.J02400)；和pBR327的片段(GenBank登记号No.L08856)。
可以用于生产AMEVIVE的宿主细胞系可以衍生于CHO-DUkX-B1细胞。在一个实施方案中，这种细胞系的DHFR(-)突变体可以使用载体pMDR(92)Ig-3进行转染，并且DHFR(+)转化子可以在选择培养基(例如，含有25nM的甲氨喋呤(MTX))中培养。阳性转化子可以经受增加浓度的MTX(例如，50nM)，然后可以选择生产高水平的AMEVIVE的菌落。
AMEVIVE的生产可以按下述进行将CHO宿主细胞解冻，按比例扩大到2000L的培养物，在pH控制和营养给料下(在48hrs.，96hrs.，和120hrs.)在培养物中保持6-7天，此后将条件培养液通过微量过滤收获下来。优选地MTX存在于培养基中。AMEVIVE可以通过进行下述步骤从条件培养液中回收(i)A蛋白层析，(ii)陶瓷羟基磷灰石(ceramichydroxyapatite)层析，(iii)在低pH病毒灭活，(iv)疏水相互作用层析，(v)接着进行浓缩、渗滤、病毒过滤、和第二次浓缩步骤，其将产生融合产品。
在同时待审地、普通转让的美国专利申请顺序号No.07/770,967中描述了生产用于本发明方法中的AMEVIVE的另一种方法。一般地，将用pSAB152转染的COS7或CHO细胞的条件培养液使用AMICON S1Y30螺旋筒式系统(AMICON，Danvers，马萨诸塞州)进行浓缩并且经受A蛋白-琼脂糖凝胶4B(Sigma，St.Louis，密苏里州)层析。将结合的蛋白洗脱下来并且经受Superose-12(Pharmacia/LKB，Piscataway，新泽西州)凝胶过滤层析。
将含有AMEVIVE的Superose-12级分，其带有最少量的污染蛋白，其在SDS-PAGE凝胶上和通过蛋白质印迹分析所确定，(参见，例如，Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，第4350-54页(1979)；AntibodiesA Laboratory Manual，第474-510页(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，合并并在YM30浓缩管(AMICON)中浓缩。使用兔抗-LFA-3多克隆抗血清，接着通过可检测的标记山羊抗-兔IgG在蛋白质印迹上检测AMEVIVE。纯化的COS7或CHO细胞的AMEVIVE是通过二硫键连接的两个单体LFA-3-Ig融合蛋白的二聚体。
LFA-3-Ig融合活性可以使用下述生物测定法进行测试(1)CD32/64(FcγRI/RII)U937细胞桥测定法，和(2)CD16(FcγRIII)Jurkat细胞桥测定法。这两种测定法测试AMEVIVE将展示细胞表面CD2的CHO细胞与表达Fc-γ受体的细胞桥接的能力。后述测定法，测定法(2)，包括在96-孔板中培养贴壁CHO-CD2细胞以形成单层；添加AMEVIVE对照和样品；添加荧光标记的Jurkat-CD16(+)；以及测量荧光强度。
将LFA-3-Ig融合体结合到固定到例如芯片的基底上的CD2，也可以用来测试融合蛋白。
CD2多肽可溶的CD2多肽可以衍生于全长CD2，特别是细胞外结构域。这种多肽可以包含CD2细胞外结构域的全部或部分。在PCT WO 90/08187中描述了典型的可溶CD2多肽，其通过参考结合在本文中。
可溶的多肽的生产本发明有用的可溶的多肽的生产可以通过本领域已知的各种方法实现。例如，所述多肽可以通过蛋白酶解、Edman降解法、或结合两者衍生于完整的跨膜LFA-3或CD2分子或者完整的PI-结合的LFA-3分子，所述蛋白酶解使用特异的内肽酶结合外肽酶。所述完整的LFA-3分子或完整的CD2分子又可以使用常规方法从其天然来源中纯化出来。备选地，可以通过使用cDNAs的已知重组DNA技术生产完整的LFA-3或CD2分子(参见，例如，授予Wallner等的美国专利号No.4,956,281；Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，第2941-45页(1987)；Sayre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，第2941-45页(1987))。
优选地，直接生产本发明有用的所述可溶的多肽，这样消除对于作为起始原料的完整LFA-3分子或完整CD2分子的需要。这可以通过常规化学合成技术或通过公知的重组DNA技术而实现，其中所述重组DNA技术中只有那些编码需要的肽的DNA序列在转化的宿主中表达。例如，编码需要的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的基因可以使用寡聚核苷酸合成器通过化学方法合成。基于需要的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的氨基酸序列设计所述寡聚核苷酸。编码需要的肽的特异DNA序列还可以衍生于全长DNA序列，其通过分离特异限制性核酸内切酶片段或通过PCR合成特定的区域。
可以应用标准方法来合成编码本发明中有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的基因。例如，可以应用完整的氨基酸序列构建反翻译基因(back-translated gene)。可以在单一步骤中合成DNA寡聚体，其含有编码本发明有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽的核苷酸序列。备选地，可以合成一些编码需要的多肽的部分的更小的寡聚核苷酸，然后将其连接。优选地，本发明有用的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽将作为一些单独的寡聚核苷酸合成，其中所述寡聚核苷酸随后连接在一起。所述单独的寡聚核苷酸典型地含有5′或3′突出端，用于互补装配。
一旦装配，优选的基因将以下述序列为特征，由限制性核酸内切酶识别的序列(包括独特的限制性酶切位点，用于直接装配到克隆或表达载体中)，考虑宿主表达系统使用的优选密码子，以及在转录时产生稳定的有效翻译的rnRNA的序列。正确的装配可以通过核苷酸测序、限制酶切作图、以及在适宜的宿主中表达生物活性的多肽进行确定。
本领域的技术人员应该理解，由于遗传密码的简并性，包含许多其它核苷酸序列的DNA分子也能够编码由上文所描述的特异的DNA序列编码的可溶LFA-3多肽或可溶CD2多肽。这些简并的序列还编码本发明有用的多肽。
所述DNA序列可以在单细胞宿主，或优选地在分离的哺乳宿主细胞中表达。正如本领域所公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，必须将所述基因有效地连接到转录和翻译表达控制序列上，其在选择的表达宿主中有功能。优选地，所述表达控制序列，以及目的基因，将被包含在表达载体中，所述表达载体还包括细菌选择标记和复制起点。如果表达宿主为真核细胞，所述表达载体还可以包括用于表达宿主的附加的表达标记。
编码需要的可溶的多肽的DNA序列可以或可以不编码信号序列。如果表达宿主是原核的，一般地优选DNA序列不编码信号序列。如果表达宿主是真核的，一般地优选应该编码信号序列。
N端甲硫氨酸可以或可以不存在表达的产物上。如果末端甲硫氨酸没有被表达宿主切除，如果需要的话，可以通过标准技术将其化学去除。
可以应用广泛种类的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体，包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主可用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，其包括colE1、pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生体，更广的宿主范围质粒，诸如RP4、噬菌体DNAs，例如λ噬菌体的众多衍生体，例如NM989，以及其它DNA噬菌体，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。对于酵母菌细胞可用的载体包括2μ质粒及其衍生物。对于昆虫细胞可用的载体包括pVL 941。
另外，任一种广泛种类的表达控制序列可以应用在所述质粒中。所述有用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括，例如，SV40或腺病毒的早期或晚期启动子，乳糖系统(lac system)，色氨酸系统(trp system)，TAC或TRC系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母菌α-交配系统和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其它序列的启动子，及其各种组合。
广泛种类的宿主细胞是可用的。宿主细胞可以是单细胞机体，或可以从多细胞机体获得，例如，从多细胞宿主分离的细胞。这些宿主可以包括广为人知的真核和原核宿主，诸如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、真菌、酵母菌的菌株，诸如Spodoptera frugiperda(SF9)的昆虫细胞，诸如CHO和鼠细胞的动物细胞，诸如COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10的非洲绿猴细胞，和人细胞，以及组织培养中的植物细胞。对于动物细胞表达，优选CHO细胞COS 7细胞。
应该理解，不是所有的载体和表达控制序列将会同等好地起作用来表达本文所描述的DNA序列。不是所有的宿主将会同等好地与同一表达系统起作用。然而，本领域的技术人员可以在所述载体、表达控制序列和宿主中选择，而无需过度实验。例如，在选择载体时，由于载体必须在宿主中复制，必须考虑宿主。还应该考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力、以及由载体编码的任何其它蛋白的表达，诸如抗生素标记。
在选择表达控制序列时，还应该考虑各种因素。这些因素包括，例如，所述序列的相对浓度(relative strength)、其控制能力、以及其与此处所讨论的DNA序列的兼容性、特别是关于潜在的二级结构。单细胞宿主的选择应该考虑它们与所选载体的兼容性、由所述DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特征、它们正确折叠可溶多肽的能力、它们的发酵或培养的要求、以及纯化由所述DNA序列编码的产物的容易度。
在这些参量内，本领域的一个技术人员可以选择各种载体/表达控制序列/宿主组合，其将在发酵或大规模动物培养中表达需要的DNA序列，例如使用CHO细胞或COS 7细胞。
可以将可溶的LFA-3和CD2多肽从发酵液或细胞培养物中分离，并应用各种常规方法的任一种进行纯化。本领域的一个技术人员可以选择最适当的分离和纯化技术。
尽管重组DNA技术是生产具有多于20个氨基酸的序列的有用的可溶CD2多肽或可溶LFA-3多肽的优选方法，具有少于约20个氨基酸的更短的CD2或LFA-3多肽优选地通过常规化学合成技术生产。用于本发明的合成生产的多肽可以有利地以非常高的产量生产并且易于纯化。
优选地，这样的可溶CD2多肽或可溶LFA-3多肽通过液相或固相多肽合成而合成，并且任选地，用羧肽酶消化(以去除C-端氨基酸)或通过人工Edman降解法降解(以去除N-端氨基酸)。液相合成的应用有利地允许直接插入某些衍生的氨基酸到正在生长的多肽链，诸如酪氨酸的O-硫酸酯。这避免需要后续的衍生步骤来修饰用于本发明的多肽的任何残基。
多肽的正确折叠可以在氧化条件下获得，所述氧化条件利于二硫键的形成，如Kent所描述的那样，″Chemical Synthesis of Polypeptides andProteins″，Ann.Rev.Biochem.，57，第957-89页(1988)。然后，可以通过本领域公知的分离技术纯化这种方法生产的多肽。
抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物如此处所用，“抗体同系物”是一种包含一种或多种选自下述多肽的多肽的蛋白质免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链以及其能够结合到抗原上的抗原结合片段。包括多于1种多肽的抗体同系物的组成多肽可以任选地为二硫键结合或者共价交联。因此，抗体同系物包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型(以及其亚型)的完整的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。抗体同系物还包括完整免疫球蛋白的部分，其保持抗原结合特异性，例如，Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、F(v)片段、重链单聚体或二聚体、轻链单聚体或二聚体、由一条重链和一条轻链组成的二聚体、等等。这一术语包括重组抗体、嵌合的、CDR-移植的以及人源化的抗体、或经过修饰在人体中更少免疫原性的其它抗体。
如此处所用，“人源化重组或人源化抗体同系物”是通过重组DNA技术生产的抗体同系物，其中抗原结合所需要的人免疫球蛋白的轻链或重链的一些或全部氨基酸已经取代来自非人哺乳动物免疫球蛋白的轻链或重链的对应的氨基酸。
如此处所用，“嵌合的重组抗体同系物”是通过重组DNA技术生产的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链、重链、或二者的铰链区和恒定区的全部或部分已经取代来自另一免疫球蛋白的轻链或重链的对应的区域。
许多类型的抗-LFA-3或抗-CD2抗体同系物可用在本发明的方法中。这些抗体包括单克隆抗体、重组抗体、嵌合重组抗体、人源化重组抗体、以及前述抗体的抗原结合部分。
在抗-LFA-3抗体同系物中，优选使用单克隆抗-LFA-3抗体。更优选地使用由杂交瘤生产的单克隆抗-LFA-3抗体，所述杂交瘤选自具有保藏号Nos.ATCC HB 10693(1E6)、ATCC HB 10694(HC-1B11)、ATCC HB10695(7A6)、和ATCC HB 10696(8B8)的杂交瘤组，或者已知为TS2/9的单克隆抗体(Sanchez-Madrid等，″Three Distinct Antigens Associated withHuman T-Lymphocyte-Mediated CytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，第7489-93页(1982))。最优选地，所述单克隆抗-LFA-3抗体由选自具有保藏号Nos.ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB10693(1E6)的杂交瘤组的杂交瘤生产。
在抗-CD2抗体同系物中，优选使用单克隆抗-CD2抗体，诸如已知为T111表位抗体的抗-CD2单克隆抗体，其包括TS2/18(Sanchez-Madrid等，″Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte-MediatedCytolysisLFA-1，LFA-2 and LFA-3″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，第7489-93页(1982))。
用于生产单克隆抗体的技术是公知的。通常参考，Harlow，E.和Lane，D.(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Kohler等，Nature，″Continuous Cultures ofFused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity″，256，第495-97页(1975)。对于本发明的目的可用的免疫原包括携带CD2或LFA-3的细胞(CD2-或LFA-3-bearing cells)，以及含有LFA-3、CD2或其反受体-结合片段(例如，结合到LFA-3上的CD2片段或结合到CD2上的LFA-3片段)的无细胞制剂(cell free preparations)。
免疫接种可以应用标准方法完成。单位剂量和免疫方案(immunizationregimen)取决于免疫的哺乳动物的种属、其免疫状况、哺乳动物的体重、等等。典型地，从所述免疫的哺乳动物上采血，并且使用适当的筛选测定法测定来自每一份血液样品的血清的特异抗体。例如，有用的抗-LFA-3抗体或抗-CD2抗体可以通过测试免疫血清阻滞Jurkat细胞的绵羊红血细胞玫瑰花结化(rosetting)的能力来鉴别，所述能力由LFA-3和CD2存在于这些细胞各自的表面而导致。在杂交瘤的生产中应用的淋巴细胞典型地从免疫的哺乳动物分离，所述免疫动物的血清已经使用所述筛选测定法测试为阳性存在需要的抗体。
用于本发明的抗-CD2和抗-LFA-3抗体同系物还可以是重组抗体，其由用编码需要的抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA转化的宿主细胞所生产。重组抗体可以通过公知的基因工程技术生产。参见，例如，美国专利No.4,816,397，其通过参考结合在本文中。例如，重组抗体可以通过从杂交瘤细胞克隆编码需要的抗体的免疫球蛋白轻链和重链的cDNA和基因组DNA而生产，其中所述杂交瘤细胞生产用于本发明的抗体同系物。然后，将编码所述多肽的cDNA和基因组DNA插入表达载体中，以致将2个基因可操作地结合到它们各自的转录和翻译表达控制序列上。选择所述表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞兼容。典型地，将2个基因插入同一个表达载体。
可以使用原核或真核宿主细胞。优选在真核宿主细胞中表达，原因在于所述细胞比原核细胞更可能组装并分泌正确折叠的并且免疫活性的抗体。可能地，所述宿主细胞将生产完整的抗体的部分，诸如轻链二聚体或重链二聚体，其也是按照本发明的抗体同系物。
应该理解上述方法的变化可用于本发明。例如，可以需要用编码抗体同系物的轻链或重链(但不是二者)的DNA转化宿主细胞。还可以应用重组DNA技术去除编码轻链和重链两者之一或两者的DNA的一些或全部，所述去除的部分对于CD2或LFA-3反受体结合不是必需的。从这些截短的DNA分子表达的分子用于本发明的方法中。另外，双功能抗体可以这样的形式生产，其中1条重链和1条轻链为抗-CD2或抗-LFA-3抗体同系物，另一条重链和轻链对除CD2或LFA-3外的抗原或者CD2或LFA-3的另外的表位特异。
嵌合重组抗-LFA-3或抗-CD2抗体同系物可以通过用包含编码需要的免疫球蛋白轻链和重链的DNA的适宜的表达载体转化宿主细胞而生产，其中编码重链和/或轻链的铰链区和恒定区的DNA的全部或一些已经用来自不同物种的免疫球蛋白轻链或重链的对应区域的DNA取代。当原始的重组抗体是非人源的，并且所述抑制剂要施用给人时，优选对应的人的序列的取代。一个示例性的嵌合重组抗体具有小鼠可变区以及人的铰链区和恒定区。一般地参见，美国专利No.4,816,397；Morrison等，″ChimericHuman Antibody MoleculesMouse Antigen-Binding Domains With HumanConstant Region Domains″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，第6851-55页(1984)；Robinson等，国际专利公布PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Better等，(1988，Science 2401041-1043)；Liu等，(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等，(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等，(1985)Nature 314446-449；以及Shaw等，1988，J.Natl.Cancer.Inst.801553-1559。
人源化重组抗-LFA-3或抗-CD2抗体可以通过用来自人Fv可变区的同等序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列而产生。产生人源化抗体的常规方法由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4214，和Queen等，US 5,585,089，US 5,693,761和US5,693,762提供，全部这些的内容通过参考结合于此。所述方法包括分离、操作、和表达编码来自至少1条重链或轻链的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分的核酸序列。所述核酸的来源对本领域的技术人员是公知的，并且，例如，可以从生产抗-LFA-3或抗-CD2抗体的杂交瘤获得。然后可以将编码人源化抗体、或其片段的核酸克隆到适当的表达载体中。
可以通过CDR-移植或CDR取代生产人源化或CDR-移植的抗体分子或免疫球蛋白，其中可以替代免疫球蛋白链的1个、2个、或全部CDR’s。参见例如，美国专利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988 Science 2391534；Beidler等，1988 J.Immunol.1414053-4060；Winter US 5,225,539，所有这些的内容通过参考清楚地结合于此。Winter描述一种可以用于制备本发明的人源化抗体的CDR-移植方法(英国专利申请GB 2188638A，1987年3月26日递交；Winter US5,225,539)，其内容通过参考而清楚地结合。具体的人抗体的全部CDR’s可以用至少一部分非人CDR替代，或者只有一些CDR’s可以用非人CDR’s替代。只是有必要替代对于结合人源化抗体与预定抗原，例如LFA-3或CD2，所需要的CDR’s数量。
人源化的抗体也在本发明范围内，其包括免疫球蛋白，其中特异的氨基酸已被取代、删除或插入。特别地，优选的人源化抗体具有在构架区内的氨基酸取代，这样以改进对抗原的结合。例如，人源化免疫球蛋白链的选择的、少量的受体构架残基可以用对应的供体氨基酸替代。取代的优选位置包括邻近CDR或能够与CDR相互作用(参见例如，US 5,585,089)的氨基酸残基。US 5,585,089中描述了从供体选择氨基酸的标准，例如，US 5,585,089的12-16栏，其内容通过参考结合于此。在1992年12月23日公布的Padlan等EP 519596 A1中描述了用于人源化免疫球蛋白链包括抗体的其它技术。
可以使用携带完整的人免疫系统而非鼠系统的转基因小鼠产生针对人LFA-3或CD2的人单克隆抗体(mAbs)。将来自用目的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞用于生产杂交瘤，其分泌具有对来自人的蛋白的表位的特异性亲和力的人mAbs(参见，例如，Wood等.国际申请WO 91/00906；Kucherlapati等.PCT公布WO 91/10741；Lonberg等.国际申请WO92/03918；Kay等.国际申请92/03917；Lonberg，N.等.1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等.1994 Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.等.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等.1993 YearImmunol 733-40；Tuaillon等.1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等.1991 Eur J Immunol 211323-1326)。
还可以通过重组DNA技术领域的技术人员已知的其它方法产生单克隆抗体。已开发一种称为“组合抗体文库展示(combinatorial antibodydisplay)”方法的备选方法来识别并分离具有特殊抗原特异性的抗体片段，并且可以应用所述方法生产单克隆抗体(对于组合抗体文库展示的描述参见，例如，Sastry等.1989 PNAS 865728；Huse等.1989 Science 2461275；和Orlandi等.1989 PNAS 863833)。按上文所述用免疫原免疫动物后，克隆由此导致的B细胞库的抗体所有组成成分。对于通过使用低聚体引物混合物和PCR获得不同人群的免疫球蛋白分子的可变区DNA序列，其方法是普遍已知的(Larrick等，1991，Biotechniques 11152-156；Larrick等，1991，MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-110)。
特别适合用于产生多样化的抗体展示文库的方法和试剂的实例，例如，可以在下述文献中找到Ladner等.美国专利No.5,223,409；Kang等.国际公布No.WO 92/18619；Dower等.国际公布No.WO 91/17271；Winter等.国际公布WO 92/20791；Markland等.国际公布No.WO92/15679；Breitling等.国际公布WO 93/01288；McCafferty等.国际公布No.WO 92/01047；Garrard等.国际公布No.WO 92/09690；Ladner等.国际公布No.WO 90/02809；Fuchs等.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等.(1992)Hum Antibod Hybridomas 381-85；Huse等.(1989)Science2461275-1281；Griffths等.(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等.(1992)J Mol Biol 226889-896；Clackson等.(1991)Nature 352624-628；Gram等.(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等.(1991)Nuc Acid Res 194133-4137；和Barbas等.(1991)PNAS 887978-7982。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
在某些实施方案中，重链和轻链的V区结构域可以在同一多肽上表达，通过柔性接头结合，以形成单链Fv片段，并且随后将scFV基因克隆到需要的表达载体或噬菌体基因组中。一般地，如在McCafferty等，Nature(1990)348552-554中描述的，通过柔性(Gly4-Ser)3接头连接的抗体的完整的VH和VL结构域可以用来生产单链抗体，其基于抗原的亲和力可以赋予展示噬菌体可分离的包装。随后可以将分离的与抗原免疫反应的scFV抗体配制到在主题方法中应用的药用制剂中。
按照本领域技术人员已知的方法，例如，包括文库筛选的方法(Ladner，R.C.，等，U.S.专利5,233,409；Ladner，R.C.，等，U.S.专利5,403,484)，可以制备具有对表面蛋白有高亲和力的特异抗体。并且，这些文库的方法可以用在筛选中，以获得结合决定簇，其为抗体的结构决定簇的模拟。例如，参见Baiorath，J.和S.Sheriff，1996，ProteinsStruct.，Funct.，and Genet.24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，″Molecular modeling ofantibody-combining sites，″S.Paul，Ed.，Methods in Molecular Biol.51，Antibody Engineering Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，第17-49页；和Johnson，G，Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，″SeqhuntA program to screenaligned nucleotide and amino acid sequences，″Methods in Molecular Biol.51，op.cit.，第1-15页。
本发明还可以用不是完整抗体的抗-CD2抗体和抗-LFA-3抗体同系物。所述同系物可以衍生于上文描述的抗体同系物的任一种。例如，衍生于上文描述的抗体的抗原结合片段，以及全长单体、二聚体或三聚体多肽本身是有用的。这种类型的有用的抗体同系物包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，在铰链区包括通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)，其由一个VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，是由分开的基因编码的，但是应用重组方法，通过合成的接头可以使它们连接，所述接头能使它们制备成单蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。所述单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”之内。应用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且筛选这些片段在如完整的抗体应用的相同方式中的用途。抗-LFA-3重链是优选的抗-LFA-3抗体片段。
还可以通过化学方法生产抗体片段，例如，通过用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的蛋白酶裂解完整的抗体，并且任选地用还原剂处理裂解的产物。备选地，通过应用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞生产有用的片段。重链和轻链单体的生产可以通过用诸如二硫苏糖醇的还原剂处理完整的抗体，接着进行纯化以分离这些链而实现。重链和轻链单体的生产还可以通过用编码任一条需要的重链或轻链但不是两者的DNA转化的宿主细胞来实现。参见，例如，Ward等，″Binding Activities of a Repertoireof Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli″，Nature，341，第544-46页(1989)；Sastry等，″Cloning of a the ImmunologicalRespertoire inEscherichia colifor Generation of Monoclonal CatalyticAntibodiesConstruction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNALibrary″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，第5728-32页(1989)。
LFA-3和CD-2拟态或小分子试剂还可用于本发明的方法中的是LFA-3和CD-2拟态试剂。这些试剂是CD2LFA-3相互作用的抑制剂，其中所述试剂可以是肽、半肽化合物或非肽化合物(例如，小的有机分子)。优选的CD2和LFA-3拟态试剂将抑制CD2LFA-3相互作用，其抑制作用至少如抗-LFA-3单克隆抗体7A6或抗CD2单克隆抗体TS2/18一样好(前文所述)。
在优选的实施方案中，测试试剂是组合文库的一个成员，例如，肽或有机组合文库，或天然产品文库。在一个优选实施方案中，多个测试化合物，例如文库成员，包括至少10，102，103，104，105，106，107，或108的化合物。在一个优选实施方案中，多个测试化合物，例如文库成员，共有结构或功能特征。
在一个实施方案中，本发明提供LFA-3和/或CD2抑制剂的文库。组合文库的合成在本领域内公知并且已被综述(参见，例如，E.M.Gordon等，J.Med.Chem.(1994)371385-1401；DeWitt，S.H.；Czarnik，A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29114；Armstrong，R.W；Combs，A.P；Tempest，P.A.；Brown，S.D.；Keating，T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29123；Ellman，J.A.Acc.Chem.Res.(1996)29132；Gordon，E.M.；Gallop，M.A.；Patel，D.V.Acc.Chem.Res.(1996)29144；Lowe，G.Chem.Soc.Rev.(1995)309，Blondelle等.Trends Anal.Chem.(1995)1483；Chen等.J.Am.Chem.Soc.(1994)1162661；U.S.专利5,359,115，5,362,899，和5,288,514；PCT公布Nos.WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
本发明的化合物的文库可以按照各种方法制备，其中的一些是本领域已知的。例如，“裂解池(split-pool)”策略可以按下述方法实施将官能化多聚体支持物的珠粒(beads)放入多个反应容器中；已知适用于固相肽合成的多种多聚体支持物，并且一些可商购(参见，例如，M.Bodansky″Principles of Peptides Synthesis″，第二版，Springer-Verlag，柏林(1993))。将不同的活化氨基酸溶液添加到珠粒的每一份等分试样中，并且允许反应进行，以产生多种固定的氨基酸，每个反应容器中一种。然后洗涤衍生出的珠粒的等分试样，“混合(pooled)”(即，重新结合)，并且将珠粒库再划分，将每一份等分试样放入分离的反应容器中。然后将另一种活化的氨基酸添加到珠粒的每一份等分试样中。重复合成的循环，直到获得需要的肽长度。可以随机选择在每一个合成循环中所添加的氨基酸残基；备选地，可以选择氨基酸以提供“偏好(biased)”文库，例如，这样的文库其中抑制剂的某些部分是非随机选择的，例如，以提供与能够与抗体相互作用的已知肽具有已知的结构相似性或同源性的抑制剂，例如，抗-特应抗体抗原结合位点。应该理解按这种方法可以容易地产生广泛种类的肽的、拟肽的、或非肽的化合物。
“裂解池”策略导致形成肽文库，例如，抑制剂，其可以用于制备本发明的测试化合物的文库。在另一个示例性合成中，通过Hobbs DeWitt等的方法制成了“多样性文库(diversomer library)”(Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.906909(1993))。其它的合成方法，包括Houghten“茶标记(tea-tag)”技术(参见，例如，Houghten等.Nature35484-86(1991))，也可以用于合成按照本发明目的的化合物的文库。
可以筛选化合物文库以确定是否所述文库的任一成员都具有需要的活性，并且，如果这样，要鉴定活性种类。已经描述了筛选组合文库的方法(参见，例如，Gordon等.J Med.Chem.，如前所述)。可以通过使用适当受体的亲和层析筛选可溶的化合物文库，以分离受体的配体，接着通过常规技术鉴定分离出来的配体(例如，质谱、NMR等)。可以通过将所述化合物与可溶的受体接触来筛选固定的化合物；优选地，将可溶的受体与可以检测的标记(例如，荧光团，比色分析酶，放射性同位素、发光化合物等)偶联，以指示配体结合。备选地，可以选择性地释放固定的化合物并允许其扩散通过膜以与受体相互作用。下文描述用于本发明的文库筛选的示例性测定法。
在一个实施方案中，可以筛选本发明的化合物与CD2或LFA-3多肽相互作用的能力，其通过测定每一种化合物直接结合所述多肽或抑制CD2LFA-3相互作用的活性，例如，通过将测试化合物与CD2或LFA-3多肽和溶解产物，例如T或APC细胞溶解产物，例如在诸如标准96-孔微量培养板的多孔培养板的一孔中进行温育。在这一实施方案中，可以确定每种单独的化合物的活性。没有测试化合物的一孔或多孔可以用作对照。温育后，通过测定每一个孔可以确定每种测试化合物的活性。因此，可以平行确定多种测试化合物的活性。
在另一个实施方案中，可以同时测定许多测试化合物的结合活性。例如，在“一珠-一化合物(one bead-one compound)”合成中，可以在固体树脂珠粒上合成测试化合物；可以将所述化合物通过光不稳定接头(photolabile linker)固定在树脂支持物上。然后可以将多个珠粒(例如，多达100,000个珠粒或更多)与酵母菌细胞结合并且将其喷雾形成多个“毫微滴(nano-droplets)”，其中每个毫微滴包含单个珠粒(并且，因此，单个测试化合物)。然后将所述毫微滴暴露于UV光线导致化合物从珠粒上分裂开。应该理解这种测定方式允许以快速方式筛选测试化合物的大文库。
化合物的组合文库可以用“标签(tags)”合成，以编码文库的每一成员的身份(identity)(参见，例如W.C.Still等，U.S.专利No.5,565,324和PCT公布Nos.WO 94/08051和WO95/28640)。一般地，这种方法着重描述惰性但易于检测的附着到固体支持物或化合物上的标签的应用。当检测到活性化合物时(例如，通过上文所描述的技术之一)，通过独特伴随标签的鉴别确定所述化合物的身份。这种标签方法允许合成可以在很低水平识别的化合物的大文库。这种标签方案可以用于，例如，在上文所描述的“毫微滴”筛选测定中，鉴别从珠粒释放的化合物。
在优选实施方案中，本发明的化合物文库含有至少30种化合物，更优选地至少100种化合物，和更优选地至少500种化合物。在优选实施方案中，本发明的化合物文库含有少于109种化合物，更优选地少于108种化合物，和更优选地少于107种化合物。
衍生的抑制剂CD2LFA-3相互作用的衍生的抑制剂也可用于本发明的方法，其中，例如，本文所描述的任何抗体同系物、可溶的CD2和LFA-3多肽、或CD2和LFA-3模拟试剂，其官能化结合到(通过化学偶联、遗传融合或其它方法)一个或多个独立地选自由下列物质组成的组的成员上抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物、可溶的LFA-3和CD2多肽、CD2和LFA-3模拟试剂、细胞毒素试剂以及药用试剂。
一种类型的衍生抑制剂通过将2个或多个抑制剂(相同类型的或不同类型的)交联而生产。适当的交联剂包括那些具有2个不同的由适当的间隔基(例如m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分开的反应基的异双功能试剂(heterobifunctional)或那些同双功能试剂(homobifunctional)(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)。所述连接剂可从Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois获得。
对于交联的另一种可能是利用在PI-连接的LFA-3或其片段中的PI键合信号序列。具体地，将编码PI键合信号序列(例如，SEQ ID NO4的氨基酸162-212)的DNA连接到编码需要的多肽优选可溶的LFA-3多肽的DNA的下游。如果将这一构建体在适当的真核细胞中表达，细胞将识别所述PI键合信号序列，并将共价连接PI到多肽上。然后可以利用PI的疏水性形成多肽的胶束聚集体(micellar aggregates)。
还可以用连接到1种或多种细胞毒性或药用试剂上的抑制剂。有用的药用试剂包括生物活性肽、多肽和蛋白，诸如对除了CD2或LFA-3、或其片段的人多肽特异的抗体同系物。有用的药用试剂和细胞毒性试剂还包括UV辐射(例如UVB)、环孢素A、泼你松、FK506、甲氨蝶呤、类固醇类、类视色素类、干扰素，以及氮芥。
用药用试剂衍生化的优选的抑制剂包括重组生产的多肽，其中将可溶的LFA-3多肽、可溶的CD2多肽、或肽基CD2或肽基LFA-3模拟试剂融合到免疫球蛋白重链铰链区的全部或部分或者重链恒定区的全部或部分。用于制备所述融合蛋白的优选的多肽是可溶的LFA-3多肽。最优选的是这样的融合蛋白，其含有融合到人IgG1铰链区的一部分上的成熟LFA-3的氨基酸1-92(包括铰链区的C端10个氨基酸，所述铰链区含有被认为参与链间二硫键的2个半胱氨酸残基)，和IgG1重链恒定域的CH2和CH3区。期望这样的融合蛋白表现出延长的血清半衰期并能够使抑制剂二聚体化。
通过测定它们抑制LFA-3/CD2相互作用的能力，可以容易地确定特异的可溶CD2多肽、可溶LFA-3多肽、抗-LFA-3抗体同系物、抗-CD2抗体同系物或者CD2和LFA-3模拟试剂在本发明的方法中的效用。这一能力可以，例如，应用简单的细胞结合测定法进行测定，所述细胞结合测定法允许假定的抑制剂在携带这些分子的细胞上抑制LFA-3和CD2之间的相互作用的能力的可见(在放大下)评估。Jurkat细胞优选作为CD2+底物，和绵羊红血细胞或人JY细胞优选作为LFA-3+底物。用于本发明的可溶多肽、抗体同系物和模拟试剂的结合特征可以通过一些已知的方法进行测定，诸如通过将抗体同系物、多肽或试剂放射性标记(例如，用35S或125I)，然后适当地将标记的多肽、模拟试剂或抗体同系物与CD2+和LFA-3+细胞接触。还可以应用适当的酶促标记二次抗体测定结合特征。还可以应用诸如Seed等描述的玫瑰花结竞争测定法(rosetting competitionassays)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，第3365-69页(1987))。
组合治疗所述药剂，例如可溶的CD2结合LFA-3多肽，可以用在与其它治疗，例如其它药剂的组合中。其它药剂在此处称为“第二药剂”或“附加药剂”，并且包含1种或多种的免疫抑制剂(例如，甲氨喋呤、环胞素、或苯丁酸氮芥)、环磷酰胺、泼你松、FK506、类固醇类、类视色素类、干扰素、氮芥、细胞因子结合试剂(例如，2型细胞因子结合试剂，例如，IL-2或IL-8结合试剂，例如，抗IL-2或IL-8单克隆抗体(Abgenix))、ICAM/LFA-1相互作用的抑制剂、例如抗ICAM-1(例如，人源化的、嵌合的、或人抗-ICAM-1抗体)的ICAM-结合试剂(例如，抗体，例如，单克隆抗体)；或抗LFA-1(例如，人源化的、嵌合的、或人抗-LFA-1抗体，例如，Raptiva(Genentech/Xoma))的LFA-1(也已知为CDlla)结合试剂(例如，抗体，例如，单克隆抗体)；共刺激分子结合试剂，例如B7-1(CD80)结合试剂(抗B7-1单克隆抗体(IDEC))；血管舒张剂(例如，ACE抑制剂或米诺地尔)；皮质甾类或青霉胺。在一个实施方案中，将试剂，例如CD2LFA-3相互作用的抑制剂，与1种或多种白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β、PDGF、粒酶A或白三烯B4抑制剂组合施用。这样的组合治疗可以有利地利用更低剂量的治疗或预防药剂。
“组合”施用，如此处所用，意指在受试者经受所述疾病的折磨的过程中对受试者给予两种(或更多)不同的治疗，例如，在受试者确诊患有所述疾病后并且在疾病尚未治愈或消除前，给予两种或更多的治疗。在一些实施方案中，在第二种治疗的给予开始时，一种治疗的给予还在发生，以致存在交迭。这在本文中有时称为“同时”或“并发给予”。在其它实施方案中，在另一治疗开始前停止一种治疗的给予。在另一情形的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更加有效。例如，第二种治疗更加有效，例如，使用更少的第二种治疗看到等同的效果，或第二种治疗更大程度地减少症状，大于如果在没有第一种治疗存在时施用第二种治疗将见到的效果，或用第一种治疗见到的类似情况。在一些实施方案中，这样给予导致的症状、或与疾病相关的其它参量的减少，例如，在T细胞水平或活性中的减少，大于在没有另一种治疗存在的情况下给予一种治疗可能观察到的减少。两种治疗的效果可以部分地加合、完全加合、或大于加合。给予可以这样，当给予第二种治疗时，给予的第一种治疗的效果还可以检测到，例如，当首先给予CD2-或LFA-3结合药剂时，在给予第二种药剂时还可以检测到在T细胞水平或活性中的减少。在优选实施方案中，第一种治疗和第二种治疗的给予发生在彼此的1，2，5，10，15，或30天内。
在优选实施方案中，全身性施用CD2-结合药剂(例如，LFA-3/Ig融合体)、第二种药剂(或两者)或含有其的药用组合物，例如，静脉内地、肌内地、皮下地、关节内地、经皮地、鞘内地、骨膜地、肿瘤内地、损害内地、损害周围地、通过灌输(例如，使用灌输装置)、口服地、局部地或通过吸入施用。优选地，肌内或静脉内地施用CD2-结合药剂。在其它实施方案中，对受影响的区域局部施用CD2-结合药剂，例如，局部地或通过无针注射(needleless injection)。
使用有针或无针注射器通过本领域已知的方法可以实施CD2-结合药剂(例如，LFA-3/Ig融合体)、第二种药剂(或两者)或含有其的药用组合物的肠胃外施用。在US 6,132,395，US 6,096,002，US 5,993,412，US5,893,397，US 5,520,639，US 5,503,627，US 5,399,163，US 5,383,851，US5,312,577，US 5,312,335中描述了无针注射器系统的实例和施用模式，所有这些的内容通过参考结合于此。
药用组合物优选地，施用有效量的CD2LFA-3抑制剂(例如，本文所描述的可溶的、CD2-结合LFA-3多肽)。“有效量”意指能够减轻本文所描述的疾病的扩散或严重性的量。在治疗实施方案中，所述药剂的有效量是指在给受试者单一或多剂量施用时有效地抑制、减轻、或改善所述疾病(例如，提高银屑病患者的PASI记分或PGA记分)，或者有效地延长患有所述疾病的患者超出在没有这样的治疗存在时所期望的寿命的药剂的量。例如，预计银屑病的改善将导致生命质量的提高，例如，如通过RANDCorporation(Santa Monica，加利福尼亚州)的一个部门RAND Health开展的SF-36健康调查表所评估的那样。有效量的剂量不必定指示疾病的完全消除。在预防实施方案中，本文所描述的CD2-或LFA-3结合药剂的有效量指在给受试者单一或多剂量施用时有效地预防或延缓发作的发生或疾病的复发的药剂的量。
本领域的技术人员应该明白药剂的有效量将取决于，除其它事物外，所治疗的疾病(例如，T细胞介导的皮肤疾病对T细胞介导的除皮肤疾病外的器官疾病)、给药计划、施用的单位剂量、药剂是否与其它治疗药剂组合施用、患者的免疫状况和健康、施用的具体药剂的治疗或预防活性以及血清的半衰期。取决于要治疗的疾病，所述药剂可以不同地包装。
优选地，可溶的、CD2-结合LFA-3多肽(例如，LFA3TIP)以约0.001-约50mg药剂每kg体重，更优选地，约0.01-约10mg药剂每kg体重，最优选地，约0.1-约4mg药剂每kg体重的剂量施用。在优选实施方案中，可溶的、CD2-结合LFA-3多肽在通过IV途径施用时以2-15mg的单位剂量(例如，7.5mg IV推注)，和在通过IM途径施用时以2-30mg的剂量(例如，10mg或15mg IM注射)施用。优选IM和IV施用。
单位剂量典型地施用直到观察到效果。所述效果可以通过各种方法测量，包括体外T细胞活性测定法和受影响的皮肤区域的清除或改善，或在其它可能与具体疾病相关的受影响的身体区域的改善。优选地，在治疗周期过程中，定期施用单位剂量，诸如每周一次。更优选地，它被定期施用，例如，对于几周的施用周期，例如12周，以每周的时间间隔。如果受试者的疾病严重或如果显示出紧急介入，还设想了更加频繁的施用，例如，每周2次或3次，并且可能是适合的。如果受试者对治疗反应良好以致适合维持剂量，还设想了更不频繁的施用，例如，每月1次或2次，并且可以采用。然而，应该认识到，在施用的任何一个具体周期期间，可以应用更低或更高的剂量和其它给药计划。
所述药剂，例如，CD2-结合LFA-3多肽(例如，AMEVIVE)，还优选地以包含药用载体的组合物的形式施用。“药用载体”意指在施用其的患者中不引起过敏反应或其它不适当的效果的载体。
合适的药用载体包括，例如，水、盐、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、以及其组合的一种或多种。药用载体还可以包括少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增加药剂的保藏期或效力。
CD2-结合药剂的制剂，例如药用制剂，可以制备成水相或非水相形式，例如冻干的形式。优选的药用制剂适合用于注射。本发明包括的水相制剂的实例包括磷酸缓冲盐水(PBS)冷冻的液态制剂。冻干制剂的实例包括一种或多种的柠檬酸、甘氨酸和蔗糖。例如，一种优选的冻干制剂包括1-5％的蔗糖，优选地2.5％的蔗糖，和0.5％-2％的甘氨酸，优选地1％的甘氨酸，在柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(至少10mM，优选25mM)中，其缓冲到至少约4，优选地5，更加优选地约6(或者甚至更加优选地，6.8)的pH值。
第二种药剂可以与CD2-结合药剂以单一剂量形式(即，作为同一药用组合物的一部分)、与CD2-结合药剂分离但同时施用的多剂量形式、或者其中两种成分独立地并且顺序施用的多剂量形式施用。备选地，CD2-结合药剂和其它活性药剂可以以单一的缀合分子的形式。两种成分的偶联可以通过本领域公知的标准交联技术实现。单一分子还可以采取重组融合蛋白的形式。另外，用于本发明的药用组合物可以用于和其它治疗的组合中，诸如PUVA、化学治疗和UV光线。这样的组合治疗可以有利地利用更低剂量的治疗或预防药剂。
CD2-结合药剂，或药用组合物，可以是各种形式。这些形式包括，例如，固体、半固体和液体剂量形式，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液、扩散液或混悬液、脂质体、栓剂、注射液、输注液(infusible)、和局部制剂。优选的形式取决于施用和治疗应用需要的模式。优选形式为注射或输注液溶液。
本发明包括适于用作局部应用的防晒剂或UV防护剂的制剂。优选实施方案包括AMEVIVE制剂。活性组分可以配制成脂质体。所述产品可以在UV曝晒之前、之中、或之后，或者在发红(redness)发展之前、之中、或之后应用。
序列下列是在US 6,162,432中描述的和贯穿本申请所涉及的序列的总结SEQ ID NO1跨膜LFA-3的DNA序列SEQ ID NO2跨膜LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO3PI连接的LFA-3的DNA序列SEQ ID NO4PI连接的LFA-3的氨基酸序列SEQ ID NO5CD2的DNA序列SEQ ID NO6CD2的氨基酸序列SEQ ID NO7AMEVIVE的DNA序列SEQ ID NO8AMEVIVE的氨基酸序列实施例实施例1使用AMEVIVE_(alefacept)对银屑病的多疗程治疗本实施例检验在接受使用AMEVIVE_长达4.5年的达9个治疗周期的多疗程治疗的患者中的功效和安全性。
治疗在公开标记(open-label)研究中的初始治疗周期称为周期A。后续周期标记为周期B，C，D，等。在每一周期中，患者接受每周一次的治疗达12周(给药期)，接着是12周的观察(休息期)。
通过静脉(IV)推注注射施用7.5mg AMEVIVE。
在延伸研究的起始治疗前，基于医生对疾病严重性的评估，以及CD4+T细胞计数处于或高于正常的下限(LLN；404个细胞/mm3)，建立全身性治疗的需要。
对于后续周期的合格性是基于前述的标准，以及，另外在前一周期的12周的治疗期间，患者必须已经接受≥8剂量的AMEVIVE，以及对于周期C和后续周期，淋巴细胞计数要求≥75％的在本研究的检诊随访(screening visit)所记录的计数。
在任何给出的周期内，如果患者具有CD4+T细胞计数＜300但是＞200个细胞/mm3，将AMEVIVE的剂量减少50％(3.75mg)。如果CD4+T细胞计数＜200个细胞/mm3，保持计划的剂量。如果CD4+T细胞计数＜200个细胞/mm3持续4个连续的随访，持久地保持AMEVIVE。当看到临床显著感染的迹象时，保持AMEVIVE的剂量2周。
评估通过银屑病面积和严重性指数(PASI)以及通过医生综合评估(PGA)评估功效。对于周期A，在治疗期间的1，3，5，7，9，11，和12周以及在治疗后的2，4，6，8，和12周进行评估。对于后续周期，在治疗期间的1和7周以及在治疗后的2和12周进行评估。报道在PASI方面相对于基线获得≥50％和≥75％的改善(分别地，PASI 50和PASI 75)的患者以及获得“清楚(clear)”或“几乎清楚”的PGA的患者的比例。
在每个研究随访，除了在周期A的治疗后的4周和在全部后续周期的治疗后的4和8周之外，实行全部淋巴细胞和淋巴细胞亚型的分析。在全部随访监测患有新的或正在发生的病毒、细菌、或真菌感染的患者。贯穿本研究整个过程监测不利事件。
结果在这一分析时，患者已经接受使用AMEVIVE长达4.5年的重复周期的治疗。在本研究中，175名患者已经接受≥1个周期的AMEVIVE；126名接受≥2个周期；96名接受≥3个周期；71名接受≥4个周期。作为在前面的2期研究中暴露于AMEVIVE的结果，一些患者已经接受多达9个周期的AMEVIVE。
功效图2中显示在周期A-D治疗后2或12周获得PASI 50的患者的比例。与周期A和B相比，周期C和D的应答率显著地增加。在周期A、B、C、和D中，获得PASI 75的患者比例分别为29％、33％、34％、和52％。对于“清楚”或“几乎清楚”的PGA对应的应答率分别为24％、29％、33％、和34％。
对于周期A-D，图3中显示使用AMEVIVE的附加治疗周期的递增受益(incremental benefit)和重复应答。对于接受AMEVIVE附加周期的周期A应答者(即，在周期A中获得PASI 50的患者)，获得PASI 50的患者比例随着每一后续周期而增加。一般地，患者继续应答使用AMEVIVE的重复治疗，而没有快速减敏性(tachyphylaxis)的迹象。在给出的周期中获得PASI 50的那些患者中，75％-90％的患者在后续周期(即，重复应答)中获得PASI 50。
不利事件一般地，不利事件的发生率在周期中没有改变很多。随着多周期(多疗程治疗)的施用，AMEVIVE的全面安全曲线(overall safety profile)与在3期研究中报道的结果相似。在任何周期中，严重不利事件的发生率为7％或更少，并且严重不利事件的谱图与先前的2和3期研究相似。
由于不利事件，在周期A和B的每个周期中的2名患者和周期E中的1名患者停止了治疗。毒性的发生率低在任何周期中3％或更少；大多数为皮肤癌。
无治疗(Treatment-Free)应答的持续时间在3期研究中，用保持PASI 50应答持续中值为7个月的患者证明了AMEVIVE的减缓作用。在这一实例中，一些患者已被跟踪持续成功治疗周期后的延长期间。图4显示在4名这样的患者中应答时间的最大长度。在一些患者中，对使用AMEVIVE的治疗的应答保持了18-24个月。
淋巴细胞计数贯穿使用AMEVIVE的多周期治疗，淋巴细胞计数的减少是一致的。随着每个周期观察到的淋巴细胞计数的减少不是累积的。
对于全部周期，CD4+T细胞的平均计数保持在LLN之上，并且不因多疗程暴露于AMEVIVE而减少(图5)。
总之，本研究表明多疗程治疗(3个治疗周期或更多)提供比单疗程治疗更显著的结果，而且没有明显的副作用的附加风险。患者很好地耐受多周期的AMEVIVE，并且贯穿周期不利事件的发生率变化不多。
实施例2使用AMEVIVE对银屑病的多疗程治疗本实施例检验银屑病患者中对使用AMEVIVE第二周期治疗的临床应答以及多周期治疗的功效，其中所述银屑病患者在使用AMEVIVE的第一周期治疗期间没能获得≥50％的银屑病面积和严重度指数(PASI 50)减少或≥25％的减少(PASI 25)。
患者患者≥16岁，并且患有慢性蚀斑银屑病的时间≥12个月，其涉及≥10％的体表面积。CD4+T细胞计数要求高于正常的下限(LLN)。在使用AMEVIVE治疗前4周内并贯穿整个研究过程，禁止使用光线疗法、全身性类视色素、全身性皮质甾类、全身性富马酸盐、免疫抑制(甲氨蝶呤、环胞菌素、硫唑嘌呤、和硫鸟嘌呤)、以及高效的局部皮质甾类。在使用AMEVIVE治疗前2周内并贯穿整个研究过程，除了在头皮、手掌、腹股沟和足底以外，禁止使用中效的局部皮质甾类、局部类视色素、煤焦油、角质层分离剂、以及维生素D类似物。为了合格地参与本延伸研究中，要求患者已经接受≥8剂量的AMEVIVE，并且完成前一治疗周期的最终随访(follow-up visit)。如果他们参与任何其它的药物或非药物治疗的调查性研究，或者在前一周期8周前开始备选的全身性银屑病治疗、光线疗法、或其它禁止的治疗，这些患者被排除在本延伸研究之外。
治疗3期研究是多中心的、随机化的、双盲的和安慰剂对照的(Krueger等，J.Am.Acad.Dermatol.47821-833，2002；Lebwohl等，Arch.Dermatol.139719-727，2003)。在使用AMEVIVE的静脉内(IV)治疗的3期研究中，患者接受2个周期的治疗，其中每个周期由下列阶段组成(i)12周的给药期，每周一次AMEVIVE(7.5mg)或安慰剂，和(ii)12周随访(follow-up)(休息期)。在使用AMEVIVE的肌内(IM)治疗的3期研究中，患者接受单周期的治疗，其由12周的给药期接着12周的观察期(休息期)组成，在给药期内每周一次AMEVIVE(10mg或15mg)或安慰剂。
在多疗程治疗的研究中，接受使用AMEVIVE的附加周期的治疗(相同的剂量方案)的患者是那些研究者确定其疾病已经进展到需要全身性治疗或光线治疗，并且具有处于或高于LLN的循环CD4+T细胞计数的患者(Gordon等，J.Drugs Dermatol.2624-628，2003)。
评估在3期研究期间，在基线处评估PASI和医生综合评估(PGA)，在治疗期间每隔2周1次，和在随访期间每隔2-4周1次。还在IV多疗程研究期间的一些时间点评估PASI和PGA，但是在IM多疗程研究期间只评估PGA。
分析应用来自使用AMEVIVE的IV治疗的2周期3期研究的数据来确定2组患者中使用AMEVIVE的治疗的第二周期的功效(a)在第一周期中没能获得PASI 50的那些患者和(b)在第一周期中没能获得PASI 25的那些患者。确定在使用AMEVIVE的治疗的周期1期间没能获得PASI 50和PASI 25的患者在治疗的第二周期期间的任何时间获得PASI 50或PASI减少≥75(PASI 75)的患者比例。计算出可能性比率和对应95％的置信区间(CIs)来比较在接受使用AMEVIVE的治疗的第二个周期的患者和接受安慰剂的患者之间的应答率。还确定了在IV治疗的每一个周期期间的任何时间获得PASI 50、PASI 75和“清楚”或“几乎清楚”的PGA的患者比例，和在IM治疗的每一个周期期间的任何时间获得“清楚”或“几乎清楚”的PGA的患者比例。
结果患者的平均年龄～45岁，并且～70％为男性。银屑病的持续时间为～19年，并且涉及的平均体表面积为～22％。表1中总结了接受使用AMEVIVE的IV和IM治疗的每一个周期的患者人数。
表1接受AMEVIVE的多周期的患者人数。
在先前没能获得PASI 50或PASI 75的患者中第二治疗周期的功效在使用AMEVIVE的IV治疗的第二周期期间，在第一周期期间没能获得PASI 50的患者中的93％的患者和在第一周期期间没能获得PASI 25的患者中的89％的患者中观察到PASI的改善。在第二周期内使用AMEVIVE治疗导致比安慰剂治疗有显著更高的比例的患者获得PASI 50和PASI 75(表2)。在使用AMEVIVE治疗的初始周期期间没能获得PASI50的患者中有19％的患者在第二周期期间获得PASI 75，和53％获得PASI50。在使用AMEVIVE治疗的初始周期期间没能获得PASI 25的患者中有14％的患者在第二周期期间获得PASI 75，和47％获得PASI 50(表2)。可能性比率表明，与没有接受另一周期的患者相比，在周期1中没能获得PASI 50或PASI 25的患者有2-3倍更大的可能在周期2中获得PASI 50或PASI 75(表2)。
表2在第一周期期间没能获得PASI 50或PASI 25的患者中在AMEVIVE的第二周期期间的任何时间的PASI改善。
多疗程治疗的功效在每一个后续治疗周期期间，接受使用AMEVIVE的多周期IV治疗的患者表现出在PASI方面的递增的改善。获得PASI 75的患者比例从周期1期间的29％增加到周期5期间的最大值54％(图6A)。同样地，获得PASI 50的患者比例从周期1期间的56％增加到周期5期间的最大值74％(图6B)。
PGA结果进一步支持在银屑病使用AMEVIVE的多周期治疗中观察到的递增的临床改善。在使用AMEVIVE的IV治疗的周期1期间，23％的患者具有“清楚”或“几乎清楚”的PGA。在周期5期间，44％的患者获得这一水平的应答(图7A)。对于使用AMEVIVE的IM治疗，PGA“清楚”/“几乎清楚”应答率从周期1期间的21％增加到周期4期间的最大值41％(图7B)。
总之，随着使用AMEVIVE的连续周期的治疗看到递增的临床改善，这表明其对于患有慢性蚀斑银屑病的患者的长期治疗的功效。多疗程治疗的数据表明，不管对初始治疗的应答，患者对使用AMEVIVE的附加治疗的应答是递增受益的。
权利要求
1.一种治疗患有银屑病的受试者的方法，该方法包括对所述受试者施行可溶的CD2-结合LFA-3多肽的多疗程治疗，其中所述多疗程包括多个治疗周期，以及其中所述每个周期包括1个给药期和1个休息期。
2.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽是LFA-3融合蛋白。
3.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽是LFA-3/免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。
4.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽包括与Ig重链铰链区的全部或部分以及重链恒定区的全部或部分融合的可溶的LFA-3多肽。
5.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽包括由成熟LFA-3的N端92个氨基酸、人IgG1铰链区的C端10个氨基酸、人IgG1重链的CH2区、以及至少部分的人IgG1重链的CH3区组成的融合蛋白。
6.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽为AMEVIVE(图1)。
7.权利要求1的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽由包含在质粒pSAB152中的插入片段所编码，质粒pSAB152保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 68720。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程包括至少4个治疗周期。
9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程包括至少5个治疗周期。
10.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程包括至少6个治疗周期。
11.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程包括至少7个治疗周期。
12.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程包括至少8个治疗周期。
13.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的每个连续周期的休息期长于在多疗程中在先周期的休息期。
14.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的最后周期的休息期是至少2年。
15.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的最后周期的休息期是至少3年。
16.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的每个周期的给药期是至少8周。
17.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的每个周期的给药期是至少10周。
18.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多疗程的每个周期的给药期是至少12周。
19.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多肽被肌内施用。
20.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多肽被静脉内施用。
21.权利要求1-7任一项的方法，其中所述多肽以2-30mg范围内的单位剂量施用。
22.权利要求1-7任一项的方法，其中所述方法还包括在多疗程治疗期间给受试者施用附加的治疗或预防药剂。
23.一种治疗需要治疗银屑病的受试者的方法，该方法包括对受试者施行AMEVIVE(图1)的多疗程的治疗，其中所述多疗程的治疗包括至少3个治疗周期，每一个治疗周期包括AMEVIVE(图1)的每周1次施用并持续12周的给药期，接着是至少12周的休息期。
24.权利要求23的方法，其中所述多疗程的治疗包括至少4个治疗周期。
25.权利要求23的方法，其中所述多疗程的治疗包括至少5个治疗周期。
26.权利要求23的方法，其中所述方法包括在多疗程中每个周期的给药期以及休息期之一或两者期间，关于AMEVIVE(图1)的作用对受试者进行评估。
27.权利要求23的方法，其中所述方法还包括在多疗程治疗期间给受试者施用附加的治疗或预防药剂。
28.一种治疗患有银屑病的患者的方法，该方法包括(a)基于已经具有使用可溶的CD2-结合LFA-3多肽的至少2个治疗周期，选择受试者和(b)给所述受试者施用可溶的CD2-结合LFA-3多肽的第3个治疗周期。
29.权利要求28的方法，其中所述可溶的CD2-结合LFA-3多肽是AMEVIVE(图1)。
30.一种试剂盒，其包括包含AMEVIVE的药用组合物和给早先已经具有使用AMEVIVE(图1)的2个治疗周期的患者施用所述药用组合物的用法说明。
全文摘要
本发明提供治疗皮肤疾病的方法。
文档编号C07K14/705GK1953766SQ200580011939
公开日2007年4月25日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年2月6日
发明者D·马吉勒维 申请人:安斯泰来美国有限公司